刺五加细胞色素P450基因的克隆与表达分析

根据已报道的人参、三七等植物的细胞色素P450(Cytochrome P450,P450)基因的cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加P450基因的cDNA全长序列,并分析其在不同生长发育时期和器官中的表达情况。结果显示,克隆了全长为1 410 bp的刺五加P450基因的cDNA序列,该基因编码469个氨基酸残基组成的蛋白质。GenBank登录号为KF498590,与人参、三七的P450氨基酸序列一致性分别为91.5%和90.4%。刺五加的P450基因在不同生长发育时期和器官中均有表达,但表达量具有显著差异(P0.05)。最大表达量出现在盛花期,为最低表达量(萌芽期)的1.26倍。各器官中,叶片的表达量最高,是最低量幼茎的1.49倍。     

牡丹PoSAD基因克隆与表达分析

以凤丹牡丹(Paeonia ostii)叶片为试验材料,采用RACE和RT-PCR方法,克隆得到凤丹牡丹硬脂酰-ACP去饱和酶基因SAD的cDNA全长,命名为PoSAD(GenBank登录号为KY038819)。序列分析表明,该基因cDNA序列全长1 559bp,其中开放阅读框1 197bp,编码398个氨基酸,3′端非编码区长172bp,5′端非编码区长123bp。多序列比对结果表明,凤丹牡丹PoSAD氨基酸序列含有2个保守结构域。系统发育分析结果显示,凤丹牡丹与蓖麻处于同一分支,其亲缘关系最近。TMHMM和TargetP亚细胞定位分析得知,PoSAD蛋白无跨膜区域,可能定位于叶绿体中发挥功能。组织特异性结果分析表明,PoSAD基因在凤丹牡丹的根、茎、叶、花瓣、雌蕊、雄蕊、种子中均有表达,且在花瓣中表达量最高,雌蕊中次之,在根中的表达量最低;不同时期种子中,60d表达量最高,80d次之,10d中表达量最低。     

红树植物桐花树 E F1 A 基因的克隆与表达分析

通过 RACE 方法克隆到桐花树(Aegiceras corniculatum)的一个延伸因子基因, 命名为 AcEF1A(GenBank 登录号:KC416649)。该基因的 cDNA 全长 1 778 bp, CDS 为 1 350 bp, 编码 449 个氨基酸。多序列比对结果表明该氨基酸序列与琴叶拟南芥(Arabidopsis lyrata)EF1A 的氨基酸序列高度相似(97.7%)。基因表达分析结果显示 AcEF1A 在茎尖中的表达量最高,叶片中的表达量次之, 根中的表达量最低。低温、高盐、干旱和重金属 Cd 胁迫下, 桐花树叶片中 AcEF1A 基因的表达水平有不同程度的上调。这些结果表明 AcEF1A 基因可能参与了植物的生长发育过程及逆境响应过程。     

砀山酥梨不同程度缺铁叶片生长素抑制蛋白基因表达分析

以‘砀山酥梨’为材料,采用酶联免疫分析法(ELISA),测定叶片中内源IAA的含量.依据已构建的缺铁叶片SSH文库中生长素抑制蛋白(ARP)基因片段的序列信息,应用RACE技术克隆其cDNA全长,通过实时荧光定量(qRT-PCR)技术,分析ARP基因的相对表达量.结果表明:(1)ARP基因cDNA全长为707 bp,其中开放阅读框为351 bp,编码116个氨基酸,推测的蛋白质分子量为12.82 kD;该蛋白可能定位于微体,属于非分泌型、非跨膜蛋白类,并具有ARP基因家族的保守结构域.(2)在不同程度缺铁叶片中ARP基因的表达量存在差异,随着缺铁程度的增加,表达量显著升高,同时叶片中内源IAA含量逐渐降低.据此推测,ARP基因可能负反馈调节缺铁黄化叶片中IAA的水平,从而调控叶片的生长发育.     

