香蕉MaCAM基因克隆及表达分析

从香蕉根的cDNA文库中获得了一段香蕉钙调蛋白基因的片段,采用RACE技术获得其全长,命名为MaCAM。该基因全长845bp,编码149个氨基酸。生物信息学分析表明,该蛋白属稳定蛋白,其等电点为4.12,有2个保守的EFh功能结构域。与已知植物的钙调蛋白基因相比,一致性达90%以上。其中与粳稻、油棕、胡萝卜、甘蔗的CAM编码的氨基酸序列的一致性分别为99.33%、96.71%、98.00%、98.66%。系统进化树比对分析显示,香蕉与甘蔗的亲缘关系最为密切。器官特异性分析表明,MaCAM在香蕉的根、球茎、叶片、花和果实中均有所表达,在根中表达量最高,花中次之,而在叶片中的表达量最低。     

甘蔗细胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其表达分析

对甘蔗(Saccharum officinarum L.)叶片全长cDNA文库进行测序,获得了1个细胞质型苹果酸脱氢酶(cMDH)基因的全长cDNA序列,命名为Sc-cMDH。生物信息学分析表明,该基因全长1314 bp,开放阅读框为999 bp,编码332个氨基酸。Sc-cMDH与其他植物cMDH的氨基酸序列同源性高达86.5%～97.0%。Sc-cMDH包含典型的NAD+结合基元T11GAAGQI17和催化基元I184WGNH188,还有相当保守的6个半胱氨酸残基,因此推断该基因为细胞质型NAD-MDH。定量PCR分析结果表明,该基因在甘蔗叶片和根中的表达量高于茎。     

香蕉钙调蛋白基因MaCAM在非生物胁迫下的表达分析

为研究香蕉钙调蛋白基因MaCAM的功能,对香蕉幼苗进行盐、低温和干旱胁迫处理,利用荧光定量PCR技术分析香蕉根中钙调蛋白基因MaCAM在上述不同非生物胁迫条件下的表达特性.盐胁迫处理后MaCAM表达随时间延长为先增加后降低趋势,在处理4 h时表达量最高;低温胁迫处理后,MaCAM的表达量随温度降低呈梯度增加,在温度降至5℃时表达量在处理范围内达最大值;干旱胁迫处理后,MaCAM的表达量随胁迫程度增加也是呈梯度增加,重度干旱胁迫时在处理范围内表达量最高.说明香蕉中的钙调蛋白基因具有响应非生物胁迫的能力,可能在香蕉适应盐、低温和干旱等胁迫逆境中发挥重要作用,参与了香蕉幼苗抗逆性调控.     

香蕉谷氨酸脱羧酶基因克隆与表达

根据抑制缩减杂交文库获得的香蕉谷氨酸脱羧酶基因片段,利用RACE技术,首次从香蕉果实中克隆了谷氨酸脱羧酶基因的cDNA全长.结果表明,该cDNA的ORF全长1 500 bp,编码499个氨基酸.Blast分析表明,该基因所推导的氨基酸序列与水稻、柑橘、白杨、番茄等具有较高的一致性,分别为82%、81% 、79% 、78%,推测其编码的蛋白质分子量为56.25 kD,等电点5.21,具有与钙调蛋白结合的C端延伸区域和磷酸吡哆醛结合位点.组织特异性和果实采后正常成熟不同阶段表达结果显示,该基因在香蕉根、茎、叶、花、果实中均有表达,果实中的表达量较高,正常成熟表达量的增加可能受内源乙烯诱导并促进乙烯生物合成,推测其可能在不同的生理过程中起作用,并且与果实成熟及乙烯生物合成密切相关.     

