B27K—去B链C端三肽胰岛素的制备、生物活力与自聚合性质

液相合成五肽Gly Phe Phe Tyr Lys(Boc)Obut,与B链C端去八肽胰岛素酶促缩合得到B2 7K 去B链C端三肽胰岛素(B2 7K DTrI,B2 7K destripeptideinsulin)。用小鼠惊厥法和小鼠降血糖法测得B2 7K DTrI的整体生物活力为标准胰岛素的 80 % ,B2 7K DTrI与人胎盘细胞膜胰岛素受体结合能力为标准胰岛素的 ( 12 5± 13 ) %。用凝胶过滤法证明B2 7K DTrI自聚合性质降低 ,具有与去B链C端五肽胰岛素相同的单体性质。在B2 7K DtrI结构中 ,B2 7T被K取代 ,其优点是在酵母中表达其前体后 ,可以很方便地通过胰蛋白酶水解获得     

一种增加毕赤酵母生产胰岛素前体的方法

为了提高胰岛素前体(PI)的产量,构建了p PIC9K-PI表达载体并电转化至毕赤酵母菌株GS115中,在浓度为4.0 mg/m L的G418抗性平板上筛选到了1株拷贝数为12的菌株CL012。将SNAREs(可溶性N-乙基马来酰亚胺敏感因子受体蛋白)组分中的SNC2和SNC2-SSO2分别转入菌株CL012中,并在摇瓶和5 L发酵罐水平上检测SNAREs对PI产量的影响。结果表明:摇瓶水平上,甲醇诱导96 h后,菌株CL012的PI产量为1.53 mg/L;表达SNC2和SNC2-SSO2的菌株的PI产量分别为1.89 mg/L和2.21 mg/L,分别比菌株CL012提高了23.53%和44.44%。在5 L发酵罐上进行高密度发酵,甲醇诱导96 h后菌株CL012的PI产量为53 mg/L,是摇瓶水平的34.64倍;表达SNC2和SNC2-SSO2的菌株的PI产量分别达到64 mg/L和78 mg/L,分别比菌株CL012提高了20.75%和47.17%。由此得出结论 SNAREs可以促进胰岛素前体的分泌,从而提高在毕赤酵母中的异源表达。     

棉铃虫组织蛋白酶B酶原在毕赤酵母中的表达

棉铃虫组织蛋白酶B（ Helicoverpa armigera Cathepsin B ,HCB）属于半胱氨酸蛋白酶类,参与胚胎发育中卵黄蛋白水解供给胚胎发育的氨基酸。本研究将HCB基因克隆到pPIC9K载体并转化毕赤酵母KM71菌株,经甲醇诱导,HCB表达并分泌到培养上清中。表达产物经SDS-PAGE测定分子量为38 kD, 与HCB基因编码的蛋白质分子量一致。用HCB的特异性抗体检测表明重组表达产物为棉铃虫组织蛋白酶B,原位水解实验显示重组表达的蛋白酶具有蛋白水解活性,表明在毕赤酵母中表达了有活性的棉铃虫组织蛋白酶B, 可用于组织蛋白酶B酶原活化机理研究及开发新蛋白酶产品。     

不同猪胰岛素前体基因拷贝数Mut+型毕赤酵母的摇瓶发酵研究

毕赤酵母是优秀的外源蛋白的表达系统之一。本文对Mut~+型的不同PIP基因拷贝数的毕赤酵母进行了摇瓶试验。研究了生长特性以及对外源蛋白表达量的影响等。发现了低拷贝和高拷贝的蛋白表达量、生长情况有差异。G12重组菌的PIP表达量最高为181.6mg/L,是单拷贝重组菌表达量的12.6倍。对于基因拷贝数低于12的菌株,PIP表达水平与PIP基因拷贝数成线性关系(r=0.996)。     

Protein engineering of insulin: Two novel fast-acting insulins [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin

Blood glucose lowering assay proved that [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin exhibit potency of acute blood glucose lowering in normal pigs, which demonstrates that they are fast- acting insulin. Single-chain precursor of [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin is [B16Ala]PIP and [B26Ala]PIP, respectively, which are suitable for gene expression. Secretory expression level of the precursors in methylotrophic yeast Pichia pastoris was quite high, 650 mg/L and 130 mg/L, respectively. In vivo biological assay showed that the two fast-acting insulins have full or nearly full biological activity. So both [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin can be well developed as fast-acting insulin for clinic use.     

