不同组织来源的细胞建立诱导多能干细胞系的研究

目的:比较不同组织来源的细胞生成iPS细胞的效率,获得高效制备iPS细胞的组织类型.方法:通过四种逆转录病毒(OCT4/SOX2/KLF4/c-MYC)转染羊水细胞、绒毛细胞和皮肤成纤维细胞,建立不同组织来源的iPS细胞系.结果:我们建立了羊水、绒毛细胞和皮肤细胞三个不同组织来源的iPS细胞系,并对其多能性基因Oct4、Nanog以及分子表面标记Tra-1.60以及体外分化为三个胚层能力进行鉴定,发现利用羊水细胞建立iPS细胞的效率显著高于绒毛细胞和皮肤细胞.结论:羊水细胞可能是制备iPS细胞的理想细胞类型.     

无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血诱导多能干细胞系的建立

β-地中海贫血患者因无合适的造血干细胞供体来源从而不得不靠输血维持生命。诱导多能干细胞(iPS)技术为获得患者自身遗传背景的干细胞进行临床治疗开拓了新途径。目前,建立iPS细胞系的过程需要使用小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层和动物源的蛋白成分,因此建立的iPS细胞系存在病原体和动物源蛋白污染的可能性,不能应用于临床。采用目前商品化的TeSRTM2和StemAdhereTMDefined Matrix限定培养体系,利用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc 4个转录因子组装在同一表达载体的可切除的慢病毒感染人β-地中海贫血成纤维细胞,建立了5株无饲养层和动物源蛋白的β-地中海贫血iPS细胞系,这些iPS细胞系具有人胚胎干细胞典型的特征,表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog、Tra-1-60等。在体外分化能够形成拟胚体,在体内分化能够形成含有3个胚层类型细胞的畸胎瘤。     

两种细胞来源的21-三体综合征诱导多能干细胞系的建立及比较

21-三体综合征是染色体异常导致的疾病,通过重编程21-三体综合征患儿两种组织来源的细胞成为多能干细胞,比较两种组织来源的细胞建立21-三体综合征诱导多能干细胞（T21-iPSCs）系的效率,为进一步研究21-三体综合征发病机制提供细胞模型,并为选择高效制备T21-iPSCs的组织类型提供理论依据。该实验利用慢病毒介导4种转录因子（Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc）分别诱导人21-三体综合征的羊水细胞和胎儿皮肤成纤维细胞,建立诱导多能干细胞系（Trisomy 21 human amniotic fl uid induced pluripotent stem cells,T21 hAF-iPSCs;Trisomy 21 human dermal fi broblast induced pluripotent stem cells,T21 hDF-iPSCs）,T21 hAF-iPSCs及T21 hDF-iPSCs在蛋白和mRNA水平上均表达人胚胎干细胞的多能性分子标记,如Oct4、Nanog等,具有在体外及体内分化三个胚层的能力,其在培养过程中能维持异常核型并能维持自我更新状态。结果发现,利用羊水细胞建立T21-iPSCs效率高于皮肤成纤维细胞,羊水细胞可能是制备T21-iPSCs的理想细胞类型。     

致心律失常性右室心肌病患者的诱导性多能干细胞系的建立

目的：建立致心律失常性右室心肌病（ARVC）患者特异性的诱导性多能干细胞（iPSCs）,为研究ARVC发病机制提供研究模型。方法：培养来源于ARVC患者皮肤成纤维细胞,并进行突变位点测序鉴定。通过仙台病毒转导入外源性多能转录因子,将ARVC患者皮肤细胞诱导为iPSCs,结合免疫荧光法,实时荧光定量PCR,以及体内外三胚层形成实验对iPS细胞全能型进行鉴定。通过调控Wnt信号通路诱导iPS细胞定向分化为心肌细胞。结果：ARVC患者来源的iPSCs显示碱性磷酸酶阳性,多能性相关基因高表达,胚胎干细胞标志物Oct4,SSEA4,TRA-1-81阳性。体外悬浮培养形成的拟胚体以及体内畸胎瘤形成实验均显示ARVC-iPSCs具有向3个胚层分化能力。经过体外心肌定向,ARVC-iPSC可诱导产生自主节律性搏动细胞团,免疫荧光显示cTnT阳性。结论：本研究使用仙台病毒,建立了无插入型ARVC患者特异的诱导性多能干细胞系,该细胞系具有多能分化特性,并可定向分化为心肌细胞,为研究ARVC的致病因素和药物筛选提供宝贵的实验模型。     

