水稻受盐抑制基因OsZFP1的转基因分析

OsZFP1(水稻锌指蛋白1)基因编码的蛋白含有3个推测的Cys2/Cys2-型锌指结构域,它的表达受盐胁迫负调控.构建了以35S为启动子的OsZFP1基因的植物表达载体,并将其转入拟南芥(Arabidopsis thaliana L.)植物和水稻(Oryza sativa L.)愈伤组织中以过量表达OsZFP1基因.转基因的拟南芥植株和水稻愈伤组织对盐处理的敏感性都比野生型要高.这一结果表明OsZFP1基因可能编码一种负调控蛋白,它可能抑制某些盐诱导基因的表达.在ABA处理下,转基因拟南芥植株比野生型植株抽苔晚,说明OsZFP1基因的作用可能受ABA调节.     

耐盐转基因植物研究进展

高盐是限制作物生长、发育和产量的最严重的非生物胁迫之一。长期以来,改善作物的耐盐性一直是一个伟大的目标。然而,由于耐盐反应是一个极为复杂的过程,过去,通过传统的育种和遗传工程取得的成功有限。近十年来,由于分子生物学的发展,发现了一些与耐盐相关的新基因,对于这些基因的表达方式及其在耐盐反应中的作用已逐步得到了解,这为转基因工程提供了新的材料。通过控制耐盐相关基因在植物体内的表达,已获得了一些提高耐盐性的转基因植物,展示了诱人的前景,但该领域研究仍然存在许多困难和问题,文章重点讨论耐盐转基因植物的进展。     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3．1和2．1kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上（1）去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;（2）将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中（3．1kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中,低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换。将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性。结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第1内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常,从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因。     

过量表达棉花CBF2基因提高转基因拟南芥抗旱耐盐能力

CBF/DREB是一类植物中特有的转录因子,在植物抵抗逆境胁迫过程中发挥重要功能。本研究从陆地棉(Gossypium hirsutum L.)Coker 312中克隆获得1个棉花CBF/DREB基因,命名为Gh CBF2,该基因编码一个由216个氨基酸组成的CBF蛋白。序列分析结果显示,Gh CBF2与其他植物的CBF蛋白类似,含有AP2转录因子典型的保守结构域。干旱或高盐胁迫处理明显增加了Gh CBF2基因的表达量。亚细胞定位分析结果发现Gh CBF2定位在细胞核中。将Gh CBF2基因构建到由35S启动子调控的植物表达载体p MD上并转化拟南芥(Arabidopsis thaliana L.),结果表明,在干旱和盐胁迫条件下,过量表达Gh CBF2基因拟南芥的成活率显著高于野生型,并且游离脯氨酸和可溶性糖含量也高于野生型,说明转Gh CBF2基因提高了拟南芥的耐盐抗旱能力。采用实时荧光定量PCR方法分析胁迫相关标记基因COR15A、RD29A和ERD6的表达情况,结果显示转基因株系中的表达量显著高于野生型,说明Gh CBF2参与调控拟南芥干旱和盐胁迫相关基因的表达。     

盐穗木HcDmc1基因的克隆和表达分析

根据盐穗木盐胁迫下响应的转录组测序结果,克隆获得盐穗木DNA损伤修复基因的cDNA序列,其开放阅读框1 035bp,编码344个氨基酸,命名为HcDmc1。保守结构域分析显示,该基因编码的蛋白具有RecA蛋白家族典型的保守结构域;统进化树分析显示HcDmc1为独立的分支;亚细胞定位于细胞质,为无信号肽、不跨膜的稳定亲水性蛋白。实时荧光定量PCR分析表明,盐穗木在100mmol/L NaCl胁迫7d后,同化枝中HcDmc1基因表达迅速上调并达到最大值,约为对照组的6.58倍;在700mmol/L NaCl胁迫14d后根中HcDmc1基因表达最高,约为对照的1.79倍。研究表明,HcDmc1基因表达受盐胁迫诱导。     

