汉滩病毒核蛋白的分段表达及抗原表位分析

在大肠杆菌中对汉滩病毒Ｓ基因４种不同长度片段的重组表达质粒进行诱导表达。结果表明表达的４种ＧＳＴ－ＮＰ融合蛋白均以不溶性包含体形式存在于茵体细胞内,表达量分别占菌体蛋白总量的２９－３６％,分子量分别约为７２ｋＤ、６６ｋＤ、５４ｋＤ和４４ｋＤＤ。Ｗｅｓｔｅｒｎ ｂｌｏｔ显示５４ｋＤ和７２ｋＤ融合蛋白用酶标记汉滩病毒ＮＰＭｃＡｂｌＡ８和抗ＧＳＴ ＭｃＡｂ ３Ｃ１１染色呈阳反应。６６ｋＤ和４４ｋＤ融合蛋     

汉滩病毒S基因的分段表达及其线性和构象型抗原表位分析

构建汉滩病毒76—118N蛋白及其分别从N-端和C-端缺失的共6个突变体,在大肠杆菌BL-21中进行表达,并对其中一些蛋白进行了纯化。通过Western blot、酶联免疫吸附试验(ELISA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,N蛋白及6个缺失突变体都与组特异性抗体L13F3呈阳性反应,而缺失突变体与型特异性抗体AH30呈阴性反应。构建汉滩病毒76—118N蛋白及其6个缺失突变体的真核表达载体,并在COS-7细胞中进行表达。通过间接免疫荧光试验(IFA)进行汉滩病毒N蛋白的抗原表位分析,病人血清与真核表达的N蛋白及6个缺失突变体呈阳性反应。而仅有N蛋白及缺失N端1～30位氨基酸序列的NPN30与型特异性抗体AH30呈阳性反应。证实组特异性抗体L13F3结合的抗原表位位于N端1～30位氨基酸;而C端抗原表位对于型特异性抗体AH30与N蛋白的识别和结合具有重要意义,缺失N端100位氨基酸序列可能破坏羧基端构象型表位,也可以影响N蛋白与AH30的结合。     

汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达

本文为建立分型检测方法,探讨了汉滩病毒(Hantaan virus,HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性。首先,分别构建编码HTNV核蛋白及其羧基端多肽的原核表达载体pRSETA—S、pRSETA—S—C;然后,将其转化入表达菌BL21(DE3)pLySs诱导表达,采用SDS—PAGE、Westem—blot进行鉴定。我们成功构建了pRSET A—S及pRSETA—S—C原核表达载体。SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达,呈不溶状态,Westem—blot显现目的蛋白具有良好的抗原性。为大量制备分型用核蛋白多肽抗原创造了条件。     

汉滩病毒核蛋白羧基端多肽原核表达载体的构建及表达

本文为建立分型检测方法,探讨了汉滩病毒(Hantaan virus, HTNV)核蛋白羧基端多肽的抗原性.首先,分别构建编码HTNV核蛋白及其羧基端多肽的原核表达载体pRSET A-S、pRSET A-S-C;然后,将其转化入表达菌BL21(DE3)pLySs诱导表达,采用SDS-PAGE、Western-blot进行鉴定.我们成功构建了pRSET A-S及pRSET A-S-C原核表达载体.SDS-PAGE显示目的蛋白大量表达,呈不溶状态,Western-blot显现目的蛋白具有良好的抗原性.为大量制备分型用核蛋白多肽抗原创造了条件.     

确定病毒B细胞抗原表位的策略

抗原表位是诱生免疫反应的抗原最基本单位,根据其功能的不同,可大致分为Ｂ细胞、Ｔｈ细胞及Ｔｃ细胞抗原表位。如何确立这些抗原表位是近年分子免疫学研究的热点。本文综述了有关确立病毒Ｂ细胞抗原表位的方法及策略,并评价了这些方法的优缺点及适用范围。     

狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位研究

为阐明狂犬病病毒CVS-11核蛋白B细胞线性抗原表位,本研究通过合成肽模拟B细胞线性抗原表位,采用免疫学方法对生物信息学分析获得的狂犬病病毒CVS-11核蛋白潜在B细胞线性抗原表位进行验证。结果显示,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355~369、385~400位氨基酸序列合成肽免疫小鼠血清经间接酶联免疫吸附试验(Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)检测抗多肽抗体效价达到1∶12 800以上;抗多肽抗体在免疫印迹试验(Western blot,WB)中识别变性狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原,在间接荧光抗体试验(Indirect fluorescent antibody,IFA)中识别感染BHK-21细胞的狂犬病病毒CVS-11核蛋白抗原。因此,狂犬病病毒CVS-11核蛋白355~369、385~400位氨基酸序列经证实为B细胞线性抗原表位。     

用免疫荧光单克隆抗体对脊髓灰质炎病毒抗原表位的分析

用间接免疫荧光与中和试验筛选出来的抗脊髓灰质炎2型与3型不同毒株的12个单克隆抗体,其中3个仅有免疫荧光活性,9个具有中和与免疫荧光活性。用免疫荧光活性的单克隆抗体进行试验,发现它们在识别特异性抗原表位方面与中和性单克隆抗体相似,显示出株特异的、几个毒株共同特异的或型特异的抗原表位。根据表位分布关系及特征,可以用来鉴别型内毒株的特征、毒株的抗原分析、抗原变异的研究以及疫苗相关病例的鉴别。所得结果与中和性单克抗隆抗体及T1-寡核苷酸指纹图谱分析一致。而免疫荧光单克隆抗体识别抗原表位的活性范围比中和性单克隆抗体更广。另外还发现某些兼有荧光与中和两活性的同一个单克隆抗体,用不同方法(IF与NT)进行试验时,与相同毒株出现不同表位反应,这点是值得引起注意需待进一步证实的重要问题。     

猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine, HA)的核苷酸序列, 设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个, 将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白, 核苷酸约为300 bp, 体外扩增该模拟蛋白基因, 插入到原核表达载体pET30a(+)中, 转染宿主菌诱导表达, 结果获得分子量为20 kD的表达蛋白, 该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠, ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor, HI)试验检测, 小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体, 同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组, 说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性, 为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。     

猪流感病毒抗原表位基因表达载体构建与免疫原性分析

根据猪流感病毒血凝素蛋白基因(Heamuglutinine, HA)的核苷酸序列, 设计、筛选HA蛋白氨基酸序列的主要表位多肽4个, 将4个片段以柔性连接串联成模拟蛋白, 核苷酸约为300 bp, 体外扩增该模拟蛋白基因, 插入到原核表达载体pET30a(+)中, 转染宿主菌诱导表达, 结果获得分子量为20 kD的表达蛋白, 该蛋白可与抗His-tag抗体、抗猪流感病毒H1N1、H3N2亚型高免血清发生免疫学反应。纯化后免疫小鼠, ELISA及血凝抑制(Heamuglutinine inhibitor, HI)试验检测, 小鼠产生针对多肽抗原的血清抗体, 同时还可检测到H1N1、H3N2亚型SIV血凝抗体。流氏细胞仪检测免疫组外周血淋巴细胞高于对照组, 说明该模拟蛋白具有与H1N1、H3N2亚型猪流感病毒相似的免疫原性及反应原性, 为H1N1、H3N2血清亚型猪流感病毒疫苗研制提供了新手段。     

副粘病毒Tianjin株NP蛋白的表达及分析

1999年,本实验室从群体性暴发的急性呼吸道感染素致死的普通棉耳绒猴肺组织中分离到一株副粘病毒,命名为副粘病毒 Tianjin株.经研究发现该动物中心的工作人员都有此病毒抗体,且正常人群(献血员)抗体阳性率高达46%,急性呼吸道感染的患儿抗体阳性率为19.28%,提示此病原体与人类可能有密切的关系.     

Linear and Conformation-Dependent Antigenic Sites on the Nucleoprotein of Rabies Virus

A set of 29 monoclonal antibodies (MAbs) specific for the rabies virus nucleoprotein (N protein) was prepared and used to analyze the topography of antigenic sites. At least four partially overlapping antigenic sites were delineated on the N protein of rabies virus by competitive binding assays. Indirect immunofluorescent antibody tests using MAbs with a series of rabies and rabies-related viruses showed that epitopes shared by various fixed and street strains of rabies virus were mainly localized at antigenic sites II and III, while epitopes representing the genus-specific antigen of Lyssavirus were widely presented at sites I, III and IV. All but one of seven MAbs specific for antigenic sites I, IV and bridge site (I and II) reacted with the antigen that had been denatured by sodium dodecyl sulfate or 2-mercaptoethanol, as well as with the denatured N protein in Western blotting assays. However, none of the MAbs against antigenic sites II and III reacted with the denatured antigen. These data indicate that antigenic sites I and IV, and sites II and III on the N protein of rabies virus are composed of linear and conformation-dependent epitopes, respectively.     