一种增加重组毕赤酵母拷贝数提高胰岛素前体产量的策略

[目的] 为了进一步提高毕赤酵母表达生产人胰岛素前体的产量,[方法] 将构建的表达载体pPICZα-IP 电转至毕赤酵母X-33中,在100 μg/mL zeocin的YPDS抗性平板筛选获得过量表达人源胰岛素前体(IP)的重组菌株B4和S6.在此基础上,以过量表达胰岛素前体的B4和S6为出发菌株,以SacI线性化的表达载体pPICZα-IP进行重复电转化,并在1000 μg/mL zeocin的YPDS平板上筛选获得一株拷贝数为7的重组毕赤酵母2B4.[结果] 该菌株在5L规模发酵罐上,人源胰岛素前体产量是低拷贝数菌株B7的2.7倍,且菌体并未因拷贝数高而表现出生长不良的现象.实时定量PCR检测后,发现2B4菌株胰岛素前体基因的转录水平是B7的2倍.[结论] 综上结果表明,采用抗性筛选和重复电转相结合的高拷贝重组毕赤酵母构建策略,能有效促进目的基因的转录水平,最终显著提高目标蛋白的产量.     

Protein engineering of insulin: Two novel fast-acting insulins [B16Ala]insulin and [B26Ala]insulin

Insulin has been successfully used in clinic treatment of diabetes for more than 80 years. However, the clinic practice has shown that regular insulin preparation used in clinic exhibits several intrinsic problems that have existed for a long time. One of the major problems is that insulin has a potency of self-association when its concentration is higher than physiological concentration (10-8—10-10 mol/L)[1,2]. The concentration of the regular insulin is higher than 10-4 mol/L. At such a hi…     

Preparation of monomeric B27 Lys destripeptide insulin by intein mediated expression in Escherichia coli

The B27K-DTrI insulin (human insulin with B28-30 removed and B27 Thr replaced by Lys) was reported to have superior monomeric property with 80% insulin activity in vivo. It has potential use as a new fast-acting analog of insulin. We cloned the monomeric insulin B27 DTrI precursor (MIP) into the pTWIN1 vector, and prepared by intein mediated expression in Escherichia coli. After tryptic digestion, the MIP was converted to B27K-DTrI insulin. The product was purified by HPLC. The mass spectrometry showed that the molecular mass of purified B27K-DTrI was consistent with the theoretical value.     

人Tumstatin在毕赤酵母中的表达和活性分析

利用PCR技术从重组质粒pET-3c-tum中扩增人tumstatin的cDNA片段,连入pPICZαA酵母表达载体,获得的重组质粒pPICZα-tum电激法转化毕赤酵母GS115。经表型鉴定、诱导表达筛选,得到可分泌表达人tumstatin的重组酵母转化子,表达蛋白质的相对分子量约30kD,表达量约25mg/L。表达上清经超滤浓缩和离子交换法初步纯化,所得产物具有免疫活性,能够抑制内皮细胞增殖,诱导其发生细胞凋亡,并能抑制鸡胚尿囊膜血管生成。     

人胰岛素在甲醇酵母Pichia pastoris中的分泌表达

将猪胰岛素前体基因和在其５’端引入９个氨基酸的间隔肽序列的ＰＩＰ基因插入到Ｐｉｃｈｉａ ｐａｓｔｏｒｉｓ的分泌表达质粒ｐＰＩＣ９中,得到分泌表达质粒ｐｐＩＣ９／ＰＩＰ和ｐＰＣ９／ｓｐ－ＰＩＰ７并用以转化ｐａｓｔｏｒｉｓ ＧＳ１１５。用点杂交筛选,获得高拷贝转化Ｐ３９（－ｓｐ）和Ｓ５１（＋ｓｐ）。     

糖化酶、木聚糖酶融合蛋白在毕赤酵母中的高效表达

通过RT-PCR方法,以埃默森篮状菌(Talaromyces emersonii)总RNA为模板,克隆出糖化酶(glucoamylase,amyA)基因的成熟肽编码序列(1 857 bp),编码618个氨基酸;以类芽孢杆菌(Paenibacillus sp.)H10-3基因组DNA为模板,克隆出木聚糖酶(xylanaseA,xynA)基因的成熟肽编码序列(636 bp),编码211个氨基酸.通过重叠延伸PCR( SOE-PCR)得到拼接片段amyA-l-xynA,并将其克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9中,得到重组质粒pPIC9-amyA-l-xynA,重组质粒线性化后经电击转化到毕赤酵母(Pichia pastoris)GS115中,得到了表达成功的工程菌ALX2.在ALX2发酵上清液中同时检测到糖化酶活性(10.7 U/mL)和木聚糖酶活性( 51.8 U/mL).     