逆境胁迫下甘油醛-3-磷酸脱氢酶功能多元化的研究进展

糖酵解是动植物以及微生物细胞中葡萄糖分解产生能量的共同代谢途径,而甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)作为糖酵解途径中的一种关键酶,被认为是只存在于细胞质中的管家基因产物。但近年来的研究表明GAPDH mRNA和蛋白质水平会随着各种环境因素的影响而发生变化,并具有不同的亚细胞定位以及多元化的生理功能。本文综述逆境胁迫下GAPDH在不同生物体细胞中的不同功能的相关作用机制。     

一类依赖于NAD的玉米胞质型苹果酸脱氢酶基因的克隆及其序列分析

苹果酸脱氢酶普遍存在于各种生物中,它负责催化草酰乙酸和苹果酸之间的相互转换.根据其辅酶的特异性和在细胞内的分布及其生理功能的不同,苹果酸脱氢酶在高等植物中可以区分出不同的类型,依赖于NAD的细胞质型苹果酸脱氢酶是其中研究较少的一类.根据已发表的其他高等植物的依赖于NAD的胞质型苹果酸脱氢酶基因的保守序列,运用SMART RACE RT-PCR技术,从玉米叶片中分离了cyMDH 的1 264 bp全长cDNA序列,通过生物信息学分析发现,该序列含有一个999 bp的完整的开放阅读框,其共编码332个氨基酸(GenBank登陆号 EU625276).序列联配与树状分析结果表明,该玉米cyMDH 序列与多个物种的cyMDH 基因具有高度的同源性.组织特异性表达分析显示MDH基因在玉米叶片中表达量最高,在茎、根中亦有低水平表达.本研究将为更深入的研究玉米cyMDH 基因的分子调控机理奠定基础.     

一个深黄被孢霉苹果酸脱氢酶基因的克隆与表达

根据转录组测序结果设计特异性引物,以深黄被孢霉(Mortierella isabellina)M6-22的c DNA为模板,PCR扩增苹果酸脱氢酶基因MIMDH2,测序结果显示该序列长1 017 bp,编码338个氨基酸。序列分析表明该序列与已报道的烟曲霉(Aspergillus fumigates)线粒体苹果酸脱氢酶的相似性最高,达71.26%,且含有苹果酸脱氢酶的保守辅酶结合位点、底物结合位点和催化活性位点。将MIMDH2片段连接到表达载体pET32a(+)中,构建重组表达质粒pET32a-MIMDH2,并转化至大肠杆菌BL21中进行诱导表达,SDS-PAGE电泳检测结果显示在50 k D左右处有一蛋白质条带,酶活分析结果显示经镍柱亲和层析纯化的重组蛋白酶活高达271.33 U/mg。以上结果说明所克隆的MIMDH2为一个新的潜在的苹果酸脱氢酶基因,所编码的蛋白质具有苹果酸脱氢酶的活性。     

植物苹果酸脱氢酶研究进展

苹果酸是植物体内参与C4循环、景天酸循环等众多代谢途径的关键代谢物。苹果酸含量提高的途径主要来自植物体内合成的提高。苹果酸脱氢酶(MDH)可引起草酰乙酸盐的氧化作用以形成苹果酸盐,增加植物体内苹果酸的含量,从而显著提高植物体的耐酸性以及对铝毒的抗性。本文全面回顾了国内外对苹果酸脱氢酶(MDH)在植物生理学、生物化学、分子生物学、系统分化领域的研究进展,并针对其在植物体耐酸性机制机理研究领域所取得的研究成果进行了追溯。     

蜜蜂（Apis）苹果酸脱氢酶同工酶的研究进展

苹果酸脱氢酶（MDH）是糖代谢中重要的酶。在西方蜜蜂（Apis mellifera L.）中,MDH分为3个区带MDHⅠ、MDHⅡ和MDH Ⅲ。不同级型和不同发育阶段,MDHⅠ和MDH Ⅲ变化不大;MDHⅡ呈现多态现象,由a、b、c3个等位基因编码。东方蜜蜂（A.cerana F.）的MDH由S、F两个等位基因编码,也有报道它是单态性的。MDH在西方蜜蜂研究中应用较多,主要有处女王交配次数;蜂群中的劳动分工;蜜蜂种群遗传组成分析等。MDH和分子生物学的结合研究势必将推动蜜蜂研究的深入和发展。 Research Progress in Malate Dehydrogenase(MDH) of Honeybees LIU Yan-he1,ZHANG Chuan-xi1,XU Bao-hua2,3,CHEN Sheng-lu1 1.Institute of Applied Entomology,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China; 2.College of Animal Science,Zhejiang University,Hangzhou 310029,China; 3.College of Animal Sciences,Shandong Agricaltural University,Taian 271018,China Abstract:Malate dehydrogenase(MDH) is an important enzyme in glycometabolism.MDH of Apis mellifera showed three enzyme active zones,MDHⅠ,MDHⅡand MDHⅢ.MDHⅠand MDHⅢ maintained relative stability in different castes and developmental phases,but MDHⅡwas polymorphic,and controlled by three alleles,a,b and c.MDH of Apis cerana was coded by S and F alleles,but some authors reported it is monomorphic.MDH was applied to the studies of A.mellifera,which included several aspects as follows:the number of queen matings,labor division in honeybee societies,the analysis of genetic constitution in honeybee populations and so on.The combination of both MDH and molecular biology will certainly promote honeybee studies. Key words：honeybees;malate dehydrogenase(MDH)     

