基因修饰小鼠构建的革命:CRISPR/Cas9技术

基因修饰小鼠在研究人类疾病致病机理和治疗手段中起到了关键作用。传统的小鼠基因组编辑使用胚胎干细胞(ES细胞),虽然可以对内源基因进行精细的修改,但是复杂、繁琐并且耗时。近几年发展的人工核酸酶可以在靶位点切割DNA双链,诱发细胞内源性修复机制,发生同源重组修复或非同源末端连接,从而提高了基因组编辑的效率。从ZFN到TALEN再到CRISPR/Cas9技术,新型基因组编辑技术正以惊人的速度渗入到生命科学的各项研究工作中。将对新型基因组编辑技术进行介绍,着重阐述CRISPR/Cas9系统介导的基因编辑技术在基因修饰小鼠中的应用,比较该系统与其他方法的优越性和不足,并对该系统进行展望。     

动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的同源重组效率研究进展*

基因组编辑技术可以对DNA或RNA进行精准改造,极大地促进了生命科学的发展。CRISPR/Cas9系统在靶位点诱导DNA发生双链或单链损伤,细胞对损伤部位采用无供体模板的非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或有供体模板的同源重组(homologous recombination,HR)修复。基于HR的基因组编辑策略通常被用于获得DNA的精准改造,而NHEJ在动物DNA损伤修复中起主导作用。为了提升HR效率,研究人员设计了多种方案,包括CRISPR/Cas9系统优化和DNA修复通路调控等。从DNA损伤修复途径、Cas9变体选择、sgRNA设计、供体模板设计、DNA修复途径相关蛋白功能调控、供体模板募集效率提升、细胞周期调控及编辑细胞生存效率提升等方面详细综述了相关研究成果,发现尚未开发出放之四海而皆准的HR提升策略,基于HR的基因组编辑需要针对具体案例制定个体化策略。旨在为动物基因组编辑中提升CRISPR/Cas9介导的HR效率研究提供理论参考,为动物基因功能分析、基因治疗和经济动物基因编辑育种提供帮助。     

主编导读

正本期主编导读主题:碱基编辑、脑细胞芯片、超高通量筛选、微量磷酸化蛋白质富集等技术方法,以及疫苗抗体、多肽药物、治疗用酶、生物材料、生物合成等领域的新进展。1技术方法以CRISPR/Cas9基因编辑系统为代表的基因组编辑技术可以显著提高基因敲除及定点修饰的效率。传统的CRISPR/Cas9技术通过在靶点处产生DNA双链断裂,诱发细胞内的同源重组和非同源末端连接修复途径,进而实现对基因组DNA的定点敲除、替换、插入等修饰。     

CRISPR/Cas9单碱基编辑技术创制抗除草剂拟南芥种质

正CRISPR/Cas9基因编辑系统因其高效、廉价、简单、通用等特点,引发了基因编辑领域的革命.但是,在植物基因组上进行定点突变,依然困难重重.目前的技术路线是,将含有突变的DNA模板通过修复Cas9产生的DNA双链断裂的方式整合到植物基因组中,从而实现目标区域中的点突变.整合机制包括同源末端修复~([1])或非同源末端修复~([2])的两种方式.但是,DNA模板整合到目标区域的效率极低,这是在植物基因组中     

CRISPR基因编辑的脱靶效应应对策略综述

CRISPR/Cas9基因编辑系统是第三代基因编辑技术,在生物医学领域有着广泛的应用。该系统由sgRNA和Cas9蛋白组成,sgRNA与Cas9结合并引导Cas9到达DNA靶点,Cas9作为核酸内切酶对靶序列进行切割,形成DNA双链断裂(double strand break, DSB)。DSB通过两种机制——非同源末端连接(nonhomologous end joining, NHEJ)和同源重组介导的修复(homology-directed repair, HDR)——进行修复,实现特定基因的敲除或插入。与锌指核酸酶(ZFNs)和转录激活因子样效应物核酸酶(TALENs)等基因编辑工具相比,CRISPR/Cas9在简便性、专一性等方面有很大优势,但脱靶效应一直是它在实际应用中面临的一个难题。目前已有许多针对脱靶效应的研究,科学家们已发现一些影响靶点专一性的因素,如sgRNA种子序列、PAM序列、Cas9蛋白、DSB修复通路等,并据此研发出降低脱靶效应的可行性策略。本综述就CRISPR/Cas9系统的作用原理、潜在的脱靶危害和降低脱靶效应的策略研究进行阐述。     