Arresten在毕赤酵母中的表达和鉴定

Arresten来自人Ⅳ型胶原α-1链非胶原末端,可抑制新血管生成。从人肝脏提取总RNA,RT-PCR扩增arres-ten的cDNA,T载体进一步扩增后与表达载体pPIC9连接,测序,确认后转入毕赤酵母,获得表达可溶性arresten的酵母细胞。表达产物经初步纯化后,用SDS-PAGE测定分子量为26kD,与理论计算值接近;表达产物对matrigel辅助的内皮细胞管化有明显抑制作用。上述结果表明用毕赤酵母表达了有活性的arresten。     

乙型肝炎病毒X基因真核表达载体的构建及其在巴斯德毕赤酵母中的表达

目的：在巴斯德毕赤酵母中表达乙型肝炎病毒（HBV）X蛋白,为探讨HBVX蛋白与慢性乙型肝炎及肝细胞癌发生的关系奠定基础。方法：用PCR方法扩增X基因序列,并分别在上下游引入XhoⅠ和XbaⅠ酶切位点,插入pPICZαA载体,转化大肠杆菌TOP10,筛选阳性克隆,对其进行PCR和双酶切及测序鉴定,构建HBVX蛋白毕赤酵母表达质粒pPICZαA-HBx;电击转化毕赤酵母GS115,对阳性克隆进行诱导表达后经SDS-PAGE和Western blotting鉴定目的蛋白。结果：双酶切pPICZαA-HBx后,琼脂糖电泳可分别见到大小约为3.1kb和465bp的片段,表明目的片段已插入载体中,序列测定表明其含有完整的X基因片段,Western blotting结果显示含有pPICZαA-HBx的毕赤酵母GS115能分泌表达X蛋白。结论：构建了毕赤酵母表达载体pPICZαA-HBx,并能在毕赤酵母GS115中分泌表达X蛋白。     

蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂的酵母表达及其对B16细胞体外侵袭的抑制作用*

目的：建立毕赤酵母表达质粒pPICZαA-cystatin,转化酵母细胞生产重组蛋白,探讨蛇毒半胱氨酸蛋白酶抑制剂（sv-cystatin）对肿瘤侵袭的生物学作用。方法：利用PCR扩增技术从pUC18/sv-cystatin质粒中扩增sv-cystatin cDNA并克隆至酵母表达载体pPICZαA上,构建重组质粒pPICZαA-cystatin电激转化Pichia pastori酵母细胞GS115,经1%甲醇诱导获得稳定表达的重组蛋白,改良Boyden小室分析重组sv-cystatin蛋白处理对B16F1细胞体外侵袭力的影响。结果：SDS-PAGE检测和Western blot分析显示分泌表达的sv-cystatin重组蛋白相对分子量约为14 kD,摇瓶发酵每升发酵培养上清可获得16 mg的重组蛋白,经亲和层析纯化获得的sv-cystatin重组蛋白具有抑制木瓜蛋白酶的活性。改良Boyden小室实验结果显示：经0.5mg/ml浓度的重组蛋白处理的B16F1细胞穿过Matrigel的细胞数明显低于对照组(52.60±4.58,106±5.9,P<0.01) ,抑制率为50%。结论：成功实现sv-cystatin的酵母表达,初步证明sv-cystatin重组蛋白可抑制小鼠B16F1细胞体外侵袭作用。     

毕赤酵母中tRNAPro CCG基因的表达及其作用效果

转运核糖核酸 (tRNA) 是蛋白质合成过程中重要参与成分之一,为了探索稀有密码子对应的tRNA (稀少tRNA) 丰度改变对外源基因表达量的影响,文中构建了毕赤酵母稀少tRNA基因与外源基因共表达体系。首先在GFP基因中添加由4个连续脯氨酸稀有密码子CCG组成的阻遏区,结果显示该GFP基因的表达量明显降低。然后将带有阻遏区的GFP基因和tRNAPro CCG基因顺次连接于pPIC9K载体上,在毕赤酵母GS115中共表达,结果使GFP表达量提高了4.9%;另将带有阻遏区的GFP基因和tRNAPro CCG基因分别连接于pPIC9K和pFLDα载体,在毕赤酵母GS115中共表达,GFP表达量最高提高了12.5%;应用同样方式将tRNAPro CCG基因与NFATc3T-GFP融合基因共表达,其表达量提高了21.3%。可见,tRNAPro CCG在毕赤酵母GS115中确为稀少tRNA,通过共表达tRNAPro CCG基因可显著提高带有连续该密码子的外源基因表达量,并且,文中构建的共表达体系将同样适用于其他稀少tRNA基因的筛选和验证。     