辣椒CaWRKY8基因克隆及胁迫下的表达分析

为了揭示辣椒WRKY基因功能,以辣椒PI201234为实验材料,克隆得到WRKY基因全长1 647bp的cDNA序列,命名为CaWRKY8。生物信息学分析表明,该基因含有一个1 647bp完整开放阅读框(ORF),编码548个氨基酸残基。氨基酸序列分析显示,CaWRKY8编码的蛋白含有2个WRKY结构域,属于Group I。氨基酸序列比对结果表明,CaWRKY8与辣椒WRKY25、马铃薯WRKY、番茄基因组中预测的WRKY26、烟草基因组中预测的WRKY33和猕猴桃WRKY的氨基酸序列之间均具有高度的保守性。实时荧光定量分析表明,CaWRKY8受盐、高温、干旱和辣椒疫霉菌诱导表达;其中CaWRKY8的表达量在盐和干旱处理下3h达到峰值,分别是对照的2.38倍和121.10倍,在高温和疫霉菌处理下12h达到峰值,分别是对照的6.12和6.81倍。以上研究结果表明,CaWRKY8基因在辣椒响应胁迫进程中发挥着重要作用。     

香蕉MaSNAT2基因的克隆与表达分析北大核心CSCD

5羟色胺-N-乙酰转移酶(SNAT)是褪黑素合成过程中的关键酶之一。为揭示香蕉SNAT基因的功能,该研究对香蕉SNAT进行了全基因组鉴定,获得其中2个成员(MaSNAT1和MaSNAT2)并对它们进行克隆验证,结果发现仅MaSNAT2表达。对MaSNAT2进行了系列生物信息学分析,并通过实时荧光定量PCR技术研究其在MeJA、ABA、GA_(3)、褪黑素及低温处理下的表达模式。结果显示:(1)MaSNAT2基因CDS长度为741 bp,编码246个氨基酸;MaSNAT2蛋白定位于叶绿体,具有GNAT超家族典型保守Acetyltransf_7结构域;MaSNAT2二级结构主要由α螺旋、β折叠和无规则卷曲组成,三级结构与水稻OsSNAT相似度为81.60%。(2)MaSNAT2蛋白与小果野蕉SNAT相似度最高,亲缘关系最近;MaSNAT2启动子具有MeJA、ABA和GA_(3)等激素响应元件。(3)qRT-PCR结果显示,MaSNAT2基因的表达受ABA抑制;GA_(3)处理8 h和48 h后MaSNAT2表达量分别升高15.1倍和16.2倍;MeJA处理4 h后MaSNAT2表达量提高至5.2倍;褪黑素及低温处理能显著诱导MaSNAT2的表达。研究表明,MaSNAT2属于GNAT超家族,其表达受GA_(3)和MeJA诱导,受ABA抑制;该基因在香蕉响应低温胁迫过程中也发挥重要作用。     