基于CRISPR/Cas9系统构建TIA1基因突变的人诱导多能干细胞系

利用CRISPR/Cas9基因编辑技术构建TIA1-P362L突变的人诱导多能干细胞(iPSCs)系,并使其分化为运动神经元,为研究TIA1突变导致肌萎缩侧索硬化症(ALS)的分子机制及药物筛选提供细胞模型。利用CRISPR在线工具设计sgRNA,将其构建到pX330载体中,扩增左右同源臂并将其构建到供体载体中,接着对该供体载体的靶位点进行突变以获得同源重组的Donor质粒。将sgRNA和Donor质粒同时电转到野生型iPSCs系C11中,经G418抗性筛选获得单克隆,利用PCR和Sanger测序鉴定基因型,采用Western blot鉴定TIA1蛋白表达情况,并用核型分析、免疫荧光染色、定量反转录PCR及拟胚体(EBs)三胚层分化对TIA1-P362L突变的iPSCs系进行多能性鉴定,通过抑制SMAD信号通路诱导iPSCs分化为运动神经元并用特异性抗体验证。该研究成功建立具有TIA1-P362L突变的iPSCs系,该细胞系正常表达TIA1蛋白,具有多能性且能成功分化为运动神经元,对阐明TIA1在ALS疾病中的作用具有重要意义。     

建立小鼠胚胎多能干细胞系（ES细胞系）的几个主要影响因素

本文系统地比较了影响建立小鼠胚胎多能干细胞系的几个主要因素。对825个胚的实验进行了分析,其结果表明:延迟囊胚的主要作用是有助于内细胞团(ICM)的增殖;高糖的DMEM有助于囊胚贴壁及ICM的增殖;不含丙酮酸钠的DMEM对ES细胞的集落形成和生长是有利的;饲养层对ES细胞的建系和培养是十分重要的,以新鲜制备的原代小鼠胚胎成纤维细胞作为饲养层对ES细胞的生长有明显的促进作用。     

ISSR分子标记鉴定巴马香猪

结合线粒体基因和ISSR两种DNA分子标记技术对巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪进行种类鉴定。研究从55条ISSR引物中筛选出1条带型清晰、重复性好的引物53可以鉴别巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪。巴马香猪与藏猪线粒体基因分析结果表明,藏猪具有特异的短串联重复片段"TGTGTACGCA",可用于进一步鉴别巴马香猪与藏猪。ISSR分子标记与聚类分析结果显示,引物53可以鉴别5种猪并成功鉴定了一份未知种类的巴马产猪肉样品。结果表明,ISSR分子标记与线粒体基因联合分析可以快速准确鉴别巴马香猪、环江香猪、藏猪、巴马本地土猪和成华猪。     

诱导多能干细胞技术的优化及其应用前景

诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)是类似胚胎干细胞的一种细胞类型,可以通过对已分化的体细胞进行诱导重编程获得,具有自我更新能力和多潜能性,在体外疾病模型的建立、移植替代治疗、发育学等方面有广阔的应用前景,但致瘤性、转化率低、疾病模型拟合度差等缺点限制着iPS技术在临床和科研上的推广。对近几年诱导多能干细胞技术优化方面取得的新进展进行综述,重点阐述降低致瘤性和提高转化率的几种方法及iPS在临床和科研上的应用前景。     

