α-甘露糖苷酶的研究进展

α-甘露糖苷酶(α-mannosidase,α-Man)是真核生物蛋白质N-聚糖修饰的关键酶,其对甘露糖残基的修剪过程是糖蛋白N-糖链复杂化的必要步骤,对蛋白质的合成及正确构象的折叠起决定性作用。N-聚糖的修饰过程包括高甘露糖的修饰与复杂型甘露糖合成两种,α-Man同时参与这两种修饰过程,并发挥重要作用。现重点介绍α-Man的分类、α-Man与高甘露糖修饰的关系、α-Man与复杂型甘露糖合成的关系及α-Man的应用,以期为后续研究提供理论依据。     

棉花两个β-甘露糖苷酶cDNA的克隆及其特征

从陆地棉纤维cDNA文库中分离出两个B-甘露糖苷酶的cDNA克隆,GhManAl和GhManA2.它们的开放读码框编码长度分别为834个氨基酸和976个氨基酸的多肽序列,这两个多肽C-末端的747个氨基酸残基是完全一致的,而N-末端的序列差异较大.GhManAl和GhManA2均属于糖基水解酶家族2的成员,它们与其它植物来源的该家族中β-甘露糖苷酶之间具有较高的同源性,而与非植物来源的β-甘露糖苷酶之间的同源性较低,但不同蛋白序列中均存在糖基水解酶家族2的酶催化活性所需的两个Glu保守残基.这两个多肽的N-末端均没有信号肽序列,因此可能为胞内酶.从表达特征来看,GhManA1属于组成型表达基因,而GhManA2则为纤维细胞优势表达基因.     

甜瓜α-甘露糖苷酶亚家族基因的克隆及分析

在植物体中,α-甘露糖苷酶(α-man,α-mannosidase)是N-聚糖加工、修饰的关键酶,而N聚糖的加工对于植物生长发育是必不可少的,同时在果实成熟过程中起着重要作用。对甜瓜Ⅱ类α-甘露糖苷酶家族基因的结构特点和表达模式进行分析,为探讨α-甘露糖苷酶基因家族各成员在甜瓜不同组织器官发育中可能存在的作用奠定基础。本研究以甜瓜品种河套蜜瓜为材料,采用RT-PCR方法克隆了该家族的3个成员:Cm MAN1、Cm MAN2和Cm MAN3的全长c DNA,应用生物信息学方法对其相应蛋白质的理化性质、系统发育、保守基序进行了分析。分析研究表明,Cm MAN1、Cm MAN2和Cm MAN3的开放阅读框分别为3 063 bp、3 483 bp和3 024 bp,分别编码1 020、1 160和1 007个氨基酸,均为酸性蛋白质,且在不同物种间具有高度保守性。利用RT-q PCR方法检测了这些基因的表达模式,发现Cm MAN1在成熟甜瓜果实中表达量最高,Cm MAN2在叶、花和子房中表达量相对较高,Cm MAN3在子房中表达量较高,表明α-甘露糖苷酶各基因在甜瓜发育中可能具有不同的作用。     

鉴定隶属于糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13, GH13)的潮滩发光杆菌的β-半乳糖苷酶

【背景】糖苷水解酶13家族(glycoside hydrolase family 13, GH13)是已知最大的α-淀粉酶家族,不含有半乳糖苷酶。【目的】对海洋细菌潮滩发光杆菌(Photobacterium gaetbulicola)的一个蛋白BgalPg进行鉴定。【方法】通过保守位点分析和系统发育树确定BgalPg蛋白的家族分类;通过克隆、表达和纯化测定重组BgalPg蛋白的酶学性质并鉴定功能。【结果】BgalPg的蛋白序列新颖,与已知的碳水化物酶无同源性。序列分析结果表明该蛋白具有GH13家族的典型特性,并且隶属于GH13＿38亚家族。BgalPg对α-淀粉酶家族酶的相关底物均无催化活性,却能水解含有β-半乳糖苷键的底物p NP-β-Gal [(2.8±0.4) U/mg]和o NP-β-Gal [(1.4±0.3) U/mg],并且能水解乳糖[(0.40±0.01) U/mg],表现出典型的β-半乳糖苷酶活性。同时,该酶在pH 7.0–8.5稳定性好,60℃的半衰期为1.5 h。【结论】发现隶属于GH13家族的β-半乳糖苷酶。     

