催乳素受体基因与羊驼繁殖性能关系的初探

通过氯仿/异戊醇法制备羊驼血液基因组DNA,采用PCR方法首次扩增出羊驼催乳素受体基因(prolactin receptor gene,PRLR)exon8-exon9序列(GenBank登录号为DQ198164),该片段长度为622bp。通过NCBI blast(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)比较,结果表明:该序列包括exon8的82bp、intron8全序列472bp和exon9的68bp。同源性比较发现,羊驼PRLR基因exon8和exon9核苷酸序列与其它哺乳动物的相应区域的同源性特高,均≥92%;同时还发现羊驼exon8引物后第19个碱基为G,而其它哺乳动物(猪除外)均为A,猪则是在羊驼exon8引物后的第34个碱基处由G变为A,通过推导氨基酸序列分析发现,这种单碱基的突变使得羊驼与其它哺乳动物相比,该处的氨基酸由亮氨酸取代了异亮氨酸;在羊驼exon9引物前第22个碱基处也发生了A-G碱基替换现象,但这个碱基的突变发生在密码子的第3个碱基上,编码的氨基酸均为脯氨酸。在这些动物中只有羊驼为单胎动物,羊驼exon8核苷酸序列中A-G的碱基替换并引起编码氨基酸序列发生改变是否与羊驼繁殖性能有关还有待进一步研究。     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒.利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较.preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸).对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同.认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关.     

大黄鱼与小黄鱼细胞色素b基因全序列的比较分析

对大黄鱼、小黄鱼线粒体细胞色素b基因进行了PCR扩增及序列测定,得到1140bp的全序列。大黄鱼和小黄鱼的碱基组成相似,前者T、C、A、G含量分别为28.4%、33.0%、23.2%和15.4%,A+T含量为51.6%;后者T、C、A、G含量分别为26.7%、34.1%、23.8%和15.4%,A+T含量为50.5%。大、小黄鱼cytb基因中三联体密码子中碱基的使用频率很相似,第一位较均一,第二位富含T,第三位富含C。大小黄鱼cytb基因存在明显差异,序列相似性仅为88.95%;两序列间具有126个差异位点;碱基转换/颠换率为3.1,碱基替换多发生在密码子第三位;碱基转换中C\T显著高于A\G,表现出转换偏歧。     

狂犬病病毒SRV9疫苗株糖蛋白核酸序列及抗原特性研究

狂犬病病毒SRV9株是经克隆获得的中等蚀斑口服弱毒疫苗候选株,具有安全和免疫原性较好等优点.本试验根据狂犬病病毒糖蛋白核苷酸5'末端和3'末端序列设计了一对引物,通过反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)分别扩增了SRV9及其母源株SAD B19糖蛋白的全长cDNA.测序结果表明,SRV9和SAD B19糖蛋白cDNA读框长1575bp,编码524氨基酸残基的多肽.通过和其母源株SAD B19核苷酸序列比较发现,SRV9的158、575、931位碱基分别出现了G→A、A→G和A→G的转换,相应地导致第53位、192位、311位氨基酸出现了Gly→Glu、His→Arg、Thr→Ala突变;和我国现行的犬用疫苗株ERA的核苷酸和氨基酸比较,有10个碱基不同,7个氨基酸发生改变.经Jameson-Wolf抗原表位优势图分析发现,SRV9在192位氨基酸的改变,导致该部位产生了一个新的潜在抗原位点.由于狂犬病病毒糖蛋白是诱导机体产生中和抗体唯一抗原,因此,上述氨基酸的改变可能与其特殊的蚀斑特性和其安全性提高有关.保持对毒株的氨基酸序列分析也是监测其特性的重要手段之一.     

乙脑病毒持续感染株preM区序列分析

为了研究乙型脑炎病毒持续感染株preM区域基因序列变异及其意义,我们将两种乙脑病毒野生株(JaGAr-01株和Nakayama株)分别感染人肝癌KN73细胞,经过多次细胞传代后建立乙脑病毒持续感染模型,收集感染细胞经反复冻融获取变异病毒。利用preM区特异引物进行RT-PCR法得到两种病毒的preM区基因片段,应用基因测序反应进行序列分析,并对两种病毒株preM区序列进行比较。preM区基因测序结果显示,与JaGAr-01野生株比较,JaGAr-01持续感染变异株(JaG-per)有1个核苷酸上碱基发生变异(第26位U→G)并导致相应氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸);Nakayama持续感染变异株(Nak-per)与其野生株相比则有11个核苷酸上碱基存在差异(第26位U→G,第37位G→A,第39位C→U,第45位U→C,第51位U→C,第99位U→C,第126位U→C,第165位C→U,第189位C→U,第195位C→U,第198位U→C),但仅有其中第26位、第37位、第39位的碱基变异引起相应编码的氨基酸发生置换(第9位亮氨酸→精氨酸及第13位缬氨酸→异亮氨酸)。对比还发现变异后的JaGAr-01持续感染株与Nakayama持续感染株的基因序列相同。认为乙脑病毒持续感染变异株preM区存在基因变异,这种变异可能与该区参与病毒持续感染及维持病毒生物学特性有关。     