Morphology and Antigenic Properties of Recombinant Analogs of the Marburg Virus Nucleoprotein

The full-length gene for Marburg virus (MV) nucleoprotein (NP) was cloned in prokaryotic pQE32 under the control of the T5 promoter and in eukaryotic pTM1 under the control of the T7 RNA polymerase promoter. Recombinant NP was synthesized in Escherichia coliand in human kidney cell line 293 cotransfected with recombinant vaccinia virus vTF7-3 expressing T7 RNA polymerase. On evidence of electron microscopy with immune detection, recombinant NP formed tubules of two types in E. coliand of a single type in cell line 293. ELISA and immunoblotting with polyclonal and monoclonal antibodies revealed common antigenic determinants in recombinant NP and natural MV NP.     

Structural and Antigenic Analysis of a Truncated Form of the Herpes Simplex Virus Glycoprotein gH-gL Complex

The herpes simplex virus (HSV) gH-gL complex is essential for virus infectivity and is a major antigen for the host immune system. The association of gH with gL is required for correct folding, cell surface trafficking, and membrane presentation of the complex. Previously, a mammalian cell line was constructed which produces a secreted form of gHt-gL complex lacking the transmembrane and cytoplasmic tail regions of gH. gHt-gL retains a conformation similar to that of its full-length counterpart in HSV-infected cells. Here, we examined the structural and antigenic properties of gHt-gL. We first determined its stoichiometry and carbohydrate composition. We found that the complex consists of one molecule each of gH and gL. The N-linked carbohydrate (N-CHO) site on gL and most of the N-CHO sites on gH are utilized, and both proteins also contain O-linked carbohydrate and sialic acid. These results suggest that the complex is processed to the mature form via the Golgi network prior to secretion. To determine the antigenically active sites of gH and gL, we mapped the epitopes of a panel of gH and gL monoclonal antibodies (MAbs), using a series of gH and gL C-terminal truncation variant proteins produced in transiently transfected mammalian cells. Sixteen gH MAbs (including H6 and 37S) reacted with the N-terminal portion of gH between amino acids 19 and 276. One of the gH MAbs, H12, reacted with the middle portion of gH (residues 476 to 678). Nine gL MAbs (including 8H4 and VIII 62) reacted with continuous epitopes within the C-terminal portion of gL, and this region was further mapped within amino acids 168 to 178 with overlapping synthetic peptides. Finally, plasmids expressing the gH and gL truncations were employed in cotransfection assays to define the minimal regions of both gH and gL required for complex formation and secretion. The first 323 amino acids of gH and the first 161 amino acids of gL can form a stable secreted hetero-oligomer with gL and gH792, respectively, while gH323-gL168 is the smallest secreted hetero-oligomer. The first 648 amino acids of gH are required for reactivity with MAbs LP11 and 53S, indicating that a complex of gH648-gL oligomerizes into the correct conformation. The data suggest that both antigenic activity and oligomeric structure require the amino-terminal portions of gH and gL.     

小鼠肝炎病毒N基因的原核表达和免疫活性初步分析

目的对小鼠肝炎病毒（mouse hapetitis virus）A59毒株核蛋白（N）基因进行了克隆、表达和重组蛋白的免疫活性分析。方法根据GenBank公布的MHV-A59 N基因序列（AY700211）,设计了一对特异性引物,通过RT-PCR扩增出N基因的主要抗原片段NS,将目的片段纯化后与pGEM-T-easy载体连接得到重组质粒pTN,双酶切回收目的基因片段克隆到原核表达载体pGEX-6p-1中,构建了重组质粒pGEX-NS,转化大肠杆菌BL21,用IPTG进行了诱导表达。对表达裂解物进行SDS-PAGE和Western-blotting验证。结果表达产物相对分子质量约56×103与预期相符;能与MHV阳性血清发生特异性反应,出现单一条带。结论原核表达的NP（S）蛋白有良好的抗原性,为检测小鼠肝炎病毒抗体的ELISA检测方法的研究奠定了基础。     