东方肉座菌EU7-22木聚糖酶和木糖苷酶基因克隆及生物信息学研究

东方肉座菌EU7-22具有高产半纤维素酶的能力。根据已报道的同属里氏木霉及绿色木霉木聚糖酶,木糖苷酶相关基因序列,设计PCR引物扩增出东方肉座菌内切木聚糖酶(XYNⅠ,XYNⅡ)及β-木糖苷酶(β-BXL)基因。序列经NCBIBlast分析:东方肉座菌xynⅠ基因与里氏木霉xyn1基因(X69573.1)的同源性最高达到91%;xynⅡ基因与绿色木霉xyn2基因(EF079061)同源性最高达到93%;β-bxl基因与里氏木霉β-bxl1基因(Z69257.1)的同源性最高达到94%。生物信息学分析表明内切木聚糖酶Ⅰ和Ⅱ均属于糖基水解酶家族11,N末端前19个氨基酸均为信号肽。内切木聚糖酶Ⅰ分子量为24.13kD,等电点为7.87,含有3个糖基化位点;内切木聚糖酶Ⅱ分子量为24.44kD,等电点为4.86,含有1个糖基化位点;β-木糖苷酶属于糖基水解酶家族3,分子量为87.27kD,等电点为5.49,N末端前20个氨基酸为信号肽,含有8个糖基化位点。利用SWISS-Model对木聚糖酶,木糖苷酶蛋白质三级结构进行了预测和模拟。对木聚糖酶和木糖苷酶基因及其编码蛋白质的生物信息学分析,为进一步研究这些基因的表达与调控、构建高效利用纤维素组份的工程菌株奠定基础。     

糖苷酶的研究及其改造策略

糖苷酶作为水解酶家族的一员,其性质和功能是现在研究的热点。主要阐述了α-甘露糖苷酶、阿拉伯糖苷酶、β-木糖苷酶、β-D-葡萄糖醛酸苷酶、日本曲霉产β-呋喃果糖苷酶、壳三糖苷酶、耐高温β-甘露糖苷酶以及硫代糖苷酶8种常见的糖苷酶及其基本性质。并综述了近几年对糖苷酶的改造、糖基化合物生物改性以及糖苷酶作用机理的研究方法。     

细菌生物被膜核心胞外多糖靶向水解酶的生物信息挖掘北大核心

【目的】胞外多糖是生物被膜不可或缺的重要成分,在细菌致病和耐药过程中发挥着重要作用。运用酶制剂针对生物被膜的核心胞外多糖进行靶向清除,能够从根本上破坏细菌生物被膜的核心骨架,有助于战胜细菌生物被膜导致的危害。【方法】本研究针对常见致病菌生物被膜核心胞外多糖Pel、Psl、褐藻胶、N-乙酰氨基葡萄糖(Poly-β(1,6)-N-acetyl-D-glucosamine,PNAG)和纤维素,基于NCBI数据库中丰富的基因序列信息,筛选靶向生物被膜核心胞外多糖的水解酶,进一步运用phyre2、SWISS-MODEL等生物信息工具,分析了这些水解酶的理化性质、遗传进化、功能域及三维结构。【结果】筛选获得了153个靶向生物被膜核心胞外多糖的水解酶及其序列信息。其中,靶向Pel胞外多糖的水解酶共30个,属于糖苷水解酶114家族(glycoside-hydrolase family GH114);靶向Psl胞外多糖的水解酶共25个,属于糖苷水解酶超家族(glyco_hydro super family);靶向褐藻胶胞外多糖的水解酶共33个,属于褐藻胶裂解酶超家族(Alg Lyase superfamily);靶向PNAG胞外多糖的水解酶共30个,属于糖苷水解酶13家族(glycoside-hydrolase family GH13);靶向纤维素胞外多糖的水解酶共35个,属于糖苷水解酶8家族(glycosyl hydrolases family GH8)。【结论】这些水解酶菌具备靶向瓦解生物被膜核心胞外多糖的潜力,亟待进一步开发与应用。本研究提供了迄今为止最为全面的生物被膜核心胞外多糖水解酶序列组成及生物信息,为生物被膜的精准预防和靶向控制奠定扎实的数据基础。     

