一种改进的异硫氰酸胍法结合硅胶膜离心吸附柱提取孕妇外周血微量胎儿RNA的方法

孕妇外周血中存在胎儿RNA为无创性产前诊断提供了基础.但血液中富含RNA酶和微量胎儿RNA的特点,对从孕妇血浆中提取胎儿RNA带来困难. 我们以ε血红蛋白基因和胎盘特异表达基因4（PLAC4）mRNA作为研究对象,用改进的异硫氰酸胍法结合硅胶膜离心吸附柱法探索孕妇外周血中胎儿微量RNA的提取方法,获得满意效果. 30例孕妇和9例非孕妇外周血样品中总RNA经凝胶电泳测定显示3条带,分别为28S, 18S和 5.8S. 其28S条带亮度为18S亮度的2倍.总RNA质量浓度（A260／A280）为1.97 g/L,光密度比值(A260-A320）/（A280- A 320）为1.86. 30例孕妇外周血样本有7例提取到ε血红蛋白基因mRNA,ε血红蛋白基因 mRNA 的最小浓度为0.537 μg/mL,最大浓度为1.79 μg/mL,ε血红蛋白基因mRNA的浓度中位数为124 μg/mL. 30例孕妇外周血样本提取到PLAC4 基因mRNA,浓度最小值为2.105×103 copies/mL,最大值为12.760×103 copies/mL,而9例非孕妇中均未提取到（P＜0.01）,浓度中位数为6.612×103 copies/mL. 因此,改进的异硫氰酸胍法与硅胶膜离心吸附柱纯化法相结合,可有效抑制RNA降解,用于提取、纯化孕妇血液中微量胎儿RNA.     

非洲菊花瓣总RNA提取方法的改进

利用异硫氰酸胍一步法和植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）提取非洲菊（Gerbera hybrida）花瓣中总RNA时存在多糖的干扰。实验中利用异硫氰酸胍一步法提取总RNA,在RNA沉淀后,再次加入适量变性液,冻融2次,再加热至45 ℃使RNA完全溶解;试剂盒提取时,适当延长各提取步骤的离心时间,并增加DEPC H2O溶解RNA的时间。通过以上操作方法的改进可排除多糖的干扰,得到高质量的总RNA。为进一步利用Northern杂交技术研究非洲菊中花色素苷基因的表达,进行花色改良提供了方便、有效的实验手段。     

非洲菊花瓣RNA提取方法的改进

利用异硫氰酸胍一步法和植物总RNA提取试剂盒（RNeasy Plant Mini Kit）提取非洲菊（Gerbera hybrida）花瓣中总RNA时存在多糖的干扰。实验中利用异硫氰酸胍一步叶提取总RNA,在RNA沉淀后,再次加入适量变性液,冻融2次,再加热至45℃使RNA完全溶解;试剂盒提取时,适当延长各提取步骤的离心时间,并增加DEPC H2O溶解RNA的时间。通过以上操作方法的改进可排除多糖的干扰,得到高质量的总RNA。为进一步利用Northern杂交技术研究非洲菊中花色素苷基因的表达,进行花色改良提供了方便、有效的实验手段。     

烟曲霉的细胞外囊泡蛋白质及RNA分析

目的 分析烟曲霉的细胞外囊泡(extracellular vesicles, EVs)中的重要成分,以进一步明确曲霉致病机制。方法 通过离心法分离烟曲霉的囊泡,用电镜观察形态。采用马尔文纳米颗粒跟踪分析仪分析溶液中EVs的大小分布。通过质谱仪对囊泡内处理后的肽段进行分析。二级质谱数据使用Maxquant (v1.5.2.8)进行检索。检测RNA分布,通过数据库分析烟曲霉EVs中miRNA可能参与的一些通路。结果 电镜下烟曲霉的EVs可见明显的双层脂质结构。NTA发现烟曲霉分析的EVs大小主要集中在130 nm左右。EVs蛋白中不稳定蛋白为9种(15%),其余为稳定蛋白,而等电点(isoelectric point, PI)>7的为6种蛋白。EVs中大部分是胞浆蛋白,其余比较多的是细胞外分泌蛋白,但仍有25%的蛋白不能定位。通过跨膜蛋白预测(transmembrane prediction, TMPred)和糖基磷脂酰肌醇(glycosylphosphatidylinositol, GPI)预测,有5种蛋白存在于双层脂质膜上的蛋白。检测到RNA中rRNA和tRNA分别占59.7%和...     