玉米亚硫酸氧化酶基因的克隆及其结构与表达分析

为明确亚硫酸氧化酶(sulfite oxidase,SO)基因的结构特征和进化关系及其在玉米不同组织器官发育过程中的表达和分布特性,采用RACE技术克隆了玉米SO基因(ZmSO)的全长cDNA。序列分析表明,获得的ZmSO全长1 492bp,其中5′-UTR 160bp,3′-UTR 138bp,开放阅读框为1 194bp,编码397个氨基酸组成的蛋白质。对该基因编码氨基酸保守结构域的分析发现,ZmSO包含1个钼辅因子结合域、1个自身二聚化域和1个过氧化物体靶信号序列。系统进化分析显示,SO在进化上较为保守,玉米与其它植物的SO相似性较高。荧光定量RT-PCR分析表明,在玉米成株期,根、茎、叶、雄花和幼穗中,ZmSO在根部表达丰度最低,在叶片和幼穗中表达量较高。酶活性测定结果显示,不同器官中SO活性与其mRNA转录水平上的表达趋势相似。     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

凡纳滨对虾DNaseⅠ基因的克隆及原核表达

利用RT-PCR和RACE技术,从凡纳滨对虾(Litopenaeus vannamei)肝胰腺中克隆了DNaseⅠ基因的全长cDNA序列。该序列全长1614bp,包含1209bp的开放阅读框,编码一个含403个氨基酸的蛋白;5′非翻译区为116bp,3′非翻译区为289bp。实时定量PCR分析结果表明,DNaseⅠ基因在肝胰腺的表达量是其他器官表达量的16～162倍,表明凡纳滨对虾DNaseⅠ基因属于胰腺型表达。本研究还利用酶切重组构建原核表达载体,并在大肠杆菌(Escherichia coli)中成功表达出了有活性的重组DNaseⅠ蛋白。     

甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。     

大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因的克隆与表达分析

【目的】储存蛋白是昆虫发育、变态和生殖过程中氨基酸的主要来源,Hexamerin是储存蛋白家族重要成员,在昆虫的生长发育中起着重要作用。为了研究hexamerin基因(SpbHex)在大豆食心虫Leguminivora glycinivorella Matsumurav生长发育过程中的作用,对大豆食心虫SpbHex基因进行克隆与表达分析。【方法】利用RT-PCR和RACE技术克隆SpbHex的cDNA全长序列,并通过qPCR研究其在不同发育阶段和幼虫不同组织的表达情况。【结果】SpbHex基因cDNA序列全长2 161 bp,其中开放阅读框2 112 bp,编码703个氨基酸。蛋白预测分子量84.15 ku。hexamerin基因在大豆食心虫不同发育阶段和不同组织中均有表达。在不同生长发育阶段中4龄幼虫的表达量较高,1龄和成虫的表达量较低;在不同组织中脂肪体的表达量较高,表皮中的表达量最低。【结论】本研究克隆了大豆食心虫储存蛋白hexamerin基因,并对其在大豆食心虫中表达模式进行分析,为进一步明确hexamerin基因在大豆食心虫生长发育中的作用奠定基础。     

冠突曲霉AN1类锌指蛋白zfpA基因的克隆及表达分析

本研究采用cDNA末端快速扩增技术(rapid amplification of cDNA ends,RACE)克隆出冠突曲霉中zfpA基因的cDNA全长序列并进行生物信息分析。该序列全长1 443 bp,开放阅读框长度为924 bp,从312~1 235 bp,没有内含子序列。推测编码的蛋白质含有307个氨基酸,同源性分析显示该基因与米曲霉的AN1锌指蛋白(XP_001826567)相似性达71%。利用荧光定量PCR技术分析了zfpA基因在营养菌丝体阶段、无性产孢阶段及有性产孢阶段的表达量差异。结果表明,这个基因在在无性产孢时期的表达量最低,有性产孢时期的表达量最高,相比无性产孢时期上调了4倍。本实验为深入研究zfpA基因对冠突曲霉的产孢调控机制奠定了基础。     