茶树CsGIF1基因的克隆及其对非生物胁迫的响应分析

GRF-INTERACTING FACTOR(GIF)基因是植物叶发育相关的一类重要调控因子,调节植物叶器官的发育。该研究采用RT-PCR方法从茶树‘龙井43’的叶片cDNA中克隆得到CsGIF1基因,并利用荧光定量PCR分析了高温(38℃)、低温(4℃)、干旱(200g·L-1 PEG)、盐胁迫(200mmol·L-1 NaCl)下CsGIF1基因的表达水平,以明确CsGIF1基因对非生物胁迫的应答特性,为茶树CsGIF1基因的逆境调控以及功能研究奠定基础。结果表明:(1)CsGIF1基因长666bp,编码221个氨基酸,具有高度保守的SNH结构域;CsGIF1蛋白为亲水性蛋白,理论相对分子质量为23 380,理论等电点为6.30;酸性氨基酸、碱性氨基酸、芳香族氨基酸和脂肪族氨基酸所占比例分别为7%、9%、5%和13%;蛋白质二级结构显示,茶树CsGIF1蛋白由38.01%的α-螺旋、10.41%的β-折叠、12.22%的延伸主链和39.37%的随机卷曲组成。(2)qRT-PCR分析显示,茶树CsGIF1基因对于4种非生物胁迫均有响应,但不同处理响应不同。其中在胁迫2h时,高温和低温胁迫下,CsGIF1基因相对表达量显著增加,分别为对照的3.54和5.69倍,且高低温胁迫下,CsGIF1基因响应明显大于干旱和盐胁迫。在高温、低温、干旱、盐等不同胁迫处理下,茶树‘龙井43’中CsGIF1基因的表达水平与对照相比均差异明显。     

石榴PgGPX基因克隆及盐胁迫下的表达分析

该研究以‘红玉石籽’籽粒为材料,通过RACE技术克隆了石榴GPX基因,利用Real-time PCR检测石榴在不同器官中及石榴叶片在盐胁迫处理下的相对表达量。结果表明:(1)PgGPX基因cDNA全长872bp,其中开放阅读框504bp,编码168个氨基酸。生物信息学分析显示,该蛋白具有植物GPX的典型结构,与可可树、荔枝、甜橙、玉米等植物的GPX基因相比,具有较高的一致性,分别为90.30%、87.40%、86.80%、86.20%。(2)PgGPX在石榴的叶片、花瓣和籽粒中均有所表达,且具有组织特异性,在盐胁迫下,石榴叶片中的PgGPX表达量显著上升。推测PgGPX基因在胁迫反应中可能发挥重要作用。     

蒙古冰草Lhcb1基因克隆及干旱胁迫下的表达分析

利用同源序列从蒙古冰草(Agropyron mongolicum Keng)克隆得到1个光合作用叶绿体结合a/b基因,命名为MwLhcb1。MwLhcb1基因cDNA全长1 138bp,包含801bp开放阅读框,编码267个氨基酸,蛋白分子量为28.21kD,等电点4.92。该蛋白二级结构中具有Lhcb基因家族的保守结构域。MwLhcb1蛋白氨基酸序列与其他物种同类蛋白相似性均在87%以上,其中与小麦同类蛋白相似性程度最高达99%。实时荧光定量PCR结果显示,MwLhcb1基因主要在茎叶中表达,在根中表达量极少,干旱胁迫影响MwLhcb1基因表达。该研究结果为进一步研究MwLHcb1在蒙古冰草光合作用与抗旱性中的功能奠定了基础,并从基因遗传进化角度证实了蒙古冰草是小麦野生近缘种的观点,从而提出蒙古冰草是小麦抗性改良的理想基因供体。     

玉米ZmSOD基因克隆及其在干旱胁迫下的表达

为探讨超氧化物歧化酶(superoxide dismutase,SOD)基因在玉米抗逆反应中的作用,研究选用2个抗旱性有明显差别的玉米品种为试验材料,采用RT-PCR、实时荧光定量PCR(qRT-PCR)及二维凝胶电泳(2-DE)耦联的基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱(MALDI-TOF)法,对ZmSOD基因的序列结构及其在干旱胁迫下的表达特性进行分析。结果表明：(1)从干旱敏感品种‘登海605’(DH605)和抗旱品种‘蠡玉35’(LY35)玉米叶片中分别成功克隆出ZmSOD1和ZmSOD2基因。DH605中ZmSOD1开放阅读框(ORF)全长456 bp,编码151个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.76,分子量为15.05 kD。LY35中ZmSOD2ORF全长459 bp,编码152个氨基酸,编码的蛋白等电点为5.65,分子量为15.11 kD;ZmSOD1和ZmSOD2是亲水性稳定蛋白,都含有Cu/Zn-SOD结构域,蛋白序列N端无信号肽及无跨膜结构域。同源性和系统进化分析表明,玉米ZmSOD和谷子Cu/Zn-SOD2的亲缘关系最近,相似性高达96.05%。(2)在干旱条件下,ZmSOD1在DH605中转录水平明显降低,LY35中ZmSOD2转录水平显著升高;2-DE耦联的质谱分析显示：ZmSOD1在DH605中表达量明显降低,LY35中ZmSOD2表达量无显著性变化,却检测到Mn-SOD蛋白表达量显著增加。(3)相关分析显示,干旱条件下,DH605叶片中ZmSOD1转录水平和其蛋白丰度及SOD酶活性呈极显著性正相关,LY35叶片中ZmSOD2转录水平与SOD酶活性呈显著性正相关。研究结果为进一步探索SOD基因在调节玉米抗性以及逆境胁迫应答过程中的作用机制提供了基础。     