肠道菌群核酸提取自动化流程的优化

目的:优化肠道菌群核酸提取自动化流程。方法:收集粪便样本,分别采用手工方法、核酸提取工作站提取核酸,然后利用液体工作站制备PCR反应液进行PCR扩增,最后采用文库工作站建库测序。结果:400μl样品用QIAamp~ Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒裂解液裂解后,用MagMAX~(TM) Express 96机器提取核酸的方法与用QIAamp~ Fast DNA Stool Mini Kit试剂盒手工提取核酸的方法相比,测序得到的序列数基本一致,分析结果也没有明显区别;而单独采用MagMAX~(TM)Viral RNA Isolation Kit试剂盒提取核酸由于样品投入体积受限(50μl)、核酸浓度低、测序得到的序列数太少,不能满足后续的分析要求。结论:通过结合使用两种不同的试剂盒,可以实现核酸提取、PCR反应液配制及文库制备的全流程自动化操作,从而大大提高工作效率和结果的稳定性。     

一种从PAXgene全血RNA管内提取基因组DNA的方法

目的:从同一生物样本同步提取RNA和DNA,能提高样本的利用率,而且对于基因组学、转录组学和表观遗传学检测数据之间的比对和匹配分析也十分重要。本研究在不影响RNA样品制备的前提下,建立一种从PAXgene全血RNA管内提取基因组DNA的方法。方法:取一定量PAXgene全血RNA管血液样本,使用QIAamp DNA试剂盒提取血细胞基因组DNA,系统优化提取过程中的离心参数、洗脱量以及初始血液样本量等实验参数,并对提取的基因组DNA质量进行检测。结果:用PAXgene全血RNA管3 mL血液样本能够提取出8.918±1.100μg基因组DNA,紫外分光光度计检测DNA样品的OD 260/280比值为1.89±0.09,琼脂糖凝胶电泳结果显示DNA样品完整无降解。结论:利用本方法提取的DNA样品能够满足下游DNA芯片、DNA甲基化测序等实验要求。该方法有助于从有限的临床血液样本中获取全面的遗传信息,并且提高后续不同实验方法所生成数据之间的可比性和匹配度。     

两种外周血 DNA 提取方法的比较

目的:外周血DNA的提取是研究乙型肝炎病毒相关临床疾病的基础,所提取DNA的质与量直接关乎下游研究的成败,经济、高效、便捷的外周血DNA提取方法对于疾病分子水平的研究尤为重要,本实验旨在比较两种外周血DNA提取方法,从而为临床研究提供有力的参考。方法:以外周抗凝血为试验样本,分别采用改良盐析法和DNA提取试剂盒法(硅胶柱纯化)进行基因组DNA的提取,通过分光光度仪测量DNA浓度和纯度,并进行PCR扩增及电泳实验。比较改良盐析法与试剂盒提取法(硅胶柱纯化)的效果。结果:试剂盒提取法(硅胶柱纯化)标本用量甚微,省时,提取DNA纯度高,步骤繁琐,PCR条带单一、亮度差;改良盐析法操作步骤少,提取DNA浓度高,PCR条带亮度佳、杂带多,耗时长。结论:两组方法各有优缺点,试剂盒提取法(硅胶柱纯化)可靠、快速,但所获DNA量少、极易降解,改良盐析法耗时,但所获DNA浓度高、量多,可根据实验时间与经费,实验所需的DNA纯度与浓度,提供的样本体积等不同的临床研究需求及条件来综合选择适宜的提取方法。     

快速提取棉花蕾期高质量RNA的改良方法

棉花组织中因富含棉酚、多糖和单宁等次生代谢物,RNA难分离,易降解,导致现有RNA快速提取试剂盒提取的棉花RNA产率低、质量差,无法应用于实验操作。针对棉花组织次生代谢物多的特点,以酸酚法为基础,结合RNA吸附柱,通过对幼苗期和蕾期棉花叶片RNA提取,总结出一种快速提取棉花组织RNA的方法。与热硼酸法、酸酚法及试剂盒法相比,所述方法具有步骤少、产率高、质量好等特点,操作简单、整个实验在1h内完成,可开发出提取多糖多酚类生物组织RNA试剂盒。     

蒙古沙冬青总RNA提取与mRNA分离方法的研究

蒙古沙冬青是分布于我国西北荒漠区的常绿旱生阔叶灌木,因其富含多糖和多酚等次生代谢物质,用常规RNA提取方法难以从中获得高质量总RNA.本研究通过在热酚法的RNA提取液中加入高浓度的KAc和β巯基乙醇,从该植物的不同样品中提取到高质量总RNA,并用筛选到的合适试剂盒分离到高纯度的mRNA.所得到的总RNA和mRNA已被成功应用于基因克隆和SMART全长eDNA文库的构建.     