酮型广藿香MVA途径基因表达分析及与主要成分合成相关性研究

广藿香药材以广藿香酮含量较高的酮型广藿香为最优质。而广藿香酮为一种萜类成分,其生物合成途径尚未明确。MVA(甲羟戊酸)途径是萜类化合物生物合成的重要途径。为了分析MVA途经基因表达与化学成分的相关性从而获得促进广藿香酮合成的潜在基因,该文以2种酮型广藿香栽培品种(石牌广藿香、高要广藿香)为材料,通过实时定量PCR分析基因表达和主要成分含量测定,并研究了供试材料不同时期的茎、叶中与甲羟戊酸代谢途径相关的HMGR、MK、MDD基因表达及化学成分。结果表明：(1)HMGR基因在石牌广藿香嫩叶中表达更明显;MK基因在石牌广藿香和高要广藿香中表达模式相似,主要在老茎中表达;MDD基因在石牌广藿香叶中比高要广藿香表达量更高,在两种广藿香的茎中表达模式相似。(2)同属于酮型广藿香,石牌广藿香与高要广藿香的化学成分相似,老叶广藿香醇含量最高,老茎的广藿香酮含量更高。(3)MDD和MK基因与广藿香酮的合成正相关。综上结果所述,酮型广藿香两个栽培种MVA途径的基因表达模式相似,MDD和MK基因可能为酮型广藿香萜类代谢途径的关键基因。     

续随子ElFAD2基因的序列及表达特性分析

为了研究油酸脱氢酶(FAD2)基因ElFAD2对续随子(Euphorbia lathyris L.)中不饱和脂肪酸合成的调控作用,该研究在续随子转录组数据的基础上经筛选获得ElFAD2基因序列,并对其序列及表达特性进行分析。序列分析结果显示,ElFAD2基因全长1 907 bp,ORF长1 152 bp,共编码383个氨基酸,包含有典型的脂肪酸去饱和酶结构域。续随子ElFAD2蛋白理论等电点为8.08,属于稳定蛋白,包含4个跨膜区和3个保守的组氨酸簇。基于FAD2的系统发育分析表明,续随子与同科植物乌桕(Triadica sebifera L.)的亲缘关系最近。荧光定量PCR分析发现,ElFAD2基因在不同器官中均有表达,且在花后15 d的种子中表达量最高,在叶与花后30 d及45 d种子中的表达量相当,而在根、茎、花中的表达量最低。该研究结果为深入探讨续随子ElFAD2基因的生物学功能提供了基础数据,也为解析续随子种子中脂肪酸合成的分子机制奠定了基础。     

铁皮石斛泛素结合酶DoUBC9的克隆鉴定与表达分析

目的:本研究旨在探讨泛素结合酶UBC9在铁皮石斛原球茎发育过程中的分子机制,方法:利用生物信息学手段,从已获得的铁皮石斛基因组中鉴定出UBC9基因,命名为DoUBC9,并利用RACE技术,克隆出DoUBC9 3’端,通过与基因组序列拼接,获得完整序列。结果:本研究首次从铁皮石斛基因组中运用生物信息学的方法,鉴定出DoUBC9,并通过RACE技术克隆后拼接,得到完整的DoUBC9,基因全长为7176bp,CDS长为447bp,共编码148个氨基酸。亚细胞定位预测结果表明,DoUBC9大概率分布于分泌囊泡和质膜上。序列比对和进化树分析表明,铁皮石斛Do UBC9和其他物种中的UBC9拥有高度保守的UBCc结构域,进化关系高度保守。qRT-PCR分析表明,在不同组织部位中,DoUBC9在愈伤组织中的表达量最高、叶中表达量最小;在原球茎发育过程中,在P1时期具有最高表达量,其他各时期表达量较小,表明该基因可能促进了植物体的细胞快速分裂与生长。结论:通过分子建模方式,首次构建出DoUBC9蛋白的基本模型,并通过不同的评价方式确定了以人泛素结合酶E2 H结构(2Z5D)为模板的为最优模型。     

