尖吻蝮蛇毒内一种新的抗血小板凝集蛋白agkisacutacin的纯化及其性质

从皖南尖吻蝮蛇毒中经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化得到抗血小板凝集蛋白agkisacutacin ,纯化的agkisacutacin由分子量为 1 4kD和 1 5kD的 2条肽链通过二硫键连接 ,能有效抑制ristocetin诱导的血小板凝集 (IC5 0 为 1 8.5mg/L) ,能轻微抑制凝血酶诱导的血小板聚集 (IC5 0 为 1 .2 2 g/L) ,但对ADP、胶原诱导的血小板聚集无影响。agkisacutacin不具有纤溶活性、抗凝活性、磷脂酶A2 活性和出血活性 ,是一种潜在的安全、有效的抗血小板性栓塞的药物     

钙离子通道A23187对血小板聚集和蛋白质磷酸化的影响

以 ³²P-Na₂HPO₄标记猪血小板,在阿斯匹林阻断花生四烯酸代谢,Apyrase去除分泌的ADP情况下,以A23187和PMA为血小板激动剂,staurosporine为PKC抑制剂,研究Ca²⁺和蛋白激酶C在血小板聚集中的作用.结果表明,a.A23187在1～20 μmol/L引起血小板聚集,相应地,明显地引起40 ku、20 ku蛋白质磷酸化,且存在剂量和时间效应关系.b.A23187和PMA在血小板聚集和蛋白质磷酸化上都存在着协同效应.c.1 μmol/L staurosporine可大部分抑制20 μmol/L A23187诱导的血小板聚集和20 ku、40 ku蛋白质磷酸化.结果提示,Ca²⁺激活血小板是建立在激活PKC的基础上,Ca²⁺通过激活PKC诱导血小板聚集,这是Ca²⁺激活血小板的主要途径.     

血小板C1q受体

血小板Ｃ１ｑ受体（ＰＱＲ）纯品的分子量为６７０００,沉降系数２．４Ｓ,有链内二硫键。每个血小板约含有４×１０＾３个ＰＱＲ分子,其对Ｃ１ｑ的亲和常数为３．５×１０＾７Ｍ＾＿。ＰＱＲ与Ｃ１ｑ的结合具有特异性、可饱和性和可逆性。ＰＱＲ是不同于血小板胶原受体的膜受体分子,但可与胶原发生交叉反应。单体Ｃ１ｑ抑制胶原或免疫复合物（ＩＣ）诱导的血小板聚集和释放反应,而多聚Ｃ１ｑ则能激活血小板的这些功能。ＰＱＲ…     

尖吻蝮蛇毒内一种新的抗血小板凝集蛋白agkisacuta …

从皖南尖吻蝮蛇毒中经阴离子交换层析和凝胶过滤层析分离纯化离纯化得到抗血小板凝集蛋白ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ,纯化的ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉｎ由分子量为１４ｋＤ和１５ｋＤ的２条肽链通过二硫键连接,能有效抑制ｒｉｓｔｏｃｅｔｉｎ诱导的血小板凝集（ＩＣ５０为１８．５ｍｇ／Ｌ）,能轻微抑制凝血酶诱导的血小板聚集（ＩＣ５０为１．２２ｇ／Ｌ）,但对ＡＤＰ、胶原诱导的血小板聚集无影响。ａｇｋｉｓａｃｕｔａｃｉ     

川芎嗪对血小板聚集功能的影响及其作用机制的探讨

川芎嗪是从中药川芎根中提取的一种生物碱。祖国医学对其活血化瘀作用早有所知。其化学结构已查明,并有合成制品在市上销售。 临床试用表明,川芎嗪治疗冠心病、心绞痛和急性闭塞性脑血管病有效。本文研究证明,川芎嗪在体外对由诱导剂二磷酸腺苷、胶原、凝血酶诱导所致的家兔血小板聚集有强烈抑制作用,同时也能抑制血小板丙二醛的生成。对外源性花生四烯酸诱导的血小板聚集则无抑制作用。川芎嗪能加强家兔动脉环保温液对花生四烯酸诱导的血小板聚集的抑制作用。 给家兔静脉注射大剂量花生四烯酸钠盐,可使动物突然死亡。但如预先注射川芎嗪,则可使动物得到一定保护。     

尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A2的表达及其生化特征

将尖吻蝮蛇毒碱性磷脂酶A₂（A.aBPLA₂）基因克隆至温敏表达载体pBLMVL2,在大肠杆菌RR1中成功诱导表达.表达产物A.aBPLA₂约占细菌蛋白质总量的20％,并以包涵体的形式存在.纯化包涵体后,将产物变性、复性,然后用FPLC Superose^TM12纯化,产物经过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳检测只有单一条带.对纯化后的表达A.aBPLA₂进行了酶活性、抑制血小板聚集活性和溶血活性的测定.结果显示,表达A.aBPLA₂的酶活性与变性后复性江浙蝮蛇酸性磷脂酶A₂酶活性相近,具有类似变性后复性江浙蝮蛇碱性磷脂酶A₂的溶血活性,没有抑制血小板聚集活性.最后对磷脂酶A₂的结构与这些活性的关系进行了讨论.     

尖吻蝮蛇毒活性肽K组分对血小板聚集和超微结构的影响

目的应用电镜研究尖吻蝮蛇毒活性肽(K组分)对血小板聚集和超微结构的影响,以探讨其抗血小板聚集的机制。方法取2周内未服任何药物健康志愿者静脉血,观察K组分对二磷酸腺苷(ADP)和胶原(collagen)诱导的血小板聚集作用的影响。将已调好的PRP分为5组,A组为空白对照组,B、D组为加入等体积的生理盐水组,C、E组为加K组分组。B、C组分别加血小板聚集诱导剂ADP,D、E组分别加血小板聚集诱导剂胶原,各组分别制成超薄切片样品进行电镜观察、摄片,测出其聚集抑制率。结果K组分能抑制由ADP和胶原诱导的血小板聚集,剂量与抑制率成量效关系,IC50经直线回归分别为0.067和0.088μmol/L。ADP和胶原组血小板形态不规则,突起明显增多。K组分组血小板形态基本规则,膜表面清晰光滑,颗粒较ADP与胶原组明显增加,胞浆空泡化现象减轻。结论K组分明显抑制ADP和胶原诱导的血小板聚集反应及其超微结构的改变。     

高密度脂蛋白促进内皮衍生的一氧化氮抑制血小板聚集的作用

用培养的小牛主动脉内皮细胞与兔水洗血小板直接相互作用的模型 ,探讨高密度脂蛋白对内皮衍生的一氧化氮抗血小板聚集作用的影响。培养的小牛主动脉内皮细胞预先用 10 0 μmol/L阿斯匹林处理 ,抑制细胞内的环氧化物酶活性。凝血酶 ( 0 1U/ml)可诱导兔血小板 ( 2× 10 8/ml) 67 3 3± 7 5 2 %的聚集反应。内皮细胞 ( 1× 10 5～ 1× 10 6 /ml)能抑制凝血酶诱导的血小板聚集 ,抑制强度与内皮细胞的数目正相关。且此作用可被 1mmol/L硝基精氨酸完全取消。表明内皮细胞对凝血酶诱导血小板聚集的抑制作用都是由内皮衍生的一氧化氮所致。在加凝血酶之前加入高密度脂蛋白 ( 1mg/ml)可增强内皮细胞 ( 1× 10 5/ml)的这种作用。高密度脂蛋白 ( 1mg/ml)与内皮细胞共同孵育 1h后 ,将高密度脂蛋白离心弃去 ,内皮细胞对凝血酶诱导血小板聚集的抑制作用不受影响。高密度脂蛋白及内皮细胞对静息血小板均无直接作用。结果表明 ,高密度脂蛋白增强内皮细胞抗凝血酶诱导的血小板聚集反应的作用是通过直接作用于内皮衍生的一氧化氮而产生的     