利用CRISPR/Cas9技术构建基因编辑大鼠模型

RNA介导的CRISPR/Cas9基因编辑系统由单链引导RNA(sgRNA)与核酸酶Cas9构成。在细胞内,sgRNA能够按照碱基互补配对的原则引导Cas9与靶点结合,由Cas9切割目标DNA,造成双链DNA断裂(double stranded break, DSB)。在随后的DNA修复过程中,细胞主要进行非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)或在有修复模板存在的情况下进行重组修复(homology directed repair, HDR)。如果将CRISPR/Cas9系统以及修复模板通过显微注射的方式导入大鼠的胚胎内,就能借助细胞的修复机制实现大鼠胚胎的基因编辑,由此构建各种基因修饰大鼠模型。本文详细介绍了利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建大鼠模型的具体操作步骤,以期为相关领域的科研人员提供一种大鼠基因修饰模型的构建方法。     

羊乳"人源化"改造的两大利器——TALEN和CRISPR/Cas9的应用研究进展

羊乳是一种理想的牛乳过敏症患者的替代乳品,TALEN和CRISPR/Cas9基因编辑技术是羊乳"人源化"改造的两大利器,能够与核酸内切酶相结合,特异性识别并结合生物体基因位点,切割DNA双链,导致双链断裂.通过同源重组(homologous recombination,HR)或非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ),可以对哺乳动物乳蛋白基因或其他生物体基因组进行定向精确修饰,具有简单、高效、精准、定向等特点,是近年来一种新兴的生物技术,被广泛应用于基因工程、动植物遗传育种及其他生物医学各领域.但在羊乳"人源化"改造中的应用综述研究尚未见报道,故本文主要对这两种基因编辑技术的基本结构与作用机理、发展历史、羊乳基因编辑研究进展、本课题组研究现状及展望进行综述,以期为相关研究提供参考.     

CRISPR-Cas9研究进展及在基因治疗上的应用

CRISPR-Cas9[Clustered regularly interspaced short palindromic repeats（CRISPR）/CRISPR-associated （Cas）9]是近年兴起的一种高特异性和高效的基因编辑新技术,由向导RNA（single guide RNA,sgRNA）和cas9（CRISPR-associated 9）蛋白组成,引起DNA位点特异性双链断裂（double-strand breaks,DSBs）,引发同源重组修复（homology-directed repair,HDR）或非同源末端连接修复（non-homologous end joining,NHEJ）,达到靶基因修饰的作用。CRISPR-Cas9技术自发现以来,因其便于操作、花费较低、高特异性、可同时打靶任意数量基因等优点而被应用。近年研究显示,对于一些遗传性疾病,可通过CRISPR-Cas9精确的基因编辑破坏致病的内源基因、改正引起疾病的突变体或插入新的保护性基因进行治疗,该技术为基因治疗开启了一个新方向。主要从CRISPR-Cas9结构、作用机制及在疾病基因治疗上的应用等方面进行了综述。     

CRISPR/Cas基因编辑技术及其在作物育种中的应用

CRISPR/Cas基因编辑技术在植物基因功能研究和作物遗传改良方面具有重要应用价值,其主要依赖gRNA引导核酸内切酶在目标基因组位置产生双链断裂（DSBs）,DSBs在通过非同源末端连接（NHEJ）或同源重组（HDR）方式进行修复时,会引起靶标位置核苷酸序列的缺失、插入或者替换,从而实现基因编辑。介绍了CRISPR/Cas基因编辑技术的作用机理及发展趋势,并对CRISPR/Cas技术在主要粮食及经济作物育种中的应用进展进行了总结,以期为农作物育种提供有益的参考。     