Expression of a chimaeric granule-bound starch synthase-GUS gene in transgenic potato plants

Granule-bound starch synthase is the key enzyme in amylose synthesis. The regulation of this gene was investigated using a chimaeric gene consisting of a 0.8 kb 5 upstream sequence of the granule-bound starch synthase gene from potato and the -glucuronidase gene which was introduced into potato using an Agrobacterium tumefaciens binary vector system. The chimaeric gene was highly expressed in stolons and tubers, whereas the expression in leaves, stems or roots from greenhouse-grown plants was relatively low. However, leaves from in vitro grown plantlets exhibited an elevated GUS expression. The expression of the chimaeric gene was inducible in leaves by growth on relatively high concentrations of sucrose, fructose and glucose and was about 30- to 50-fold higher than in leaves from greenhouse-grown plants. The granule-bound starch synthase gene is expressed organ-specifically since stolons and tubers showed GUS activities 125- to 3350-fold higher than in leaves. The activities in these two organs are 3- to 25-fold higher than the expression of the CaMV-GUS gene. Histochemical analysis of different tissues showed that only certain regions of leaves and roots express high GUS activities. Stolons and tubers show high expression.     

沙鞭PvDREB基因克隆与表达特异性分析

基于沙鞭的三代转录组数据,该研究利用PCR技术克隆DREB基因,并对其进行生物信息学分析;采用实时荧光定量PCR分析该基因的表达模式以及在20%PEG-6000模拟干旱胁迫处理下的表达特征,以探讨干旱胁迫下沙鞭DREB转录因子的功能和作用,为揭示PvDREB基因响应沙鞭的耐旱分子机制奠定基础。结果表明：(1)成功克隆获得一个沙鞭DREB基因,命名为PvDREB;PvDREB基因编码区长度831 bp、编码276个氨基酸,含有典型的AP2转录因子保守结构域;PvDREB蛋白是亲水性蛋白,不具有信号肽结构,存在跨膜结构和可能的糖基化及磷酸化位点。(2)系统进化分析显示,PvDREB基因与毛竹的DREB亲缘关系较近。(3)亚细胞定位预测表明,PvDREB蛋白定位于线粒体和细胞核中。(4)qRT-PCR显示,沙鞭根、茎和叶中PvDREB均可诱导表达但差异较大,且在茎中表达量最高,叶中次之,根中最低,具有明显的组织特异性;20%PEG-6000模拟干旱下,PvDREB基因在叶中的表达量随干旱胁迫时间增加而增加,12 h时达到最高,之后逐渐下降。研究推测,沙鞭PvDREB基因受干旱胁迫诱导表达,且...     

银杏bHLH91转录因子基因的克隆及表达分析

bHLH转录因子在植物的生长发育、胁迫应答和次生代谢中具有重要的调控作用。该研究通过PCR技术从银杏(Ginkgo biloba)叶中分离得到了一个bHLH基因的cDNA序列,并将其命名为GbbHLH91。序列分析结果显示扩增的GbbHLH91基因cDNA序列长度为1 425 bp,开放阅读框是1 065 bp,编码354个氨基酸,分子量为40.1 kDa,等电点为8.20。系统进化分析结果显示,从用于进化树构建的bHLH蛋白质聚类情况来看,银杏GbbHLH91蛋白与裸子植物油松(Pinus tabuliformis)bHLH蛋白亲缘关系最近,且与被子植物无油樟(Amborella trichopoda)bHLH蛋白相似性达到60%,表明该基因在进化过程中相对比较保守。实时荧光定量PCR分析发现银杏bHLH91基因在银杏的各个组织中均有表达,其中在银杏叶中表达量最高,在根和茎中基因的表达量次之,在银杏雌花和果中表达量较少,在雄花中的表达水平最低;GbbHLH91基因在不同发育时期的银杏叶片中,表达量也存在一定的差异,其中在4月中旬该基因的表达水平达到最高,而后随着叶片的生长发育,该基因的表达水平呈现下降趋势。该研究结果为进一步验证GbbHLH91基因的功能奠定了前期基础。     

