大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及表达

自然界异黄酮合成途径主要存在于豆科植物中。以微生物为宿主研究异黄酮代谢,则需要将整个相关代谢途径的多酶体系组装到工程菌种,从而进行表达及代谢研究,这就需要用到多基因的转化和共表达技术。综合应用了多基因单载体和多基因多载体方法,将大豆异黄酮代谢途径中的五个关键酶基因导入到大肠杆菌中,对异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建和表达进行了研究和探索,获得了含有五个外源基因的重组大肠杆菌;重组菌经IPTG诱导,以L-酪氨酸为底物进行发酵,发酵产物经过HPLC测定,结果表明和空白对照相比有新的代谢产物生成,初步断定为异黄酮类化合物。     

大豆异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建及表达

自然界异黄酮合成途径主要存在于豆科植物中。以微生物为宿主研究异黄酮代谢,则需要将整个相关代谢途径的多酶体系组装到工程菌种,从而进行表达及代谢研究,这就需要用到多基因的转化和共表达技术。综合应用了多基因单载体和多基因多载体方法,将大豆异黄酮代谢途径中的五个关键酶基因导入到大肠杆菌中,对异黄酮代谢途径在大肠杆菌中的构建和表达进行了研究和探索,获得了含有五个外源基因的重组大肠杆菌;重组菌经IPTG诱导,以L-酪氨酸为底物进行发酵,发酵产物经过HPLC测定,结果表明和空白对照相比有新的代谢产物生成,初步断定为异黄酮类化合物。     

酪丁酸梭菌代谢工程菌的构建及其发酵特性

酪丁酸梭菌Clostridium tyrobutyricum可以利用葡萄糖、木糖、纤维二糖、阿拉伯糖等多种底物进行产酸发酵,主要发酵产物为丁酸和乙酸,是一种适合于木质纤维素同步糖化发酵生产丁酸的菌种。将酪丁酸梭菌乙酸发酵关键基因取代为丁酸发酵关键基因来构建突变株,可使突变株丁酸发酵量增多,乙酸发酵量减少。分别获得来源于丙酮丁醇梭菌的丁酸代谢关键酶基因——乙酰乙酰辅酶A转移酶基因(thl)、来源于酪丁酸梭菌本身的乙酸代谢关键酶基因片段——磷酸转乙酰基酶基因片段(pta)和来源于质粒pIMP1的红霉素抗性基因(em)。将它们与质粒pUC19相连构建为非复制性质粒pUC19-EPT。通过电转化将其导入酪丁酸梭菌中。利用红霉素抗性平板筛选获得转化子,通过PCR验证发现,获得的突变株染色体上pta被thl替换。在以葡萄糖为底物的发酵中,突变株丁酸得率为0.47,较野生型增大了34%,乙酸得率为0.05,较野生型下降了29%。     

细菌3-羟基丁酮及氧化还原产物代谢的研究进展

3-羟基丁酮及氧化还原产物是重要的4碳平台化合物,以糖质原料为底物的生物法制备是当今研究与生产的主流。介绍了3-羟基丁酮及氧化还原产物2,3-丁二醇、丁二酮产生的主要细菌,这些细菌积累3-羟基丁酮及氧化还原产物的代谢途径,主要的代谢及调控方式,代谢关键酶:乙酰乳酸合成酶、α-乙酰乳酸脱羧酶、2,3-丁二醇脱氢酶的结构与功能等国内外研究进展;并对3-羟基丁酮及氧化还原产物细菌代谢、发酵制备的未来研究提出了展望。     

影响灵芝三萜类物质液态发酵合成的关键因素研究进展

灵芝是我国名贵的食药两用型菌类,具有广泛的药用价值,其三萜类物质为灵芝中最主要的药理活性物质之一。灵芝液态发酵因具有生长周期短、环境条件可控、目标产物质量稳定及易实现规模化制备等特点而成为获得灵芝三萜类物质最有前景的方式。灵芝三萜代谢途径、发酵工艺及参数、溶解氧控制等是影响灵芝三萜类物质液态发酵合成的关键因素。本文总结了灵芝三萜生物合成的代谢途径和相关的酶(基因)、液态发酵方式和发酵参数调节的溶解氧控制这3个层面对灵芝三萜类物质生物合成的影响,并对今后的研究方向进行了展望,为液态培养灵芝三萜类物质调控及高产提供参考,也为下一步研究提供借鉴。     