CRISPR/Cas9基因编辑技术在致瘤病毒感染研究中的应用

成簇的规律间隔的短回文重复序列及其相关蛋白9〔clustered regularly interspaced short palindromic repeat (CRISPR)/CRISPR-associated protein 9 (Cas9),CRISPR/Cas9〕基因编辑技术的发现源于真细菌和古细菌中CRISPR/Cas系统介导的适应性免疫机制研究。该技术利用特异性向导RNA识别靶点基因,引导核酸内切酶Cas9对其切割,并通过同源重组或非同源末端连接完成对目的DNA的编辑。某些病毒感染机体后,可将其基因组整合到宿主细胞基因组中或潜伏于组织中而无法被彻底清除,从而引起持续性感染。本文参考2013年以来CRISPR/Cas9基因组编辑技术的最新相关研究报道,重点综述其在人类免疫缺陷病毒1型(human immunodeficiency virus type 1,HIV-1)、人乳头瘤病毒(human papillomavirus,HPV )、乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)、 Epstein-Barr病毒(Epstein-Barr virus,EBV)等致瘤病毒感染相关疾病研究中的应用,并概括其作用于这些病毒的有效靶点。     

CRISPR-Cas9基因编辑技术在病毒感染疾病治疗中的应用

CRISPR-Cas9基因编辑技术是基于细菌或古细菌CRISPR介导的获得性免疫系统衍生而来,由一段RNA通过碱基互补配对识别DNA,指导Cas9核酸酶切割识别的双链DNA,诱发同源重组或非同源末端链接,进而实现在目的DNA上进行编辑。病毒通过特异的受体侵染细胞,其基因组在细胞内发生复制、转录、翻译等过程完成其生活周期,某些DNA病毒或逆转录病毒基因组会整合到宿主基因组中。基因治疗是病毒感染疾病治疗的新趋势。因此,基因编辑技术在持续感染的病毒或潜伏感染病毒疾病治疗中具有重大的潜在意义。文章主要从CRISPR-Cas9作用机制以及在病毒感染疾病治疗中的应用等方面进行了综述。     

DNA双链断裂的非同源末端连接修复

细胞内普遍存在的DNA双链断裂(DSB)可通过同源重组(HR)或非同源末端连接(NHEJ)修复。由于HR仅在存在相同染色体作为模板的时候进行,因此,NHEJ通常为主要的修复方式。在NHEJ中,DSB末端首先由Ku识别,接着由核酸酶、聚合酶在Ku与DNA-PKcs协助下加工,并由连接酶IVXRCC4-XLF连接。NHEJ底物类型多样,末端的修复常包含反复加工的过程,导致修复产物通常无法复原损伤前的序列。虽然无法确保准确修复DNA,NHEJ仍对维持基因组的稳定性具有重要的意义。对NHEJ的研究有助于理解癌症的发生机制并将促进癌症的治疗。     

CRISPR相关转座元件的研究及应用进展

CRISPR-Cas的基因编辑能力引发了人们对该系统的研究热潮。除了实现基因的敲除和插入,CRISPR-Cas系统还可以被应用于基因簇重组、单碱基编辑和基因转录调控,推动了生物工程领域的发展。然而,有限的同源重组效率使CRISPR-Cas系统的应用受到了一定的限制。与CRISPR-Cas系统相比,移动遗传元件(mobile genetic elements,MGE)在转座酶的调控下,不需要依赖同源重组即可将指定DNA片段定向插入到细胞染色体中。近几年,人们发现了具有转座机制的CRISPR相关的转座元件,它可以介导DNA靶向整合,同时其出色的重编程能力为该领域的研究带来了新的发展。本文主要介绍近年来CRISPR-Cas系统相关转座元件的研究方向和应用进展,以及人工融合的dCas9-transposase系统的应用策略。文中还提出了CRISPR相关转座元件未来的应用前景和潜在挑战,为基因编辑工具的发展方向提供了参考意见。     

基于CRISPR/Cas系统的DNA碱基编辑研究进展

基于CRISPR/Cas的基因编辑是近年发展起来的一项变革性生物技术。其过程包括在目标DNA位点引入双链断裂(double strand break,DSB)以及其后续的细胞修复。细胞修复DSB主要有两种方式：非同源末端连接(non-homologous end joining,NHEJ)以及同源重组介导的修复(homology-directed repair,HDR)。前者是大多数细胞修复DSB的主要方式,其特点在于修复简单、效率高但极易出错,往往会引发难以预测的核苷酸插入或删除。点突变是自然界中最常见的遗传突变类型,引起了超过半数的人类遗传疾病以及许多重要农艺性状变异。碱基编辑能够实现单个碱基的替换,既不需要引入DSB,又无需修复模板参与,具有高效、编辑结果可控等优点,在基因治疗、作物育种及生物技术研究等方面具有重大的应用潜能。自首个碱基编辑工具开发以来,碱基编辑相关技术得到快速发展及广泛应用。本文综述了目前DNA碱基编辑研究进展,重点阐述了碱基编辑器及其在编辑效率、精度以及特异性提高和编辑范围扩展等方面的最新进展以及仍存在的瓶颈,并展望其研究和应用前景。     