转基因诱导永生化鸡细胞系的建立

传统上从鸡胚中分离病毒用于疫苗的生产常常不能满足需求,研究从体外培养的细胞中分离病毒的途径成为当前疫苗生产领域的迫切需要。本研究利用体细胞诱导重编程技术建立永生化细胞系,为应用于疫苗制备等研究和生产奠定基础。通过慢病毒载体转染转录调控因子(NANOG, LIN28和C-MYC)重编程鸡成纤维细胞,并稳定培养至100代,获得永生化的细胞,而后逐步去除细胞因子、血清等添加物,优化细胞系培养体系,并对细胞驯化实现悬浮生长,以获得单位体积最大密度的细胞。研究结果表明:通过转基因将NANOG,LIN28和C-MYC 3个因子整合入细胞中表达,细胞系对碱性磷酸酶染色呈阳性反应,端粒逆转录酶(cTERT)基因在细胞系中显著上调,并稳定培养至100代,使得这些细胞具有自我更新特性和永生化的潜能。确定了培养基中的血清替代物KSR浓度为20%,并撤除了培养基中bFGF等生长因子,为细胞大规模培养应用提供了可能。永生细胞实现悬浮生长,细胞生长倍增时间为21.71 h,最大密度为1.3×106 cells/m L。因此,我们通过重编程技术建立了一株稳定的永生化细胞系,并且使它能在低浓度KSR中悬浮培养,这为疫苗制备等研究和生产提供科学依据。     

人诱导多能干细胞分化的心肌细胞电生理鉴定

本文旨在研究人诱导多能干细胞分化的心肌细胞(human induced pluripotent stem cell-derived cardiomyocytes,hiPSC-CMs)的电生理特性。采用时序性短暂激活/短暂抑制Wnt信号通路的方法将未分化的IMR90-4细胞系定向诱导分化为心肌细胞。用免疫荧光染色法和流式细胞术检测心肌肌钙蛋白T(cardiac troponin T,cTnT)蛋白表达,计算hiPSC-CMs的分化率。用膜片钳技术记录hiPSC-CMs的动作电位,根据动作电位的表现对心肌细胞进行分类,并进一步分析电生理特征。结果显示,hiPSC-CMs的纯度大于95%。根据动作电位的表现,hiPSC-CMs可分为心房肌样细胞、心室肌样细胞和窦房结样细胞。其中,心室肌样细胞的动作电位时程(action potential duration,APD)、动作电位幅度(action potential amplitude,APA)和最大去极化速率(dV/dt_(max))均大于心房肌样细胞和窦房结样细胞,窦房结样细胞的d V/dt_(max)低于心室肌样细胞和心房肌样细胞。以上结果表明hiPSC-CMs纯度高,并且分化出的三种不同类型的心肌细胞具有和成熟心肌细胞相似的动作电位特征。     

建立高效表达猪LIF的猪胚胎成纤维细胞系

该文目的是建立高效表达重组猪白血病抑制因子(leukemia inhibitory factor,LIF)的猪胚胎成纤维细胞(porcine embryonic fibroblasts,PEF)系PEF-p LIF,为下一步辅助建立和培养猪nave胚胎干细胞奠定基础。以猪胚胎成纤维细胞的总RNA为模板,利用RT-PCR的方法扩增猪白血病抑制因子基因(LIF),将LIF c DNA连接到真核表达载体p CAGDNA3的启动子下游,构建LIF基因真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;利用核转染的方法将p CAGDNA3-p LIF质粒转入PEF;对转染细胞进行G418筛选,得到稳定高效表达重组猪LIF的PEF-p LIF;利用RT-PCR、Western blot鉴定PEF-p LIF中LIF基因及LIF表达情况;使用PEF-p LIF细胞作为饲养层培养小鼠胚胎干细胞,通过对小鼠胚胎干细胞进行碱性磷酸酶染色及细胞免疫荧光染色,对PEF-p LIF维持干细胞干性功能进行初步验证。实验结果显示,成功构建了真核表达载体p CAGDNA3-p LIF;并将其成功转入PEF中,获得高效表达重组猪LIF的PEF-p LIF;以PEF-p LIF作为饲养层成功培养克隆形态正常的小鼠胚胎干细胞。该研究表明,稳定高效表达重组猪LIF蛋白的猪胚胎成纤维细胞系PEF-p LIF可作为饲养层维持小鼠胚胎干细胞的未分化状态,可为下一步建立及培养猪nave胚胎干细胞提供条件。     