洛伐他汀工业菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成分析

【目的】分析洛伐他汀工业生产菌株土曲霉HZ01的次级代谢产物合成能力,为后期的遗传改造、次级代谢产物及其基因簇挖掘提供指导。【方法】对洛伐他汀发酵条件下的样品进行了转录组分析,同时运用色谱分离技术及波谱学方法对主要次级代谢产物进行了分离和结构鉴定。【结果】洛伐他汀合成相关基因转录水平非常高,还有4个聚酮合酶(PKS)、6个非核糖体多肽合成酶(NRPS)和1个PKS-NRPS杂合酶基因进行了转录,其他PKS和NRPS基因都处于沉默状态。此外,从该菌的发酵产物中分离鉴定了10个主要副产物并确定了其结构。【结论】土曲霉HZ01是一株优良的洛伐他汀生产菌株,在构建次级代谢产物异源合成细胞工厂和鉴定次级代谢产物生物合成途径方面具有很好的应用潜力。     

甲壳素促进茂源链霉菌发酵产酶

为了提高茂源链霉菌发酵生产谷氨酰胺转胺酶的产量,研究了甲壳素对茂源链霉菌发酵产酶的影响。结果表明,添加0.5%的甲壳素对茂源链霉菌发酵产酶的促进效果极显著,但甲壳素的添加量达到2%时反而会抑制菌株产酶。从菌株生长代谢过程中p H变化、产酶情况、发酵液中蛋白含量及总氮含量等方面,对甲壳素促进茂源链霉菌发酵产酶的作用机理进行了初步探讨。研究显示,甲壳素在茂源链霉菌发酵过程中对菌体生长产生一定的胁迫,刺激菌体大量分泌次级代谢产物,从而提高茂源链霉菌的产酶。对菌株发酵过程的显微观察则表明,甲壳素也可能通过分散菌体生长,提高菌体向胞外分泌谷氨酰胺转胺酶的量来促进产酶。     

浅紫灰链霉菌CQ01819及其次级代谢产物的定向发掘

【目的】采用特征次级代谢产物生物合成的保守功能基因探针,定向分离土壤中产生特征次级代谢产物的菌种资源,借助基因转录分析为导向的培养基优化方法,获得目标次生代谢产物。【方法】首先,根据5种特征次级代谢产物保守的合成功能基因设计简并引物,定向从土壤样品中筛选、分离并纯化菌株。然后,以RT-qPCR为指导开展目标产物的发酵培养基优化;最后,对菌株进行发酵,利用多种色谱技术分离纯化目标天然产物,并结合高分辨质谱与核磁共振等技术对所获得的化合物进行结构鉴定。【结果】从土壤中筛选得到了一株AHBA合酶基因和环氧化酶基因均为阳性的链霉菌菌株(编号为CQ01819),根据转录分析优化发酵培养基,最终从该菌株分离纯化得到了含有AHBA结构单元的丝裂霉素C、聚醚类抗生素莫能霉素A和缬吲霉素。【结论】本研究通过菌株的定向分离纯化,筛选得到了产生预期抗生素的浅紫灰链霉菌菌株CQ01819;基于RT-qPCR指导的发酵培养基优化,确定了菌株的发酵条件;获得发酵粗提物后,采用多种色谱整合技术和光谱分析策略,快速分离并鉴定了目标产物。该研究为目标菌种资源的定向筛选、菌株的发酵条件的快速优化和化合物的定向分离提供了较...     

现代生物技术在二元酸发酵菌种改良中的应用

在分析微生物发酵生产二元酸的代谢机理和相关酶系的基础上 ,对基因工程、代谢调控等现代生物技术在长链二元酸发酵菌种改良中应用的最新进展进行了全面的综述 ,对如何将传统的微生物发酵与现代生物技术有机结合作了简要讨论。     

链霉菌次级代谢产物高产菌株的构建策略

随着基因测序技术的发展,人类获得了大量有关链霉菌次级代谢产物合成基因簇的信息,通过合理的构建策略可以激活其中的隐性基因簇或提高基因簇的表达水平,从而获得新的链霉菌次级代谢产物,或显著提高已知次级代谢产物的发酵水平。从基因表达调控、转座子突变、合成生物学方法、组学方法等四个方面,综述了提高链霉菌次级代谢产物产量的构建策略及其研究进展。     