基于CRISPR/Cas9基因编辑技术的人类遗传疾病基因治疗相关研究进展

CRISPR/Cas9系统(常间回文重复序列丛集/常间回文重复序列丛集关联蛋白系统)为靶向基因编辑提供了强大的技术手段.利用序列特异性sgRNA的引导,CRISPR/Cas9系统能够精准地在目标DNA的确切位置导入双链切口.与已有的基因编辑手段相比,该系统具有更优异的简便性、特异性和有效性.目前,大量涉及体内外多物种的CRISPR/Cas9基因编辑研究已充分展示了该技术的巨大潜力,为基于该技术的疾病治疗研究和临床应用带来了希望.基于CRISPR/Cas9基因编辑技术所介导的非同源性末端连接和同源性DNA修复作用,近期多个研究工作已经成功应用该技术修复了包括点突变和基因组缺失等在内的遗传疾病相关基因组缺陷.本综述将总结近期有关利用CRISPR/Cas9基因编辑技术治疗人类遗传性疾病的相关临床前研究进展.     

碱基编辑系统研究最新进展及应用

CRISPR系统能够在基因组DNA中完成精准编辑,但依赖于细胞内的同源重组(Homologydirected recombination,HDR)修复途径,且效率极低。基于CRISPR/Cas9系统开发的碱基编辑技术(Base editing)通过将失去切割活性的核酸酶与不同碱基脱氨基酶融合,构建了两套碱基编辑系统(Baseeditors,BE):胞嘧啶碱基编辑器(Cytosine base editor,CBE)和腺嘌呤碱基编辑器(Adenine base editor,ABE)。这两类编辑器分别能够在不产生DNA双链断裂的前提下在基因靶位点完成CT (GA)或AG (TC)的替换,最终实现精准的碱基编辑。目前碱基编辑技术已经广泛应用于基因治疗、动物模型构建、精准动物育种和基因功能分析等领域,为基础和应用研究提供了强大的技术工具。文中概括了碱基编辑技术的研发过程、技术优势、应用现状、存在问题及改进策略,以期为相关领域的科研人员了解和使用碱基编辑系统提供参考。     

原核生物的NHEJ修复途径

DNA双链断裂(DSBs)是严重的DNA损伤形式之一,生物体对DSBs的修复可通过同源重组(HR)或非同源末端连接途径(NHEJ)进行。长期以来,人们普遍认为HR是细菌DSBs修复的惟一途径,但在分支杆菌和其它原核生物体内NHEJ途径的发现,使这一观念得以颠覆。最近的研究表明,细菌NHEJ修复系统是一个双组分系统,包含一个多功能的DNA连接酶(LigD)和DNA末端结合蛋白Ku,具有DSBs修复所需的断裂末段识别、末端加工和连接活性。重点综述细菌NHEJ修复系统的组成、结构以及生理功能。     

基因组编辑技术在植物中的研究进展与应用前景

外源DNA导入细胞并与基因组靶基因发生同源重组可以精确修饰或替换靶基因,但在植物中产生自发同源重组的概率很低.近几年出现的人工改造核酸酶可以大幅提高同源重组的效率,实现基因组的精确、定向改造.其中,归巢核酸酶、锌指核酸酶和TALE核酸酶已在植物基因工程中得到成功应用,最近开发出来的基于CRISPR/Cas系统的基因组编辑技术则更具有高效方便等特点.这些人工核酸酶的应用为植物基因工程的发展呈现了更加美好的前景.首先介绍了基因组编辑技术及其发展历程,随后详细阐述了提高植物基因组定点编辑效率的策略,最后对基因组编辑技术在农业和植物基因工程上的应用进行了展望.