DDR2胞外区的可溶性表达、纯化和功能检测

盘状结构域受体2（discoidin domain receptor2,DDR2)一种受体型酷氨酸蛋白激酶,其配体为纤维型胶原。胶原诱导的DDR2磷酸化可上调细胞基质金属蛋白酶1的过表达。DDR2在人体内广泛分布并与肿瘤的转移相关。为进一步研究DDR2在肿瘤转移中的作用和DDR2在细胞内的信号通路,对DDR2的胞外区进行了原核融合表达并纯化可溶性部分,获得纯度约85%的纯化蛋白,竞争结合抑制实验证明,纯化的融合蛋白可以特异性阻断Ⅱ型胶原与天然DDR2受体的结合。     

人von Willebrand因子A1和A3功能结构域嵌合体的表达及生物学功能

vWF介导血小板粘附到细胞外基质 ,在血栓形成过程中发挥重要作用 ,可通过阻断vWF与细胞外基质的结合阻止血小板的粘附 .应用RT PCR方法从人脐静脉内皮细胞中克隆vWF分子A1、A3区基因并在大肠杆菌中表达 ,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白 12 6 % ,包涵体经过变性剂溶解、纯化和复性 ,获得重组蛋白 (rvWF A1 A3) .应用流式细胞术检测rvWF A1 A3与血小板膜糖蛋白 (GPⅠb)的结合功能 ;血小板聚集实验观察rvWF A1 A3对瑞斯托霉素 (ristocetin)诱导的血小板聚集 (RIPA)的影响 ;ELISA胶原结合实验及竞争抑制实验分析rvWF A1 A3与胶原的结合活性 .结果显示 :rvWF A1 A3嵌合体与血小板的结合阳性率为 70 4 % .rvWF A1 A3嵌合体不能引起血小板的聚集 ,但rvWF A1 A3嵌合体与血小板温育后可以阻断ristocetin诱导人血浆vWF对血小板的聚集作用 ,而且呈剂量依赖性 ,IC50 的rvWF A1 A3浓度为 0 76 μmol L ,当浓度为 1 17μmol L时抑制率最高达 76 8% .rvWF A1 A3具有良好的胶原结合活性 ,同时它可以竞争性抑制vWF与Ⅲ型胶原的结合 ,抑制率为 76 % .表明rvWF A1 A3可作为阻断剂用于干预vWF介导的血小板粘附过程 ,同时又可以阻断血浆vWF与血小板GPIb结合抑制血小板聚集 ,具有良好的抗栓应用前景 .     

含RGD序列的山蛭素突变体的克隆、表达及性质研究

根据LAP（leech antihemostatic protein）理论,在分析山蛭素和decorsin结构特征的基础上,利用重组PCR方法,删除了山蛭素氨基酸序列的33位至35位,同时分别插入了RGDS和来源于decorsin的一段PRGDADP序列构建成为2种含RGD序列的山蛭素突变体,分别命名为HRGD1和HRGD2.这2种突变体在毕赤酵母菌株GS115中得到成功表达.经过超滤、阳离子交换层析和凝胶过滤层析等纯化步骤之后,得到纯度高于95%的目的蛋白.通过以chromozym TH为底物的凝血酶酰胺水解实验和血小板聚集抑制实验证实了其体外生物学活性,HRGD1和HRGD2抑制凝血酶的动力学常数达到10^-13 mol/L水平,抑制血小板的IC₅₀在10^-6 mol/L水平上.     