IRE1结构域分析及截短型载体的构建和表达

目的 克隆IRE1基因,根据IRE1基因不同生物学功能的4个结构域构建截短型真核表达载体,并用生物信息学方法对其蛋白产物进行分析.方法 应用PCR重组技术,以pCMV-IRE1为模板扩增IRE1全长及4个截短型片段,利用DNA重组技术将片段定向插入到真核表达载体pcDNA3.1（-）中,经酶切及测序鉴定后,免疫印迹检测各重组载体在细胞中的表达,并利用SWISS-MODEL在线软件预测其蛋白结构.结果 酶切鉴定及Western 印迹结果表明成功构建了IRE1全长及每一种截短型片段的真核表达载体：pcDNA3.1（-）-IRE1（pIRE1）,pcDNA3.1（-）-IRE1-NLDP（pNLD）,pcDNA3.1（-）-IRE1-KinaseP（pKinase）,pcDNA3.1（-）-IRE1-R＋L（pR＋L）,pcDNA3.1（-）-IRE1-RNase（pRNase）.结论 IRE1及其截短型真核表达载体的成功构建和表达,为进一步研究IRE1各个结构域的生物学功能奠定了基础.     

毛竹不同截短U3启动子的克隆及表达分析

具有明确转录起始位点的U3和U6启动子是CRISPR/Cas9技术中驱动sgRNA转录的重要元件。从毛竹(Phyllostachys edulis)中克隆了2个PeU3启动子, 均进行了3个不同长度的截短, 长度分别为550、397和149 bp及561、392和152 bp; 并分别构建6个启动子驱动的GUS及LUC植物表达载体, 再利用农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导法分别转化麻竹(Dendrocalamus latiflorus)愈伤组织和烟草(Nicotiana benthamiana)叶片。结果显示, 这些PeU3启动子总体都具有转录活性, 不同PeU3启动子以及同一PeU3启动子不同截短时其转录活性不同, 其中长度为397 bp的PeU3-1-2pro启动子活性最强, 可为构建竹子CRISPR/Cas9基因组编辑体系提供更多理想的内源启动子。     

仙台病毒核衣壳蛋白基因的克隆与原核表达

目的利用原核表达系统表达仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白。方法根据GenBank上发表的仙台病毒(Sendai Virus,SV)核衣壳蛋白基因序列,设计并合成一对引物,通过RT-PCR扩增出核衣壳蛋白全长cDNA序列,将其克隆至原核表达载体pET-30a,转化大肠杆菌BL21(DE3)PlysS,于37℃1mmol/LIPTG条件下诱导表达,大肠杆菌裂解物经SDS-PAGE分析,在相对分子质量约60×103处出现一新蛋白带,与预期目的蛋白分子量相符。结果Western blot检测表明,表达产物能与兔抗SV阳性血清发生特异性反应,出现单一反应带,表明其具有免疫原性。结论为建立以重组NP蛋白为诊断抗原检测SV奠定基础。     

IBV核蛋白的表达纯化及在监测中应用

鸡传染性支气管炎病毒（Infectious bronchitis virus,IBV）是禽类一种变异性很强的冠状病毒,为获得高度纯化的IBV核蛋白,建立监测IBV抗体的方法,通过RT-PCR从IBV中扩增IBV-N基因,定向连接到表达载体pGEX-KG中,转化E. coli BL21（DE3）菌株,诱导获得表达产物,SDS-PAGE分析产物大小、Western blot分析其免疫学活性,通过亲和层析法获得高度纯化的表达蛋白,建立一种检测IBV抗体的方法,并应用于临床监测。结果显示,IBV-N基因全长1230bp,GST融合蛋白表达产物大小约为80kDa,表达量约占菌体总蛋白的25%,具有良好的免疫学活性;通过GST亲和层析柱成功获得纯化蛋白,以该蛋白包被酶标板,成功地建立了一种检测血清中IBV抗体的间接ELISA方法。研究表明重组N蛋白作为IBV诊断抗原,具有制备简便、特异性强、敏感性高、重复性好的特点,可用于该病的临床监测,为该病疫情监测、发病机制研究奠定了基础。