棘孢木霉糖苷水解酶3基因家族的生物信息学及表达模式分析

【背景】糖苷水解酶(glycoside hydrolase, GH) 3基因家族成员主要编码胞外β-葡萄糖苷酶,是纤维素降解中的关键酶。【目的】鉴定棘孢木霉GH3基因家族成员,探究其在纤维素降解过程中转录水平的表达模式。【方法】通过生物信息学方法对棘孢木霉GH3基因家族成员进行鉴定,对其基因结构、系统进化、蛋白理化性质、亚细胞定位及蛋白质三级结构进行分析,并采用荧光定量PCR技术对纤维素诱导下转录水平的表达模式进行综合分析。【结果】棘孢木霉基因组共鉴定到16个GH3基因家族成员,含有1-8个外显子,编码蛋白质长度为533-934个氨基酸,分子量为57.82-101.91 kDa,大多数为胞外蛋白。系统发育表明,该基因家族成员可分为4组,与里氏木霉的相似性较高。基因表达模式分析表明,纤维素诱导下,16个GH3基因均有表达,但不同成员在转录水平的表达存在差异。其中,1个基因呈组成型表达,2个基因表达下调,13个基因表达上调。棘孢木霉的胞外β-葡萄糖苷酶活力在纤维素诱导下明显提升,与GH3基因家族成员在转录水平的整体表达模式相一致。【结论】棘孢木霉基因组共包含16个GH3基因家族成员,而且多...     

香蕉几丁质酶基因家族的鉴定及在枯萎病侵染时的表达分析

几丁质酶(CHi,Chitinase)是一种能够催化真菌细胞壁中几丁质水解的病程相关蛋白,在植物与真菌互作中起着重要的作用。本研究以拟南芥几丁质酶基因的蛋白序列为查询序列,在香蕉A基因组数据库中进行BLASTp比对,鉴定出23个香蕉几丁质酶(MaCHi,Musa chitinase)基因家族成员。根据其染色体上的位置,分别命名为MaCHi01～MaCHi23。系统进化树分析表明23个MaCHis可分为糖苷水解酶18(GH18,glycosyl hydrolase 18)和糖苷水解酶19(GH19,glycosyl hydrolase 19)2个亚家族。转录组数据分析表明接种尖孢镰刀菌古巴专化型热带4号生理小种(Foc TR4,Fusarium oxysporum f. sp. cubense tropical race 4)后MaCHi05、MaCHi06、MaCHi07、MaCHi11、MaCHi19和MaCHi20基因在感病品种巴西蕉中显著下调或不表达,在抗病品种GCTCV-119中显著上调。利用RT-qPCR技术对MaCHi05、MaCHi06、MaCHi07、MaCHi11和M...     

重构酿酒酵母N-糖基化途径生产人源化糖蛋白

【目的】为了在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中生产人源化的糖蛋白,必须对N-糖基化途径进行基因工程改造。作者通过敲除一些酵母N-糖基化途径中的特异性糖基转移酶,得到一株可以用于继续表达人类糖基转移酶的重组菌,并通过生长适应性进化技术回复其细胞生长能力。【方法】首先运用酵母遗传学和分子生物学技术敲除酿酒酵母的α-1,3-甘露糖基转移酶基因(ALG3)、α-1,6-甘露糖基转移酶基因(OCH1)和α-1,3-甘露糖基转移酶基因(MNN1)。采用蔗糖酶(invertase)活性染色实验初步检测N-糖链的变化,然后通过高效液相色谱和甘露糖苷酶酶切实验对其糖链结构进行鉴定。重组菌通过在高温条件下进行生长适应性进化,筛选出生长能力回复突变的菌株。【结果与结论】构建了Δalg3Δoch1Δmnn1菌株得到人类糖基化中间体Man5GlcNAc2,并对上述三缺陷型菌株进行适应性进化提高其细胞生长能力和环境适应能力。此外,作者还发现,该重组菌存在少量Man6GlcNAc2结构的糖链。经体外α-1,2-甘露糖苷酶切处理后,糖链Man5GlcNAc2和Man6GlcNAc2均转化为Man3GlcNAc2,表明形成Man3GlcNAc2之后的甘露糖之间均通过α-1,2-糖苷键连接。Δalg3Δoch1Δmnn1菌株的构建获得了生产人源化糖蛋白的酿酒酵母表达系统,为进一步糖基化改造和工业应用提供了良好的基础。     