转基因水稻外源基因的漂移研究

转基因水稻基因漂移可能带来环境安全性问题。利用农杆菌介导,把hpt基因转化水稻品种,通过后代筛选,以稳定遗传的含单拷贝转化株系为转基因花粉供体材料,研究转基因水稻向非转基因水稻不育系和常规稻(花粉受体)的外源基因漂移频率。结果表明,相邻种植时转基因水稻向雄性不育系品种的漂移频率为31.74%。随距离的增加漂移频率明显下降,在26m处仍能够检测到含外源基因个体的存在,并且在距离4m处出现一个漂移频率的升高;转基因水稻向常规品种的漂移频率则明显低于不育系,一般在2.0%以下,随距离的增加也呈现下降的趋势,在18m处开始无法检测到含外源基因的个体。     

植物耐盐基因工程研究进展

盐害是影响植物生长和作物产量的主要因素之一。用于提高植物耐盐性的基因工程方法很多,最常见的就是在植物中过量表达抗盐相关的功能基因,包括植物信号传导蛋白基因、植物离子通道蛋白基因和合成小分子渗透剂的酶基因等。归纳了近年来植物耐盐基因工程的研究进展,并展望了植物耐盐基因工程的研究前景。     

转反义OsRACK1基因增强水稻抗旱能力

RAC1是一种多功能支架蛋白,广泛参与植物生长发育过程的调节。利用反义RNA技术抑制水稻（Oryzasativa）RACK1基因的表达,分析了RACK1基因在响应干旱胁迫中的功能。采用实时定量PCR对获得的转基因植株的RACK1基因表达进行分析,结果表明转基因水稻RACK1基因表达受抑制程度达到50％左右。与非转基因水稻（对照）相比,转基因水稻耐干旱能力强,膜脂过氧化程度低且丙二醛的含量少,SOD活性高。这些结果表明,RACK1蛋白负调节水稻对干旱胁迫的耐受过程,并且这种调节作用在很大程度上与植株体内的氧化还原系统有关。     

转反义OsRACK1 基因增强水稻抗旱能力

RACK1是一种多功能支架蛋白, 广泛参与植物生长发育过程的调节。利用反义RNA技术抑制水稻(Oryz a sativa)RACK1基因的表达, 分析了RACK1基因在响应干旱胁迫中的功能。采用实时定量PCR对获得的转基因植株的RACK1基因表达进行分析, 结果表明转基因水稻RACK1基因表达受抑制程度达到50%左右。与非转基因水稻(对照)相比, 转基因水稻耐干旱能力强, 膜脂过氧化程度低且丙二醛的含量少, SOD活性高。这些结果表明, RACK1蛋白负调节水稻对干旱胁迫的耐受过程, 并且这种调节作用在很大程度上与植株体内的氧化还原系统有关。     

转反义DsRACK1基因增强水稻抗旱能力

RAC1是一种多功能支架蛋白,广泛参与植物生长发育过程的调节。利用反义RNA技术抑制水稻（Oryzasativa）RACK1基因的表达,分析了RACK1基因在响应干旱胁迫中的功能。采用实时定量PCR对获得的转基因植株的RACK1基因表达进行分析,结果表明转基因水稻RACK1基因表达受抑制程度达到50％左右。与非转基因水稻（对照）相比,转基因水稻耐干旱能力强,膜脂过氧化程度低且丙二醛的含量少,SOD活性高。这些结果表明,RACK1蛋白负调节水稻对干旱胁迫的耐受过程,并且这种调节作用在很大程度上与植株体内的氧化还原系统有关。     

转AtNHX1基因玉米的产生及其耐盐性分析

以玉米(Zea mays L.)骨干自交系DH4866、齐319和鲁原16106的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法将AtNHX1和hpt因转入玉米培养细胞,经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织并再生植株.经PCR检测和Southernblot验证,确定了22.8%的再生植株为转基因植株.农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响.外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性,在部分株系中表现出孟德尔遗传规律.耐盐筛选表明,一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性,部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长.Northern杂交表明,植株耐盐性提高与AtNHX1基因的转录水平相一致.     