诱导多能干细胞技术的专利保护及价值分析

1已授权iPS细胞专利格局2008年9月,日本专利局通过快速审批程序授权了首个iPS细胞技术专利,并将iPS细胞专利技术实例列入日本专利局(JPO)《审查基准》,以确保日本在本领域的领先地位。此后,美欧等多国专利局相继授权多项iPS细胞专利(表1)。     

猪诱导性多能干细胞技术的研究进展及应用前景

猪作为实验材料,具有由于来源方便、基因序列与人类的相近及其在畜牧业中的重要地位等优势,成为国内外研究的热点,但是猪的胚胎干细胞(Embryonic stem cells,ESC)建系方面的研究进展缓慢。诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSC)技术的诞生,开创了体细胞重编程的全新方法。猪iPSC体系的建立将为家畜ESC体系的建立奠定基础,同时也对提高猪转基因克隆的效率,高效育种和保种,乃至生物医学领域均产生深远的影响。文章综述了iPSC技术的主要进展,重点阐述了猪iPSC技术的现状及其在生物医学和畜牧业中的应用前景,以期为从事该领域研究的科研人员提供参考。     

人诱导多能干细胞分化为心肌细胞关键基因的生物信息学分析

利用生物信息学分析的方法筛选人诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, i PSCs)向心肌细胞分化的关键基因。收集GEO (Gene Expression Omnibus)数据库中关于人i PSCs向心肌细胞分化的高通量测序数据,包含i PSCs向心肌细胞分化的4个阶段的样本数据,分别是未分化的i PSCs (D0)、中胚层细胞(D2)、早期心肌细胞(D7)和心肌细胞(D14)。应用R包分析D0、D2、D7和D14样品之间的差异表达基因,并对差异表达基因进行功能和信号通路分析;构建差异表达基因的蛋白质-蛋白质互作(protein-protein interaction, PPI)网络;应用R包加权基因共表达网络分析(weighted gene co-expression network analysis, WGCNA)对共表达的基因进行聚类,并将其划分为不同的基因模块;使用Cytoscape软件对重要基因模块的互作网络进行可视化和富集分析。结果显示, D0、D2、D7和D14样品之间的差异表达基因总共达917个,基于PPI网络筛选到的前10个基因...     

诱导多能干细胞技术在药物研发领域中的前景

由于基础研究环境和临床环境之间存在的转化差异,使得药物在临床阶段取得成功仍然具有挑战性。诱导多能干(iPS)细胞的诞生为药物研发领域带来了新的希望,使研究者能在体外人性化各种药理学和毒理学模型。人iPS衍生细胞的可获得性,特别是可以定向分化成特定的功能性细胞、组织和器官,一方面为疾病机制研究与细胞治疗提供了全新的途径。另一方面,转化研究中的生物标记物提供了评估临床前基础研究环境和临床环境下毒理学及药理学影响的可衡量的指标,而iPS细胞给生物标记物的研究带来了全新的思路。从转化研究的角度概述了基于iPS细胞药物发现的现行策略,阐明了iPS细胞的潜力以及生物标志物在药物发现和发展整个过程中的作用,突出在该领域有待改进的地方,以期为进一步相关性研究提供一定参考,为新药研发提供新的思路与方法。     