链霉菌J-13-3中的第19家族壳多糖酶

壳多糖酶(几丁质酶)[EC3．2．1．14]水解壳多糖的β-1,4-键,产生N-酰氨基葡萄糖(GlcNAc)和(GlcNAc)2。根据催化结构域氨基酸序列的相似性,壳多糖酶分别属于18和19家族的糖基水解酶。除了一些链霉菌和气单胞菌等的壳多糖酶属于19家族外,所有细菌的壳多糖酶都属于18家族糖基水解酶。大多数19家族的壳多糖酶是在植物中发现的,除了降解壳多糖还可以抵抗真菌的侵染。     

微生物来源α-L-鼠李糖苷酶的分子和结构生物学研究进展

α-L-鼠李糖苷酶(α-L-rhamnosidase(EC 3.2.1.40))是一种水解酶,分布在GH13、GH28、GH78和GH106家族,其中3种GH78家族的α-L-鼠李糖苷酶具有典型的(α/α)6桶状结构,它能够特异性地水解许多糖苷类物质末端的α-L-鼠李糖基,在食品饮料加工工业和医药业中具有重要的应用价值。介绍了微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶的性质及应用,主要阐述了α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达及该酶晶体结构方面的研究进展。     

植物β-葡萄糖苷酶的研究进展

β-葡萄糖苷酶是一种糖苷水解酶,广泛存在于动物、植物和微生物中。β-葡萄糖苷酶能够水解非还原性末端糖基,在植物细胞壁代谢、植物激素激活以及逆境防御等方面发挥着重要作用。β-葡萄糖苷酶依据其氨基酸序列可以分为GH1、GH3、GH5、GH7、GH9、GH12、GH35、GH116等8个家族;但是,目前仅对GH1和GH3有较深入的研究,其他家族的功能依旧不清楚。综述了近年来植物中β-葡萄糖苷酶的结构、理化性质、底物特异性、催化机制以及糖苷水解酶家族在植物中的功能等方面的研究进展,总结了植物中β-葡萄糖苷酶研究中存在的问题,并指出今后的研究方向。     

Dispersin B:一种可用于生物被膜防治的糖苷水解酶

β-N-乙酰氨基葡萄糖苷酶(dispersin B, DspB)是一种活性高、稳定性强的糖苷水解酶,其相对分子质量为40 000。DspB由361个氨基酸残基组成,具有8个β/a结构域,折叠后形成TIM桶状结构。其中,β4结构域存在高度保守的位点Asp183和Glu184。作为糖苷水解酶家族20(glycoside hydrolase family 20, GH20)成员,DspB不像其他β-己糖胺酶那样具有多个功能域,DspB只有单一的功能域,且具有独特的底物专一性、底物结合与释放特性。由于DspB能够水解细菌生物被膜基质中的聚β-(1,6)-N-乙酰葡萄糖胺(poly-β-1,6-N-acetyl-D-glucosamine, PNAG),使生物被膜发生解聚而变成游离状态,增加抗生素疗效,因此有望用于细菌引起的植入医疗器械感染的治疗。现分别从DspB所在GH20家族成员概况、DspB的结构和DspB的功能与应用三个方面对相关的最新研究进展进行分析与总结。     

糖苷水解酶7家族蛋白在纤维素降解中作用的研究进展

糖苷水解酶7家族（glycoside hydrolase family, GH7）是一类来源于真菌的水解酶,作用于纤维素结晶区或不定形区的β-1,4 键,可用于高效降解纤维素转化为可发酵的糖。GH7的成员具有高度保守序列以及相似三维结构,其催化结构域是由多个loop区围绕反向平行的β 折叠形成的β 三明治结构。目前已有17个GH7成员的结晶结构得到解析,明确了酶的结构与催化功能之间的关联,对GH7的来源及分类、蛋白序列、结构特征与催化纤维素降解功能关系的研究进展进行阐述。     