Magnesium deficiency in sugar beets alters sugar partitioning and phloem loading in young mature leaves

Magnesium deficiency has been reported to affect plant growth and biomass partitioning between root and shoot. The present work aims to identify how Mg deficiency alters carbon partitioning in sugar beet (Beta vulgaris L.) plants. Fresh biomass, Mg and sugar contents were followed in diverse organs over 20 days under Mg-sufficient and Mg-deficient conditions. At the end of the treatment, the aerial biomass, but not the root biomass, of Mg-deficient plants was lower compared to control plants. A clear inverse relationship between Mg and sugar contents in leaves was found. Mg deficiency promoted a marked increase in sucrose and starch accumulation in the uppermost expanded leaves, which also had the lowest content of Mg among all the leaves of the rosette. The oldest leaves maintained a higher Mg content. [¹⁴C]Sucrose labelling showed that sucrose export from the uppermost expanded leaves was inhibited. In contrast, sucrose export from the oldest leaves, which are close to, and export mainly to, the roots, was not restricted. In response to Mg deficiency, the BvSUT1 gene encoding a companion cell sucrose/H⁺ symporter was induced in the uppermost expanded leaves, but without further enhancement of sucrose loading into the phloem. The observed increase in BvSUT1 gene expression supports the idea that sucrose loading into the phloem is defective, resulting in its accumulation in the leaf.     

夏枯草PvGGPPS基因的克隆和诱导表达分析

为探究夏枯草中GGPPS基因的生物学特性及功能,该文在夏枯草转录组测序的基础上设计特异性引物,采用逆转录PCR技术获得夏枯草中GGPPS基因的全长核苷酸序列,并进行生物信息学分析;采用qPCR法分析PvGGPPS基因在不同外源性物质诱导下在夏枯草果穗中的表达量以及该基因在夏枯草不同组织中的表达量。结果表明:PvGGPPS基因开放阅读框1 092 bp,编码363个氨基酸,理论分子量为38 815.68 D,等电点为5.69。PvGGPPS蛋白具有异戊烯基焦磷酸合酶家族的特征结构域。系统进化树表明PvGGPPS蛋白与丹参、毛喉鞘蕊花GGPPS蛋白具有较高的亲缘关系。qPCR分析表明,PvGGPPS基因在叶中表达量高于果穗及茎。对果穗施加7种外源性物质处理24 h后,GA3处理组该基因表达量升高。PvGGPPS基因在夏枯草不同组织中表达量差异较大,且受外源物质诱导表达。该研究结果为进一步研究PvGGPPS基因对夏枯草萜类成分合成途径中的功能及表达调控奠定基础。     

Molecular cloning and expression of the hot pepper ERabp1 gene encoding auxin-binding protein

The 22 kDa auxin-binding proteins in higher plants have received considerable attention as candidates for an auxin receptor. A cDNA clone Ca-ERabp1 of hot pepper (Capsicum annum) was isolated using the oligonucleotides as PCR primers. The cDNA codes for a polypeptide related to the major 22 kDa auxin-binding protein from maize and Arabidopsis ERabp1. The deduced amino acid sequence contains an endoplasmic reticulum retention signal, the KDEL sequence located at the C-terminal end, and has two possible auxin-binding sites, HRHSCE and YDDWSVPHTA conserved sequences. Northern hybridization analysis revealed that the Ca-ERabp1 gene is differentially expressed in total RNA isolated from different organs of a pepper plant, showing the highest level of expression in fruits but barely detectable in leaves and roots.