真菌诱导子在发酵工业中的应用现状及展望

真菌诱导子是一类能诱导植物和微生物产生次级代谢产物的活性物质,它一经识别,将通过信号转导途径,引起相关基因表达发生变化,从而调节次级代谢产物合成途径中相关酶的活性,诱导特定次级代谢产物的积累。近年来国内外在真菌诱导子诱导途径及机制方面进行了深入研究,同时在生物工业领域,尤其在发酵工业中的应用也引起了广泛关注。以下结合本实验室的研究工作,重点介绍了真菌诱导子在植物和微生物细胞次级代谢产物合成方面的应用现状、诱导机制和存在的问题及展望。     

丙酮酸脱氢酶活性调控在线粒体代谢与生长平衡中的作用

丙酮酸脱氢酶多酶复合体(PDC)催化丙酮酸生成乙酰辅酶 A(acetyl-CoA)的反应是线粒体代谢与生长的调控枢纽.丙酮酸脱氢酶激酶 (PDK)/丙酮酸脱氢酶磷酸酶(PDP)对丙酮酸脱氢酶(PDH)的磷酸化 /脱磷酸化作用以及丙酮酸/乙酰辅酶A对PDH底物产物水平的调控是线粒体适应不同生理环境的代谢调节方式,而调控 PDK基因转录的上游信号恰好也是线粒体生长或生物发生的调控机制.过氧化物酶体增殖物激活受体 (PPAR)/过氧化物酶体增殖物激活受体g共激活因子-1(PGC-1) 信号通路可能是线粒体代谢与生长在基因转录水平的共同调控通路.线粒体代谢与生长经共同通路调节可维持线粒体功能与结构之间的平衡.     

启动子和细胞全局转录机制的定向进化在微生物代谢工程中的应用

通过随机突变和定向选择而进行的定向进化(又称分子进化或人工进化)在改造酶的催化特性和稳定性、扩展酶的底物范围等方面具有广泛的应用。近年来,定向进化也开始应用在对结构基因的启动子区域和具有调节功能的蛋白如转录因子等进行代谢工程改造,并成功选育了对环境胁迫因素具有较强耐受性,以及发酵效率提高的微生物菌种。以下着重介绍近年来启动子的定向进化,包括启动子的强度和调节功能的分子进化,以及细胞全局转录工程等技术在微生物代谢工程中的应用,这些定向进化技术使人们可以更精细地调节基因表达水平,并可同时改变细胞内多个基因的转录水平,是代谢工程研究新的有力工具。     

己酸菌LⅡ己酸发酵过程中生理及代谢特点

在了解了产己酸细菌ＬＩＩ的发酵最适条件的基础上,进一步对己酸发酵过程中的生理及代谢特性作了较详细的分析。结果表明,在己酸发酵过程中除产生正常代谢产物己酸外,还产生丁酸、乙酸、戊酸等其它酸类和甲烷,氢气和ＣＯ_２等气体。用１—^１３Ｃ－乙酸钠和未标记的乙醇作为底物发酵,用色质联用仪（ＧＣ／ＭＳ）分析,结果表明：在己酸合成中碳的来源为乙醇和乙酸,中间代谢产物为丁酸。     

谈谈植物中的几丁质酶

几丁质酶及其底物几丁质均广泛存在于自然界.由于几丁质酶及其降解产物在生物学、医学、化学、农业及环境科学等方面的潜在价值而越来越受到重视.着重介绍了几丁质酶的作用原理,植物的几丁质酶基因,植物中几丁质酶的特性以及几丁质酶在植物中的作用和在转基因植物中的应用.     