从富含多糖和多酚的柿果中提取具转录活性RNA的方法

通过吸光比值分析 ,反转录实验比较TRIzoL法、Tris 硼酸法、异硫氰酸胍法、市售经典总RNA抽提试剂盒、FlashUNIQ 10柱离心总RNA抽提试剂盒 ,以及改进的CTAB法提取成熟期柿果中的总RNA的可行性 ,结果表明 :改进的CTAB法效果较好 ,柿果中RNA的吸光比值A2 60 A2 3 0 在 1.5～ 2 .0之间 ,A2 60 A2 80 在 1.7～ 1.9之间。采用设定的锚定引物Oligo(dT) 1 2 A分别对提取物进行反转录 ,并结合随机引物进行PCR扩增 ,琼脂糖凝胶电泳 ,结果仅有改进的CTAB法提取的成熟期柿果中的总RNA具有转录活性     

一种快速检测岷江百合总RNA样本中基因组DNA残留的方法

总RNA样本中残留基因组DNA会严重影响qRT-PCR的准确性。为了检测RNA样本中的DNA残留,依据持家基因TIP41-like的部分内含子序列设计了1对基因组DNA残留检测引物:LDRG-F:5'-CTCTTTTATGACGAGGTTGGTA-3'及LDRG-R:5'-CAGGGAAATCGGTCAGTGTT-3'。利用这对引物对3种不同RNA提取试剂盒提取的总RNA样本以及2种不同第1链c DNA合成试剂盒合成的cDNA样本进行PCR扩增检测,能高效快速地检测岷江百合总RNA以及cDNA样本中有无基因组DNA残留。     

玻璃粉吸附核酸及其在植物核酸提取中应用的研究

为研究玻璃粉在植物核酸提取中的应用,比较了玻璃粉颗粒大小、离液盐种类及浓度、pH等条件对玻璃粉吸附核酸的影响,得出玻璃粉吸附核酸的各种最佳条件。结果表明,普通玻璃粉吸附核酸能力强于硅胶和硅藻土,玻璃粉颗粒的直径以83 μm为佳,pH 4.0时吸附效果达到最大。提取DNA时,NaCl浓度应大于3 mol/L,而提取RNA时,异硫氰酸胍大于2 mol/L就能取得很好的效果,此外,在玻璃粉吸附RNA前,需要加入50%以上的无水乙醇才能更好地吸附。利用玻璃粉制作简易纯化柱,可用于植物组织核酸提取纯化,所提取的核酸纯度高、完整性好,可用于酶切、杂交和PCR等实验。与传统方法相比,采用玻璃粉简易离心柱提取植物核酸,效果好、环保、快速、经济。     

卵泡液中细胞外囊泡及其携带的microRNA对卵泡发育的作用

细胞外囊泡(Extracellular vesicles,EVs)是指细胞分泌的双层膜转运囊泡。EVs能从细胞中摄取大分子物质,并将其转移至受体细胞。在这些大分子物质中,研究最多的就是microRNA (miRNA)。miRNA是一种参与基因表达调控的非编码RNA,已证实在哺乳动物卵泡液EVs中有不同的非编码RNA存在,EVs携带miRNA可以作为自分泌和旁分泌的替代机制,影响卵泡发育。文中系统介绍了EVs的种类、特征和分离鉴定方法,重点综述了EVs及携带的miRNA对卵泡发育的作用,包括早期卵泡发育、卵母细胞成熟、卵泡优势化以及对颗粒细胞功能的影响。同时对卵泡液中EVs及其携带的miRNA的未来研究进行了展望,为卵泡液中EVs及携带的miRNA功能的研究及应用提供了思路和方向。     