红豆杉高产悬浮细胞系建立及其紫杉醇诱导的研究进展

紫杉醇是一种四环二萜酰胺类化合物,是从红豆杉科红豆杉属植物中提取分离出来的次生代谢物,是世界公认广谱、活性强的天然抗癌新药。但直接从植物中提取紫杉醇的传统生产方式,不仅产量低,且会对野生红豆杉资源造成严重破坏,同时紫杉醇的化学全合成也由于其结构复杂而不具备商业价值。与之相反,细胞培养技术具有受外界影响少、生产成本低、次生代谢产物多、细胞生长周期短的优势,是目前最具前景的紫杉醇生产方式。近年来随着科研水平的不断提升,紫杉醇无论在生理代谢调控、关键基因挖掘,还是新药物制剂与剂型及其类似物的开发和运用等方面,都取得了进展,但要建立紫杉醇商业化高产体系,还必须和前人的研究经验相结合。该文对红豆杉高产悬浮细胞系建立及其紫杉醇诱导的研究进展进行了综述,主要包括前人对红豆杉属植物组织与细胞培养相关的外植体、培养基、激素、培养条件、褐化等问题的研究,以及从代谢调节、培养方式、基因工程等多方面提高紫杉醇含量的最新进展,最后总结了当前研究的不足,并对今后通过多种组合方式来提高紫杉醇含量的生产途径进行了展望。以期促进红豆杉组织培养技术的进步,为药用资源保护和利用提供一定的理论基础与生产指导。     

油松胚珠愈伤组织诱导和悬浮细胞系的建立

雌配子体处于游离核时期的油松胚珠以含不同浓度和配比生长调节剂的培养基诱导产生愈伤组织,并建立了悬浮细胞系.这一悬浮细胞系生长快,分散性好,稳定均一,适用于研究其生理、生化和细胞周期调控.     

油酸诱导小型猪肺水肿模型的建立

目的制备油酸诱导小型猪肺水肿的动物模型,便于进行肺水肿的发病机制和相关治疗的研究。方法家养小型猪20只麻醉后随机分A、B两组,A组（n=10）为对照组,B组（n=10）为油酸组（油酸0.15 mL/kg经动物耳缘静脉缓慢注射）,观察两组动物肺组织病理改变、计算肺含水量及肺湿干重比。结果B组动物注射油酸后肺部出现明显的肺水肿病理改变,肺湿/干重比及肺含水量的值明显高于A组（P〈0.05）。结论本实验成功复制油酸诱导小型猪肺水肿动物模型,其病理组织切片符合肺水肿的典型病变。     

MNNG诱导转化的人胎儿皮肤成纤维细胞系的建立

用甲基硝基亚硝基胍处理正常人胎儿皮肤成纤维细胞４次（剂量前２次为４μｇ／ｍｌ,后２次６μｇ／ｍｌ,每次处理３天,间隔４－６天）,建立了可长期传代的ＨＦＴ８９细胞系。该细胞具有以下转化细胞特性;细胞呈梭形。排列紊具有以下转化细胞特性：细胞呈梭形,排列紊乱,密集时可重叠生长,核畸形明显,核质比大;饱和密度增高;在软琼脂内形成克隆;微丝束减少,紊乱;染色体异倍化;裸小鼠接种成肿瘤。     

层粘连蛋白基因家族在猪多能干细胞中的表达谱分析

层粘连蛋白(Laminin)是细胞外基质的重要成分,对细胞生长、分化、运动、组织修复和再生等发挥重要调节作用。Laminin包括有A1-5、B1-4和C1-3共12个编码基因,以不同的表达模式发挥功能。其中Laminin A5作为可以支持多能细胞生长的重要基因,得到广泛研究。但是,在所有猪相关数据库中,均未能查到Laminin A5的信息。文中通过生物信息学分析,首次确认了猪Laminin A5的存在,并进行了克隆和测序验证。为揭示Laminin基因家族在猪诱导多能干细胞(i PSCs)中的表达特性,检测了Laminin在猪各组织、体细胞和i PS细胞中的不同表达模式。发现Laminin B1基因在猪多能干细胞中存在特异性可变剪接体(LAMB1-a),且该可变剪切体的表达量与猪多能干细胞的重编程程度呈正相关。为进一步揭示和利用Laminin作为细胞外基质,用于猪多能干细胞的获取和培养优化奠定了基础。