福州野生蕉FeSOD家族基因的克隆及在低温胁迫下的表达分析

以抗寒性较强的福州野生蕉为材料,采用RACE和RT-PCR扩增得到铁超氧化物歧化酶(FeSOD)家族基因(FeSOD)的2个成员共4条转录本,分别命名为MuFSD1A(登录号JX844026)、MuFSD1B(登录号KJ786318)、MuFSD1B-variant1(登录号KJ786319)和MuFSD1B-variant2(登录号KJ786320)。MuFSD1A基因cDNA全长为1 277bp,编码300个氨基酸;MuFSD1B基因cDNA全长为1 378bp,编码260个氨基酸。基因结构分析表明MuFSD1B-variant1和MuFSD1B-variant2为MuFSD1B的可变剪接转录本。生物信息学和亚细胞定位分析显示,MuFSD1A和MuFSD1B主要定位于叶绿体,但他们的理化性质、磷酸化位点、蛋白结构等存在差异。序列比对分析发现MuFSD1A和MuFSD1B相似性仅为33.33%,但都具有保守的金属结合位点和FeSOD的特征氨基酸。进化树分析显示,MuFSD1A和MuFSD1B聚在不同的分支中。qRT-PCR分析表明,低温诱导MuFSD1A基因的表达而抑制MuFSD1B基因的表达,且MuFSD1A基因的相对表达量随着温度的降低而显著增加,说明该成员可能在香蕉抗寒中起主要作用。     

转香蕉MaASR1基因的拟南芥株系在干旱胁迫条件下的表达谱分析

干旱是最重要的环境胁迫,香蕉MaASR1基因在植物响应逆境胁迫时发挥着重要作用,为了深入研究MaASR1基因的过表达使拟南芥抗旱的分子机制,利用全基因组表达芯片来广谱的筛选MaASR1基因转入后自然条件下及干旱处理条件下差异基因的表达情况。对基因芯片的结果进行了详细的生物信息学分析及相关基因的RT-PCR验证,结果表明MaASR1基因异源表达的拟南芥株系在自然生长条件下共有747个差异基因,其中上调基因559个,下调基因188个;在干旱胁迫条件下共得到653个差异基因,其中上调基因256个,下调基因397个;MaASR1基因的转入可以通过影响激素、光合作用、锌指蛋白及不依赖ABA途径的DREB2A等相关基因的表达来提高拟南芥的抗旱性。为解析MaASR1基因作为转录因子提高植物抗旱能力的分子机制奠定基础。     

苦荞锌指蛋白基因FtLSD1的克隆及其对非生物胁迫的应答

根据苦荞(Fagopyrum tataricum)花期转录组数据,分别以苦荞DNA和cDNA为模板,克隆得到1个苦荞C2C2型锌指蛋白基因FtLSD1(GenBank登录号KP252134)的DNA序列和cDNA序列,采用实时荧光定量PCR方法,研究了FtLSD1基因在非生物胁迫下的表达模式。结果显示:苦荞FtLSD1基因DNA全长2 427bp,由6个外显子和5个内含子构成,符合GU-AG剪切原则;cDNA序列包含一个528bp开放阅读框,编码175个氨基酸,具有LSD1家族的典型结构域;UV-B照射和水杨酸处理均能使FtLSD1基因的表达量上升,且UV-B处理在6h达到最大,为0h(CK)的3.84倍;水杨酸处理于10h达到最大,为0h(CK)的3.44倍,而4℃冷胁迫下该基因表达量保持稳定。推测该基因可能参与苦荞抗UV-B和高浓度水杨酸等非生物胁迫的应答反应,为苦荞的抗逆性研究提供新的视角。