从Cyt b基因序列探讨Grophosoma属和Dybowskyia属的分类地位(半翅目:蝽科)

对蝽科11种昆虫的线粒体细胞色素b（Cyt b）基因部分序列进行测定和分析,在获得的长度为432bp的序列片段中,碱基T、C、 A、G的平均含量分别为38.8%、18.0%、31.6%和11.6%, A＋T平均含量为70.4%,明显高于G＋C含量（29.6 %）.密码子第三位点的A＋T含量高达86.1%.属种间序列变异丰富,有179个核苷酸位点发生变异,变异率为41.4%,碱基替换多发生于第三位点.以筛豆龟蝽Megacopta cribraria为外群构建的系统发育树表明：滴蝽属与蝽亚科其它属关系较远,条蝽属与蝽亚科其它属关系较近,结合形态特征与序列变异情况,支持将滴蝽属从蝽亚科划出并入舌盾蝽亚科,但条蝽属的分类地位仍需要进一步探讨.     

桉树EST序列中微卫星含量及相关特征

通过对桉树属（Eucalyptus）的10000条EST序列进行分析,在其中的1499条序列上共发现1775个微卫星重复序列。含有微卫星的EST序列约占序列总数的15%。此外,还发现桉树EST序列所含微卫星长度的变异速率与重复单元长度呈负相关;微卫星的丰度与重复单元长度也呈负相关（三碱基重复微卫星除外）。在桉树EST序列中,重复单元长度为三碱基的微卫星最为丰富。三碱基重复单元微卫星的过度富集可能是由于遗传密码选择所致。在微卫星的丰度及长度变异方面,桉树EST序列与杨树（Populus trichocarpa）基因组注释的转录序列随重复单元长度的变化呈现出相同的规律,但桉树EST序列中微卫星频率及三碱基重复微卫星的含量显著偏低,推测含微卫星的基因表达丰度极有可能低于不含微卫星的基因。通过对发现的所有微卫星位点进行引物设计,并对设计的引物进行PCR检测,结果表明所设计的引物具有极高的扩增成功率。     

桉树EST序列中微卫星含量及相关特征

通过对桉树属(Eucalyptus)的10 000条EST序列进行分析, 在其中的1 499条序列上共发现1 775个微卫星重复序列。含有微卫星的EST序列约占序列总数的15%。此外, 还发现桉树EST序列所含微卫星长度的变异速率与重复单元长度呈负相关; 微卫星的丰度与重复单元长度也呈负相关(三碱基重复微卫星除外)。在桉树EST序列中, 重复单元长度为三碱基的微卫星最为丰富。三碱基重复单元微卫星的过度富集可能是由于遗传密码选择所致。在微卫星的丰度及长度变异方面, 桉树EST序列与杨树(Populus trichocarpa)基因组注释的转录序列随重复单元长度的变化呈现出相同的规律, 但桉树EST序列中微卫星频率及三碱基重复微卫星的含量显著偏低, 推测含微卫星的基因表达丰度极有可能低于不含微卫星的基因。通过对发现的所有微卫星位点进行引物设计, 并对设计的引物进行PCR检测, 结果表明所设计的引物具有极高的扩增成功率。     