甲醛固定石蜡包埋组织4种DNA提取方法的比较分析

本研究以10例甲醛固定石蜡包埋组织（FFPET）作为疑难检材,将其制成蜡膜,分别以二甲苯-Chelex100法、脱蜡液-Chelex100法、脱蜡液-Vazyme FastPure FFPE DNA Isolation试剂盒（简称FP试剂盒）、脱蜡液-北京天根石蜡包埋组织基因组提取试剂盒法（简称天根试剂盒）提取DNA,进行紫外分光光度计测定（浓度、纯度）及短串联重复序列（STR）分型检测（23个常染色体）,通过比较分析FFPET在4种不同提取方法中的提取质量、STR分型质量和检出率,从而寻求一种高效简便、经济实用、方便快捷的甲醛固定石蜡包埋组织中DNA提取方法。结果表明：应用4种方法提取的石蜡包埋组织蜡膜DNA经紫外分光光度计测定后显示,应用2种Chelex100法提取的DNA浓度高于2款试剂盒,试剂盒提取的DNA的纯度优于另外2种方法,以上差异均具有统计学意义（P<0.05）;FP试剂盒提取DNA的平均浓度和纯度均优于天根试剂盒,无显著性差异（P>0.05）;STR分型普遍存在不同基因座和同一基因座不同等位基因之间的扩增不均衡,呈现前高后低状态;STR平均检出率为FP试剂...     

五种不同组织结构特点昆虫的总RNA提取效率比较

【目的】比较RNAeasy抽提试剂盒法和Trizol提取法对不同种昆虫总RNA提取的效率,为不同种昆虫总RNA提取方法选择提供参考。【方法】采用RNAeasy抽提试剂盒法和Trizol提取法分别对九香虫Aspongopus chinensis Dallas、白背飞虱Sogatella furcifera Horváth、中华蜜蜂Apis cerana cerana、黄蜻Pantala flavescens和蒿金叶甲Chrysolina aurichalcea进行总RNA提取,通过紫外分光光度计测定总RNA吸光度(OD)值,利用琼脂糖凝胶电泳检测等方式对RNA质量进行评估。【结果】2种提取方法提取不同昆虫总RNA中,Trizol法提取白背飞虱(同翅目)、蒿金叶甲(鞘翅目)和九香虫(半翅目)的总RNA浓度较高,但纯度较低。电泳结果显示总RNA有降解,完整性较差,RNAeasy抽提试剂盒法提取黄蜻(蜻蜓目)和中华蜜蜂(膜翅目)的浓度较低,纯度较高,电泳结果显示完整性较好。【结论】Trizol法更适合提取小型或几丁质含量高的昆虫,RNA抽提试剂盒法更适合几丁质含量较少、腹软且有大量体液的昆虫总RNA提取。     

铁皮石斛花总RNA提取方法的比较研究

为筛选铁皮石斛(Dendrobiumofficinale)花总RNA提取方法,对8种提取方法进行了比较研究,包括改良CTAB-LiCl法(M1)、改良CTAB-异丙醇法(M2)、改良SDS-LiCl法(M3)、改良SDS-异丙醇法(M4)、多糖多酚植物RNA提取试剂盒法(M5)、柱式植物RNAout 2.0试剂盒法(M6)、RNAprep Pure多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法(M7)和Biospin多糖多酚植物总RNA提取试剂盒法(M8)。结果表明,以M4和M5提取的总RNA带型清晰,完整性好,A260 nm/A280 nm为1.8～2.0,A260 nm/A230 nm大于2.0,RNA产率分别为(159.45±1.45)和(170.84±3.53)μg/g。利用M4、M5提取霍山石斛、金钗石斛、鼓槌石斛和美花石斛花的总RNA,样品的完整性、浓度和纯度均符合质量要求。以M4、M5提取的铁皮石斛总RNA为模板,扩增Actin基因片段,扩增产物大小与预期一致且条带单一。这说明M4、M5方法操作简便,结果重复性好,能够较好地提取石斛属植物花的总RNA。     