华北绣线菊二萜生物碱抗血小板聚集活性研究

采用Born氏比浊法观察华北绣线菊小叶变种中分离得到的总碱和 9个hetisine型C2 0 二萜生物碱及其衍生物体外对血小板活化因子 (PAF)、花生四烯酸 (AA)和二磷酸腺苷 (ADP)三种诱导剂引起的血小板聚集活性的影响 ,并初步探讨了构效关系。结果表明 ,华北绣线菊小叶变种中总碱对PAF和ADP诱导的血小板聚集均有明显的抑制作用 ;9个hetisine型C2 0 二萜生物碱中 ,有 8个显著抑制PAF诱导的血小板聚集 ,其活性与分子结构明显相关 ;此外 ,hetisine型生物碱及其衍生物对ADP诱导的血小板聚集亦有一定的抑制作用 ,但总碱及生物碱对AA诱导的聚集影响不明显。提示hetisine型C2 0 二萜生物碱具有抗血小板聚集活性。     

L—精氨酸L—门冬氨酸盐对血小板功能的抑制

用血小板聚集、粘附、释放实验和出血时间测定观察L-精氨酸*L-门冬氨酸盐(DR)对血小板功能的作用。实验结果显示DR15mg/kg静脉给药,可明显抑制腺苷二磷酸(ADP)诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01);15mg/kg单次口服给药可明显抑制ADP诱导的家兔血小板聚集;其药效可持续8h以上(P<0.01);DR7.5、15、30mg/kg灌胃给药(Bid×3.5d),可明显抑制ADP、胶原或凝血酶诱导的大鼠血小板聚集(P<0.01),并延长出血时间(P<0.05)。DR30mg/kg可明显抑制大鼠血小板粘附,并促进血管内皮释放前列环素(PGI2),但对活化的血小板释放血拴素(TXA2)无明显影响。本研究发现,DR可抑制血小板聚集和粘附功能,其作用机制不同于阿司匹林。这些作用部分是由于DR增加了血管内皮PGI2的释放。此结果为血小板功能的调节提供了新线索。     

神经节苷脂类抑制BT325细胞系生长机理的初步探讨

用 ¹²⁵I-EGF与人多形成胶质细胞瘤BT325细胞系膜上EGF受体的饱和结合实验, 竞争抑制实验研究GM3,BBG(bovine brain gangliosides)对EGF受体最大结合量, 亲和常数及受体数目的影响; 放射受体法观察EGF-EGFR复合物内吞过程, 测定胞质和培养基中EGF含量.结果表明: BT325细胞质膜上存在高亲和力EGF结合位点,GM3对EGF与其受体的亲和力无明显抑制作用(P＞0.05),但能明显减少其受体的数目(P＜0.05); GM3能明显延长EGF-EGFR复合物内吞过程; GM3处理的胞质中EGF浓度比对照组显著升高(P＜0.05), 培养液中无明显差异,这可能是由于GM3抑制EGF分泌所致.     

山莨菪碱抑制内毒素诱导血小板聚集作用

大肠杆菌内毒素诱导兔体内、外血小板聚集,使血小板内cAMP水平降低。山莨菪碱能抑制内毒素诱导的血小板聚集,并提高血小板内cAMP的水平。山莨菪碱提高血小板内cAMP 的作用可为β-受体阻断剂心得舒阻断。     

丹心Ⅲ号和丹心V号对血小板聚集功能的影响

本文观察了丹心Ⅲ号和丹心Ｖ号对血小板聚集功能的影响,实验结果：丹心Ⅲ号和丹心Ｖ号在体外均可显著抑制ＡＤＰ和花生四烯酸诱导的人血小板聚集,其ＩＣ５０分别为１．６０５ｍｇ／ｍｌ,２．５８９ｍｇ／ｍｌ,８．４ｌ６ｍｇ／ｍｌ和６．６０６ｎｇ／ｍｌ;在体内可抑制连续给药（３５０一７００ｍｇ／ｌｋｇ．ｄ）１０ｄ大鼠血小板对ＡＤＰ和花生烯酸诱导的血小板聚集,但对凝血酶诱导的血小板聚集无明显抑制作用。上述结果提示丹心Ⅲ号和丹心Ⅴ号对血小板聚集功能具有明显的抑制作用。     