外源基因在毕赤酵母中表达的优化

巴斯德毕赤酵母是近年来成功的外源基因表达系统,已表达出众多外源蛋白。它既能像原核生物一样快速生长高密度发酵,又能进行真核翻译后修饰,并且蛋白分泌量大,因此应用越来越广泛。如果对它的表达载体,转化诱导条件和目的基因内部结构,发酵条件等方面进行优化,能够进一步发挥它的优势,更好地表达需要的外源蛋白。本文就毕赤酵母表达系统表达优化进行总结综述。     

果蝇防御素在毕赤酵母中的表达及活性检测

抗菌肽是昆虫感染细菌后,由血细胞及脂肪细胞在瞬时分泌的抗菌物质。具有广谱抗菌活性和抑杀耐药菌株等优点。抗菌肽不仅抗菌谱广,而且对某些真菌、原虫、病毒及肿瘤有一定的杀灭和抑制作用,还能加速免疫和伤口愈合过程。防御素是一类在自然界中广泛存在的、具有微生物抗性的小分子抗菌肽。利用PCR技术,以果蝇总DNA为模板,扩增出两端加入了连接接头的防御素基因,将接头处理成粘性末端,将防御素基因与分泌型酵母表达载体pHBM905B重组,构建重组酵母表达载体pHBM905B/defensin,经"三明治"夹心平板筛选及菌落PCR鉴定证明目的基因已整合入酵母染色体中。挑选阳性克隆经甲醇诱导表达,以SDS-PAGE电泳对表达产物进行分析,证明表达蛋白的相对分子量约为10kD,与预期结果一致。用琼脂糖扩散法检测上清液的生物学活性,可以观察到明显的抑菌圈,显示其具有较强的抗菌活性。同时表达产物有极强的热稳定性,展示了诱人的应用前景,为进一步的开发研究奠定了基础。     

人源抗HBsAg单链抗体在巴氏毕赤酵母中的表达

在P.pastoris中分泌表达非融合抗HBsAg单链抗体（HBscFv）。设计引物从pGEMHBscFv上扩增目的基因,亚克隆至P.pastoris表达载体pPICZαA中,线性化后转化P. pastorisGS115;转化子经菌落PCR、高浓度Zeocin抗性筛选鉴定后,甲醇诱导目的蛋白表达。结果发现,重组HBscFv可以在α因子的引导下,分泌至培养基中,产量为80mg/L;分泌至培养基中的HBscFv具有结合HBsAg活性,活性总量在诱导培养72h后达最高峰,在诱导培养后期,HBscFv活性下降;PAS糖显色结果表明,酵母表达HBscFv是一种低糖基化蛋白或非糖基化蛋白。     

乙型肝炎病毒全长PreS蛋白基因在酵母中的表达

应用直接提取法从武汉地区乙型肝炎病人患者阳性血清中提取HBV基因组,以此作为模板,用引物PCR方法获得全长preS基因,该片段的DNA大小1203bp-克隆到pUCm-T载体中,应用M13通用引物进行序列测定,与中国HBV标准株序列比较,证实基因型为Adr亚型。有24个核苷酸不同,preS基因包含3个起始密码ATG分别为preS1,preS2,和S的翻译起点。然后将preS基因克隆到毕赤酵母表达载体pPIC9K中,将Sal Ⅰ线性化的pPIC9K—preS质粒用电击法导入巴斯德一毕赤酵母GS115His中。通过MD—G418平板筛选和5‘‘‘‘‘‘‘‘AOXI和3’AOXI引物PCR鉴定获得稳定重组HBV全长严preS基因的His^ Mut^ 酵母工程菌株。此酵母菌株在合适的培养条件和甲醇诱导下高效表达产生全长preS蛋白并可分泌到培养液中,SDS—PAGE显示培养液中含有分子量约为48kDa的带;微孔ELISIA法证实表达并分泌到培养液中的preS蛋白能够与HBV抗体阳性血清发生特异性反应。