管纹艳虎天牛糖苷水解酶基因家族的鉴定和表达谱分析

昆虫糖苷水解酶（Glycoside hydrolase, GH）在寄主植物糖类化合物的水解过程中扮演着重要作用,但是在管纹艳虎天牛Rhaphuma horsfieldi中尚未有GH基因的报道。基于测序的转录组数据,本研究从管纹艳虎天牛中鉴定到7个RhorGHs家族：GH1、GH9、GH13、GH16、GH28、GH31和GH45,分别具有23、1、4、2、10、12和4个基因,其中23个基因具有全长序列。在进化分析中,管纹艳虎天牛不同GH家族的成员主要以物种特异的形式聚类,尤其是GH1和GH28家族。三级结构分析显示,RhorGH28家族的蛋白主要由β折叠组成,不同蛋白间具有高度保守的结构和与糖类化合物互作的关键氨基酸位点,包括质子供体、催化亲核残基和底物结合位点。在表达谱分析中,大部分RhorGHs基因主要在雌雄虫腹部特异或高表达,暗示其可能在与消化有关的肠道中表达。研究结果明确了管纹艳虎天牛GH家族及其数量,以及各家族的序列特征和进化关系,可为该天牛的寄主植物适应性机制研究提供借鉴。     

α-淀粉酶家族的新成员——多功能淀粉酶

多功能淀粉酶是α淀粉酶家族（α-amylase family）的新一类成员,包括新普鲁兰酶 、麦芽糖淀粉酶和环麦芽糊精酶,它们在结构上具有α淀粉酶家族共有的4个高度保守的区 域,但在功能上又兼有糖苷水解酶和糖基转移酶的催化活性,而不同的多功能淀粉酶虽然在结 构与功能上具有一定的相似性,但不同来源的酶在底物特异性和水解、转移糖苷键的特异性 等方面存在着差异.多功能淀粉酶大多存在单体与二聚体或多聚体之间的平衡,其多聚化与N 结构域和环境中的离子强度调控有关.实验证明,通过突变可以改变多功能淀粉酶的催化特 性,甚至仅1个氨基酸的替换就能实现功能改变.多功能淀粉酶的结构保守性和催化多样性具 有重要的研究价值及应用前景.     

人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA的克隆与表达

溶酶体α-甘露糖苷酶是糖蛋白降解途径的主要外糖苷酶,该酶缺陷引起溶酶体α-甘露糖苷贮积症.用RT-PCR法从HeLa细胞中克隆的人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA含有1个由2964bp组成的阅读框,编码由988个氨基酸组成的多肽,前26个氨基酸为潜在的前导序列,成熟多肽的预测分子量为111kD,具有11个潜在的N-交联糖基化部位.用逆转录病毒介导法导入患者细胞后,该cDNA表达高活性α-甘露糖苷酶.序列分析表明,此cDNA与已发表的拟似人溶酶体α-甘露糖苷酶cDNA有不同程度的差异,尤其是第2315位碱基的T-C转换可能与控制酶活性有关     

持续性内切酶EG5C-1的改造及酶学性质

为了提高glycosyl hydrolase 5 (GH5)家族的持续性内切酶EG5C-1的催化活性,对EG5C-1进行同源建模和分子对接,分析确定了活性架构区域内的23个关键氨基酸残基,并通过丙氨酸扫描、饱和突变和组合突变等方法最终获得催化活性显著提高的突变体D70Q/S235W,并分析其酶学性质。结果表明：D70Q/S235W的最适反应温度为60℃,最适pH为6.0。以羧甲基纤维素钠(CMC)和微晶纤维素(Avicel)为底物进行水解产物分析,突变体D70Q/S235W的主要水解产物为纤维二糖和纤维三糖。本研究筛选获得催化活性和酶学性质显著提高的突变体,可为纤维素酶的蛋白质工程改造奠定基础。     

GH79家族糖苷水解酶分子进化关系和蛋白结构研究

GH79家族的糖苷水解酶在碳水化合物改性、细胞免疫识别和信号传导等方面具有广泛的生理活性和重要的应用前景。然而,目前GH79家族的多样性催化机理仍不清楚,识别底物的结构基础和分子机制尚不清晰。本文总结了近几年GH79家族的研究进展,系统分析了GH79家族酶的来源与分布,通过对酶的序列特征、分子进化关系、蛋白结构解析等方面进行深入阐述,旨在为后续的GH79家族的蛋白质工程和功能催化机制的解析奠定基础。