一种高效提取杨树发病树皮总RNA的方法及应用

对杨树发病树皮总RNA的高效提取是开展杨树抗溃疡病基因表达调控的基础,为了探讨杨树发病树皮RNA的高效提取方法,本研究以欧美杨细菌性溃疡病菌侵染后的‘中林46’杨为材料,比较了包括本研究提出的RNA提取新方法（RNA试剂盒改良法）在内的6种方法提取的总RNA的质量和浓度。结果显示,通过RNA试剂盒改良法提取的总RNA 28S rRNA条带亮度约为18S rRNA条带亮度的2倍且浓度高,表明该方法更适合感染欧美杨细菌性溃疡病的‘中林46’杨发病树皮总RNA的提取。为了验证RNA试剂盒改良法对健康杨树树皮及不同胁迫处理、组织RNA提取的适用性,进一步用该方法提取了‘中林46’杨、‘107’杨、‘北京’杨健康树皮,低氮、低磷处理的毛白杨组培苗以及白玉兰花的总RNA。结果表明,用RNA试剂盒改良法均能获取高质量的总RNA。所提取的总RNA已成功用于感染欧美杨细菌性溃疡病的杨树树皮转录组测序,以及低氮处理的毛白杨组培苗RT-PCR和荧光定量PCR实验,表明用RNA试剂盒改良法提取的总RNA可以用于后续分子实验。     

基因芯片分析技术(二)

(续 2 0 0 0年第 7期第 7页 )3　基因芯片的使用基因芯片块制作好后 ,关键就是用它来完成特殊的实验。其基本原理就是将研究的细胞或组织 RNA加以标记 ,与基因芯片块上所点印的基因片段进行杂交 ,从而探测特定基因的表达。3 .1　准备探针　与传统的 Northern Blot正好相反 ,这里我们将所有表达的 RNA作为探针来源。所以探针的准备工作要包括 RNA的提取和标记。3 .1 .1　 RNA的提取　提取 RNA的方法很多。现在市场上有很多提取 RNA的试剂盒 ,用起来十分方便。不管用什么方法 ,提取 RNA的质量和产量是问题的关键。对于研究基因表达…     

瘤胃微生物RNA提取中样品前处理方法的优化

通过优化瘤胃液前处理方法,提高瘤胃微生物RNA提取数量与质量。试验优化4个前处理条件,共组合形成5个处理组。前处理完成后,利用Trizol进行RNA提取,检测RNA浓度和完整度(RIN)。结果显示,提取瘤胃内容物和瘤胃菌体RNA浓度和完整度的影响没有显著差异(P0.05)。液氮保存的样品提取的RNA浓度和完整度均显著(P0.05)高于RNA保护液保存的样品。解冻处理对RNA浓度的影响无显著差异(P0.05),但是不解冻处理提取的RNA完整度显著高于解冻处理(P0.05)。液氮冷冻研磨提取的RNA浓度(P0.05)显著高于常温研磨,但是对RNA完整度的影响没有显著差异(P0.05)。瘤胃内容物、液氮速冻、不解冻处理结合冷冻研磨方法所提取RNA的RIN值为9.43,完整度最高。瘤胃内容物、液氮速冻、解冻离心收集菌体结合冷冻研磨方法所提取的RNA浓度为1 048 ng/μL,为最高浓度。因此,瘤胃内容物直接液氮速冻并在不解冻条件下冷冻研磨,所提取的RNA效果最好,可用于后续宏转录组学试验。     

慢性阻塞性肺疾病患者支气管肺泡灌洗液细菌宏基因组DNA的制备

【目的】优化稳定期慢性阻塞性肺疾病(chronic obstructive pulmonary diseases,COPD)患者支气管肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fluids,BALF)细菌宏基因组DNA的提取方法,以便于高效提取微量的细菌DNA进行后续的PCR反应和测序。【方法】取稳定期COPD患者的BALF 5mL,离心收集细胞。为了有效提取样品中革兰氏阳性菌的基因组,对QIAGEN的DNA提取试剂盒的操作步骤进行优化:加入裂解缓冲液ATL后首先运用研磨珠和多功能生物样品匀质器破碎菌壁,再加入蛋白酶K孵育,然后加入裂解缓冲液AL振荡混匀。无水乙醇沉淀DNA后,将全部溶液过柱,用洗液AW1和AW2各洗柱一次,最后加50μL洗脱液洗脱DNA。提取的DNA定量后,运用PCR方法检测样本中的细菌16S rDNA量,并按照测序要求构建DNA文库进一步验证。【结果】试剂盒优化法提取的BALF的DNA总量为467.5(135.0-1697.5)ng,明显高于按照传统酚-氯仿法提取的DNA总量95.0(0-612.5)ng,并且所提取的DNA可以很好的扩增细菌的16S rDNA以及构建DNA文库,改良后的扩增产物明显增多(P=0.002)。【结论】使用DNA提取试剂盒结合研磨珠和多功能生物样品匀质器破菌壁的方法能够更高效的提取BALF中微量的宏基因组DNA,为进一步的测序和菌群分析打下基础。