肿瘤MUC1/Y的克隆及其胞外段在大肠杆菌中的可溶性表达、纯化和鉴定

为获得MUC1 Y全长cDNA及其胞外段蛋白 ,以用于进一步的生物学功能及肿瘤生物学治疗的研究 .利用RT PCR从HeLa细胞中扩增MUC1 Y全长cDNA ;PCR扩增其胞外段 ,克隆到原核表达载体pGEX 2T ,转化DH5a菌 ,诱导表达 ;亲和层析纯化 ;凝血酶酶切、GST活性及N端蛋白测序鉴定 ;免疫家兔制备多克隆抗体 .所得MUC1 YcDNA的开放读框为 759bp ,登录于GenBank(AF12 552 5) .其信号肽编码序列缺失 9bp ,第 3 3 1位发生G A转换 ,造成缬氨酸突变为蛋氨酸 .表达获得约 4 0kD融合蛋白GST Yex ,占菌体总蛋白 2 5%～ 3 0 % ,其中 70 %～ 80 %为可溶性 ,经亲和层析一步纯化 ,纯度 >90 % ,GST比活性为 0 2 1U μg .凝血酶酶切后的N端蛋白序列测定表明与已知序列完全一致 ,抗血清ELISA效价为 1∶2 50 0 0 0 .结果表明 ,克隆到发生碱基缺失和突变的MUC1 Y全长cDNA ,获得MUC1 Y胞外段蛋白及其多抗 ,可进一步用于相关研究 .     

庚型肝炎病毒—中国河北分离株部分NS3区基因序列分析

在急慢性输血后肝炎、散发性肝炎及爆发型肝炎中,大约１０～２０％的病人不属于已发现的Ａ～Ｅ型肝炎,提示存在新型肝炎病毒。在美国１９９５年第４６届医学年会上,已有了一些有关庚型肝炎病毒（ＨＧＶ）分子生物学及庚型肝炎血清学方面的摘要报道。１９９６年初Ｌｉｎ...     

人Ⅱ型囊泡单胺转运体基因的克隆

目的 为获得人Ⅱ型囊泡单胞转运体（vesicular monomine transporter-2VMAT2)以治疗帕金森病,克隆添加Kozak序列的VMAT2cDNA,用于真核细胞表达。方法 从人胎脑中提取总RNA,逆转录成cDNA,设计一对引物用PCR方法扩增目的cDNA片段并将其重级一起pGEM-Easy-T载体中,酶切鉴定插入片段后,进行全序列测定。结果 RT-PCR扩增到1637bp的带有Kozak序列的cDNA片段。结论 克隆人VMAT2cDNA片断,可用于真核细胞表达。     

鼠疫耶尔森氏菌LcrV基因的克隆及序列分析

为了研究鼠疫耶尔森氏菌（Y.pestis）保护性抗原V蛋白,从基因库中查得Y.pestis LcrV基因DNA序列,针对序列设计合成了一对PCR扩增引物,以本所保存的Y.pestis菌种为模板进行基因扩增,结果获得长约980bp的DNA片段。将扩增产物回收纯化,克隆至pGEM-T载体,构建重组载体pGEN-T/ypV,经过PCR,酶切鉴定,并对pGEM-T/ypV中的V基因片段进行测序,分析测序结果与己知序列相同,表明获得了LcrV基因。     

不同花色矮牵牛细胞色素b5蛋白的cDNA克隆及序列分析

以云南不同花色矮牵牛的花瓣为材料,提取总RNA,用Oligo(dT)作为引物反转录合成cDNA第一链。以此为模板,用根据国外报道的矮牵牛细胞色素b5蛋白的cDNA序列设计合成的引物进行PCR扩,均扩增到一条约450bp的片段,分别克隆到pGEM-T载体上。对重组克隆进行序列分析,结果表明所克隆到的矮牛细胞色素b5蛋白的cDNA的编码区均含有447个核苷酸,编码149个氨基酸残基,与国外报道的一致;但其核苷酸及氨基酸的序列与国外报道的有所不同,即与国外的相比,紫红色、蓝紫色矮牵牛中的该cDNA的核苷酸有1个不同,而氨基酸完全相同;粉红色、白色矮牵牛中的3个核苷酸不同,并导致了2个氨基酸的不同。暗示该基因对花色的调控可能与其编码cDNA的一级结构有关。     

水稻草矮病毒核衣壳蛋白基因克隆及在大肠杆菌中的表达

水稻草状矮化病于70年代曾在南亚、东南亚大面积发生,给当地的水稻生产造成严重损失,在我国也有分布[1]。其病原是水稻草矮病毒(Ｒｉｃｅｇｒａｓｓｙｓｔｕｎｔｖｉｒｕｓ,ＲＧＳＶ),为纤细病毒属(Ｔｅｎｕｉｖｉｒｕｓ)的一个成员,病毒粒体丝状,由核衣壳蛋白和基因组ＲＮＡ组成[2]。基因组含六个ｓｓＲＮＡ片段,均为双义编码[3,4],其中ＲＮＡ5的毒义互补链编码核衣壳蛋白(ｎｕｃｌｅｏｃａｐｓｉｄｐｒｏｔｅｉｎ,ＮＣＰ)[3]。本文报道应用ＲＴＰＣＲ技术获得ＲＧＳＶ沙县分离株(ＲＧＳＶＳＸ)ＮＣＰ基因的ｃＤＮＡ克隆,并得到其在大肠杆…     

毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）克隆及正义植物表达载体的构建

以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）,序列分析表明该基因序列为3215bp, 与欧洲颤杨的PtCesA1基因同源性为97% 具有开放的阅读框,编码区在52~2985碱基之间,编码区为2925bp。通过同义突变引入BamHI酶切位点,将全长基因克隆到植物表达载体pBI121中,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确,为下一步ptoCesA1转基因功能研究打下了基础。     

中华蜜蜂蜂毒镇静肽基因的cDNA克隆和表达

从中华蜜蜂 (Apisceranacerana)工蜂毒腺中快速抽提总RNA ,用RT PCR扩增得到大小约为2 5 0bp的cDNA片段 ,测序得到的片段长度为 2 34bp ,为蜂毒前镇静肽原 (preprosecapin)基因编码区的cDNA .以 3′RACE方法 ,扩增和测定了 3′端非编码区 2 19bp序列 .中蜂前镇静肽原cDNA序列与已报道的欧洲意蜂该基因cDNA序列具有 92 %同源性 ,氨基酸序列具有 87%同源性 .代表成熟肽镇静肽的最后 2 5个氨基酸序列 ,中蜂与意蜂同源性为 88% .3′端非编码区cDNA序列与欧洲意蜂序列有 73 1%同源性 .将中华蜜蜂蜂毒镇静肽成熟肽编码区与 3′非编码区部分克隆 ,构建了镇静肽与谷胱甘肽转移酶融合表达的载体pGEX AcSecapin .将载体转化大肠杆菌BL2 1(DE3)进行融合表达 .表达产物与抗GST抗体在 2 9kD处有很强的交叉反应 .大肠杆菌超声破碎后的上清液用SDS PAGE检测到表达的蛋白多为可溶性融合蛋白 ,通过亲和层析柱纯化和凝血酶的切割得到了镇静肽蛋白     

毛白杨纤维素合成酶基因(PtoCesA1)克隆、序列分析及其植物表达载体的构建

以毛白杨形成层为材料克隆了毛白杨纤维素合成酶基因（PtoCesA1）,序列分析表明该基因序列为3215bp,与欧洲颤杨的PtCesA1基因同源性为97％具有开放的阅读框,编码区在52～2985碱基之间,编码区为2925bp。通过同义突变引入BamHI酶切位点,将全长基因克隆到植物表达栽体pBll21中,经酶切和PCR鉴定确认载体构建正确,为下一步ptoCesA1转基因功能研究打下了基础。     

Feline cytokines TNFα AND IL‐1β: PCR cloning and sequencing of cDNA

Abstract

Using oligonucleotide primers and polymerase chain reaction (PCR), cDNAs for feline cytokines TNFα and IL‐1β were amplified, cloned, and sequenced. The cDNA for PCR amplification was prepared from mRNA derived from lipopolysaccharide (LPS) stimulated feline bone marrow derived macrophages. PCR was performed using sets of oligonucleotide primers designed to specifically amplify cDNAs for IL‐1β or TNFα. PCR fragments were cloned into pGEM 3ZF(‐) or pCR 1000 vectors, sequenced and consensus nucleotide sequences reported.

The cDNA for feline TNFα had a 98.6% match with coding regions of a genomic clone for feline TNFα which was recently reported (McGraw, 1990). The two feline TNFα clones differ by 8 nucleotide base pair (bp) changes which result in 5 amino acid differences in the predicted protein sequence. A search of GenBank and EMBL determined that the feline TNFα cDNA consensus sequence had a 90, 86, 85, 82 and 83 percent overall match with human, porcine, ovine, mouse and goat TNFα cDNAs, respectively. The protein‐coding sequence for feline TNFα from start to stop codon is 702 bp in length and encodes a predicted protein of 233 amino acids with a molecular weight of approximately 25,446 daltons (precursor form of secreted form of TNFα).

The protein‐coding sequence for feline IL‐1β is 804 bp long and encodes a predicted protein of 267 amino acids with a molecular weight of 31,892 daltons (precursor form of secreted IL‐1β). The feline IL‐1β cDNA consensus sequence had an overall match of 79, 76, 77.5 and 77 percent with IL‐1β cDNA from human, bovine, rabbit and murine species, respectively.