烟碱型乙酰胆碱受体参与乙酰胆碱调控的气孔运动

动物细胞中 ,乙酰胆碱功能的发挥要求乙酰胆碱受体的参与 ,烟碱型受体的激活剂可以直接影响膜对离子的通透性 .在乙酰胆碱诱导的气孔开放过程中 ,可能同样涉及到烟碱型受体的作用 ,药理学的证据表明烟碱型乙酰胆碱受体参与乙酰胆碱调控的气孔运动 ,而且烟碱型乙酰胆碱受体介导的气孔开放与介质中的离子组成密切相关 ,只有在含K⁺的介质中烟碱才可以诱导气孔开放而在含Ca^{2 +}的介质中没有作用 ;同样 ,烟碱型乙酰胆碱受体的抑制剂只有在含K⁺的介质中才能抑制乙酰胆碱诱导的气孔开放 .进一步利用荧光定位技术证明烟碱型受体存在于蚕豆气孔保卫细胞中 ,而且主要分布在保卫细胞原生质体的表面 .免疫印迹实验初步证明在保卫细胞原生质体的微粒体中存在着能与动物烟碱型乙酰胆碱受体的α和β亚基发生免疫交叉反应的蛋白条带 .以上结果表明烟碱型乙酰胆碱受体存在于保卫细胞中 ,而且介导了乙酰胆碱诱导的气孔在含K+介质中的开放 .     

葡萄籽中原花青素对实验动物主动脉收缩和血小板聚集的影响

目的:研究葡萄籽中原花青素(PA)对大鼠离体主动脉平滑肌收缩活动和兔血小板聚集的影响.方法:采用大鼠离体主动脉环灌流方法,记录主动脉环张力变化,观察PA对去甲肾上腺素(NA)和KCl预收缩大鼠离体主动脉平滑肌收缩反应的舒张作用以及对NA量效曲线的影响.比浊法测定兔血小板聚集.结果:PA能明显抑制NA(10-6mol/L)预收缩大鼠离体主动脉环的反应,使NA量效曲线压低,最大反应降低,此作用无内皮依赖性,但对KCl预收缩主动脉环的舒张作用无明显影响,也不影响花生四烯酸(AA),ADP和胶原(collagen)蛋白诱导的兔血小板聚集.结论:PA能对抗NA而不影响KCl诱导的大鼠离体主动脉平滑肌的收缩,不影响兔血小板聚集.     

四种圆斑蝰蛇毒对血小板聚集抑制作用的比较研究

对四种不同来源的RVV对ADP、Col和Ris诱导的血小板聚集抑制作用进行比较研究。RVV-B、RVVS和RVV-Styp对三种诱导剂的血小析聚集均有抑制作用,而RVV-T虽有ADP和Col抑制作用,但缺乏对Ris的抑制活性。预先与RVV孵育的血小板经洗涤后重新悬浮于自身PPP中,与RVV-Styp孵育的血小板完全恢复对Ris的凝集反应,而与RVV-B和RVV-S孵育的血小板仅部分恢复其反应。上述结果表明,在RVV中可能含有二种不同的血小板聚集抑制活性,而其抑制机理可能牵涉到血小板、血浆等因素。     

四种圆斑蝰蛇蛇毒对血小板聚集抑制作用的比较研究

对四种不同来源的RVV对ADP、Col和Ris诱导的血小板聚集抑制作用进行比较研究。RVV-B,RVVS和RVV-Styp对三种诱导剂的血小板聚集均有抑制作用,而RVV-T虽有ADP和Col抑制作用,但缺乏对Ris的抑制活性。预先与RVV孵育的血小板经洗涤后重新悬浮于自身PPP中,与RVV-StyP孵育的血小板完全恢复对Ris的凝集反应,而与RVV-B和RVV-S孵育的血小板仅部分恢复其反应。上述结果表明,在RVV中可能含有二种不同的血小板聚集抑制活性,而其抑制机理可能牵涉到血小板、血浆等因素。