转AtNHX1基因玉米的产生及其耐盐性分析

以玉米(ZeamaysL.)骨干自交系DH4866、齐319和鲁原16106的胚性愈伤组织为材料,采用农杆菌介导法将AtNHX1和hpt基因转入玉米培养细胞,经筛选获得了抗潮霉素的愈伤组织并再生植株。经PCR检测和Southernblot验证,确定了22.8%的再生植株为转基因植株。农杆菌液浓度、愈伤组织基因型及共培养时间对转化率均有明显影响。外源基因在转基因植株后代中的分离呈多样性,在部分株系中表现出孟德尔遗传规律。耐盐筛选表明,一些转基因植株及其后代具有很好的耐盐性,部分株系可在0.8%-1.0%NaCl溶液浇灌下萌发和生长。Northern杂交表明,植株耐盐性提高与AtNHX1基因的转录水平相一致。     

通过根癌农杆菌介导的共转化获得具有蜡质基因反义片段的转基因水稻

在构建剔除潮霉素抗性基因的反义蜡质基因重组质粒p13W8的基础上,用分别携带p13W8质粒和有潮霉素抗性基因的pCAMBIA1300质粒的根癌农杆菌,在不同处理条件下对粳稻3个品种进行共转化.试验结果显示,共感染混合液中pCAMBIA1300菌液比例高,抗性愈伤组织的转化频率也较高;抗性愈伤组织的PCR检测结果表明,潮霉素抗性基因的阳性检测率为98%,反义蜡质基因的阳性检测率为68%.在105株转基因植株中,反义蜡质基因阳性株为30株,占转基因植株的28.6%.乙酰丁香酮处理组的平均转化频率略高于未处理组;在乙酰丁香酮的各种处理中,直接浸泡愈伤组织的转化频率稍高于其它处理方式.     

根癌农杆菌介导转化水稻成熟胚及转Metr基因植株的获得

以粳稻品种广陵香糯为材料,用携带有双元载体pBB的根癌农杆菌EHA105为载体,研究了根癌农杆菌介导转化粳稻成熟胚愈伤组织的几个影响因素,建立了合适的粳稻成熟胚愈伤组织转化系统。一种基于MS为基本培养基的商品培养基(HRM)较适合于作为粳稻成熟胚愈伤组织诱导培养基,合适的愈伤组织诱导培养天数为7~8 d,合适的筛选培养基为CC培养基。在此基础上,将Metr基因导入粳稻品种广陵香糯中,获得了一批转基因水稻植株,PCR分析表明外源基因已经整合进了水稻的基因组中。部分转基因植株后代遗传分析表明外源基因的分离符合3∶1的理论比例。     

NaCI胁迫对转基因杨树外源基因表达的影响

以具高抗虫性的转抗虫基因‘74l杨’及在此基础上转入了发根农杆菌融质粒T-DNA株系的组培苗为材料,研究了转基因株系BtCrylAc抗虫基因和发根基因的表达及其对NaCI胁迫的反应。结果表明,转入Ri质粒T-DNA上的rol基因后,导致苗木根系数目增加,根系长度减小,IAA和GA含量显著提高,抗虫BtCrylAc基因编码的毒蛋白的表达量降低;随着NaCI胁迫强度的增加,苗高、根系数量、叶绿素含量及IAA、GA含量逐步降低,而根系的长度加大,Bt毒蛋白含量显著提高,表明NaCI胁迫使转基因杨外源Bt毒蛋白基因的表达增强,而发根农杆菌．Ri质粒T-DNA的表达下降。     

高赖氨酸蛋白基因导入水稻及可育转基因植株的获得

构建了一个植物高效表达质粒,使来源于四棱豆（Psophocarpus tetragonolobus(L.)DC)的高赖氨酸蛋白基因（lys）受控于单子叶植物ubiqutin强启动子下表达。用基因枪法将其导入水稻(Oryza sativa L.)幼胚诱导的愈伤组织,经潮霉素抗性筛选,得到可育的再生植株。经PCR和Southem blotting检测,表明该基因已整合到水稻的基因组织。GUS组织化学染色表明转基因水稻植株的叶、茎和根中均有gus基因的表达。测定112株转基因水稻叶片中赖氨酸叶量,大部分植株有不同程度的提高,最高幅度为16．04％。     