微小杆菌属(Exiguobacterium)细菌的能量代谢途径分析

【目的】微小杆菌属(Exiguobacterium)细菌广泛分布于海洋及非海洋环境中,具有多种代谢途径以适应复杂多样的生境。本研究从能量代谢途径角度出发,探究该属菌株对不同生境的适应能力。【方法】从美国国家生物科技数据中心(National Center for Biotechnology Information, NCBI)数据库中获取146个Exiguobacterium属菌株的基因组,查找并统计光营养、厌氧呼吸和底物代谢等多种能量代谢途径的关键蛋白或关键酶基因在各菌株基因组中的分布,包括光营养型的视紫红质基因、厌氧呼吸营养型的钼辅因子合成蛋白基因,以及底物代谢营养型中乙醛酸分流途径的异柠檬酸裂解酶及苹果酸合酶基因等。根据对应的氨基酸序列构建视紫红质、MoaC和异柠檬酸裂解酶的系统发育树,分析不同能量代谢途径在该属菌株进化过程中的保守性,推测其对于该属菌株的重要性。【结果】Exiguobacterium属中50%的种具有视紫红质基因,其中分离自非海洋生境的菌株更趋向于含有视紫红质基因。本研究所统计的全部非海洋生境菌株中,含有视紫红质基因的菌株占比约为70%,而在海洋生境菌株中该比例...     

嗜热厌氧杆菌X514生长及代谢的初步研究

嗜热厌氧杆菌X514(Thermoanaerobactersp.X514)是纤维素乙醇生产中最具潜力的菌株之一。对X514在3种培养基中的生长及代谢特征进行分析后发现,培养基1190比GS-Ⅱ和2473更适合运用于X514的代谢研究及乙醇发酵。其次,分别在1190培养基中添加不同浓度的酵母提取物和葡萄糖,对X514的生长及代谢作进一步研究。结果表明,在0.5-2 g/L范围内,酵母提取物浓度的增加有助于提高X514的生物量,乙醇等产物的产量及乙醇产率,说明酵母提取物对X514生长及乙醇发酵有促进作用;在2-10 g/L范围内,葡萄糖浓度的增加可提高乙醇等产物的产量而不会改变各产物的产率;糖消耗量并不随着初始底物浓度的增加而线性增长,而是在一定阶段趋于消耗最大值。反映了X514在底物充分的条件下,只有通过改进其他制约条件,才有可能提高底物的利用率及产物的产率。     

百部内生放线菌的分离、分类及次级代谢潜力

【目的】以对叶百部块根为材料分离内生放线菌,并对分离菌株进行分类、抗菌活性和次级代谢产物合成基因研究。【方法】样品经过严格的表面消毒,选用4种培养基分离百部内生放线菌;分离菌株通过形态观察和16S rRNA序列分析进行分类鉴定;采用琼脂移块法测试分离菌株的抗菌活性;通过PCR检测分离菌株的PKS/NPRS和卤化酶基因;使用HPLC-UV/VIS-ESI-MS/MS分析发酵产物。【结果】从6个样品中获得18株内生放线菌,分属链霉菌属(Streptomyces)、小单孢菌属(Micromonospora)、假诺卡氏菌属(Pseudonocardia)和甲基杆菌属(Methylobacterium)。分离菌株绝大部分具有抗菌活性和次级代谢产物合成基因,其中13株对耐药金黄色葡萄球菌和/或绿脓杆菌有拮抗活性,17株具有PKS/NRPS基因,8株菌具有卤化酶基因,且卤化酶阳性代表菌株的发酵产物具有抗细菌活性和卤代化合物特征。【结论】百部作为一种传统中药,其内生放线菌以链霉菌和小单孢菌为主,在次级代谢产物合成方面具有很好的潜力,可作为一类重要微生物资源进行活性产物开发。     

葡糖淀粉酶基因的分子生物学研究

从酶活、底物、产物、应用及空间结构等方面论述了葡糖淀粉酶的一般生物学特性及应用,分析了其不同来源的基因同源度。着重从分子生物学角度阐述了葡糖淀粉酶基因在多种表达系统中的分泌表达情况,并对其基因在曲霉及酵母中的高效表达及分泌引导功能进行了初步阐述和探讨。     

植物芪类合成途径相关酶、基因和调控机制研究进展

植物芪类化合物,是一类具有抗菌植保作用的次生代谢产物,因具有抑菌、抗氧化、抗肿瘤等多种生物活性而越来越受到重视。本文对植物芪类生物合成途径中涉及到的相关酶、基因和代谢调控机制的研究现状和应用系统生物学研究芪类生物合成途径的相关酶、基因的方法进行综述,并讨论了芪类生物合成相关酶、基因研究的重要意义和应用,以期为调节芪类产量、满足药用保健需求及植物防御、作物品质改良提供帮助。