Transfer of Lysine-rich Protein Gene into Rice and Production of Fertile Transgenic Plants

Lysine-rich protein gene (lys) was cloned from Psophocarpus tetragonolobus (L.) DC. A plant expression plasmid was constructed and lys gene was under the control of maize ubiquitin promoter which is the highest efficient monocotyledon promoter. The plasmid was introduced into rice embryogenic calli by microprojectile bombardment. The regenerated fertile plants were obtained by effective selection for hygromycin B resistance. Genomic PCR and Southern blotting analyses showed that the lys gene has been integrated into rice genome. Simultaneously, the results of GUS histochemical assay demonstrated the transgenic rice plants. Data analysis showed that lysine content in most of the 11 transgenic plants is differently improved, and in one of them increased by 16.04%.     

镉胁迫下水稻OsPT1的表达及功能分析

OsPT1编码的水稻磷酸盐（Pi）转运蛋白在水稻生长发育、非生物胁迫应答等方面发挥重要的调控作用。前期研究表明OsPT1为镉（Cd）响应基因,但其在Cd胁迫下的功能及作用机制仍然未知。阐明OsPT1在Cd胁迫下的作用,并为低Cd水稻品种的选育奠定基础。通过生物信息学方法对该基因的序列特征、结构和功能进行分析和预测,利用实时荧光定量PCR（RT-qPCR）方法检测Cd胁迫下水稻不同组织、不同时间点OsPT1的相对表达量。此外,利用PCR的方法克隆OsPT1的编码序列,构建pGADT7-OsPT1重组质粒载体,并将其转入Δycf1 BY4741酵母菌株（Cd敏感酵母菌株）用以验证OsPT1对酵母Cd耐受性的影响。结果表明,OsPT1编码序列全长为1 584 bp,编码分子量为57.46 kD,由527个氨基酸构成的蛋白。在水稻基因组中该基因上游启动子区含有与光、厌氧、茉莉酸甲酯等环境和激素响应相关的调控元件。系统进化分析表明,水稻OsPT1与高粱SbPT1亲缘关系最近。基因的镉响应表达分析结果表明,与对照相比,经100 μmol/L Cd处理的水稻在1、6和12 h后,地上部分OsPT1的转录水平分别上调1.31、1.34和2.46倍;水稻根部OsPT1在处理1和6 h后分别上调1.28和1.14倍,但在Cd处理12 h后,其表达水平下调至处理前的0.62倍。转基因酵母Cd耐受性结果表明,与对照（0 μmol/L Cd）相比,经25 μmol/L Cd处理后,转OsPT1的酵母对Cd的耐受性有一定的下降。OsPT1可能在水稻应对Cd胁迫过程中发挥一定的作用。     

在转基因水稻植株中蜡质基因第1内含子对-基因表达影响的分析

为阐明水稻Wx基因第1内含子在整体植株的胚乳发育阶段是否确有增强基因表达的功能,以及弄清高和中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子1 126个碱基之间有差异的16个碱基中哪几个碱基影响了该内含子的正常剪接从而降低了基因的表达水平,我们分别用高直链淀粉含量品种的Wx基因翻译起始密码子ATG上游3.1和2.1 kb片段与GUS基因编码区融合构建成嵌合质粒,并在此基础上,(1)去除嵌合质粒中Wx基因的第1内含子;(2)将嵌合质粒Wx基因的第1内含子中(3.1 kb)与中、低直链淀粉含量的水稻品种Wx基因第1内含子有差异的6个碱基以中、低直链淀粉含量的水稻品种的碱基替换.将上述改造过的几种质粒分别转化粳稻品种中花11,测定转化植株未成熟种子胚乳中的GUS活性.结果表明第1内含子的缺失或此内含子的5′端剪接点上的碱基G以T替换均造成GUS活性的急剧下降,说明第l内含子在植株体内的确有增强基因表达的功能,而且在中、低直链淀粉含量的水稻品种中Wx基因第1内含子5′端剪接点上自然存在的G→T突变是造成这些品种中该内含子剪接不正常、从而使Wx基因表达水平和直链淀粉含量下降的主要原因.