薄荷伪造桥虫NPV感染斜纹夜蛾幼虫分离的一种新NPV特性的研究

用薄荷伪造桥虫核型多角体病毒(Argroyamma agnata NPV)(以下简称Aa NPV)在室内感染斜纹夜蛾(Prodenia litura)幼虫,从死虫体内分离到一种NPV。经电镜观察,多角体蛋白分析、病毒核酸的限制性内切酶酶解分析等研究,证明此多角体直径为1.5—2.6/μm,病毒粒子为杆状,其大小为100—150×420nm,病毒粒子为多粒包埋型。提纯的多角体蛋白只有一种多肽,分子量为33,500d,提纯的病毒粒子的结构多肽至少有15种,其分子量范围为15,600     

杆状病毒转移载体的构建及绿色荧光蛋白在斜纹夜蛾幼虫中的表达

为构建斜纹夜蛾核型多角体病毒 （SpltMNPV）的重组病毒,以该病毒日本C3株基因组DNA为PCR扩增模板,根据GenBank SpltMNPV中国G2株基因序列,设计了两对引物分别扩增多角体蛋白基因的5′端侧翼序列（含启动子）和3′端侧翼序列（含终止子）,将这两个片段依次克隆于pUC18质粒载体后,再将绿色荧光蛋白(GFP)基因亚克隆到上述载体的多角体蛋白基因启动子和终止子之间,获得转移载体pSplt-gfp。将pSplt-gfp与野生型SpltMNPV 基因组DNA共转染Spli细胞,通过同源重组和有限稀释法筛选,获得了以gfp基因替代多角体蛋白基因的重组病毒SpltMNPV-gfp。SpltMNPV-gfp感染Spli细胞和斜纹夜蛾幼虫,分别在感染24h和48h后可发现绿色荧光蛋白的表达。该重组病毒的获得,为建立斜纹夜蛾核型多角体病毒表达体系奠定了基础。     

甘蓝夜蛾核型多角体病毒的初步研究

甘蓝夜蛾(Barathra brassicae Linnaeus)为分布较广的杂食性害虫。主要危害十字花科蔬菜和棉、麻、豆类等作物。1979年6月,从泰安市省庄公社油菜地自然病死的甘蓝夜蛾幼虫上分离到一株核型多角体病毒。通过室内感染和田间试验表明毒力较强,对家蚕安全。对该病毒的多角体观察国内已有报道,四年来,我们又对此株病毒的分离、形态特征和杀虫效果等方面作了初步研究,现将研究情况介绍如下。     

两株甜菜夜蛾核型多角体病毒的研究

本文报道了甜菜夜蛾核型多角体病毒 (Ｓｐｏｄｏｐｔｅｒａｅｘｉｇｕａｎｕｃｌｅａｒｐｏｌｙｈｅｄｒｅｓｉｓｖｉｒｕｓ,ＳｅＮ ＰＶ)美国分离株的形态学观察、宿主范围的测定、活体生物测定及其与甜菜夜蛾核型多角体病毒中山大学分离株的毒力、限制性内切酶图谱比较等研究结果。以喂饲法用ＳｅＮＰＶ美国分离株感染 4龄初甜菜夜蛾幼虫 ,收集具典型病症的虫尸并提纯多角体。取纯多角体进行包埋、切片。电镜观察表明 ,此甜菜夜蛾ＮＰＶ为多粒包埋型核型多角体病毒。用ＳｅＮＰＶ美国分离株以 1 .3× 1 0 7ＰＩＢｓ/ｍＬ分别感染甜菜夜蛾…     

基于性信息素诱捕的广东草地贪夜蛾发生动态及多生物防治因子组合对其控制效果评价

采用性信息素诱捕器对广东省佛山市、茂名市、韶关市和梅州市的草地贪夜蛾Spodoptera frugiperda发生动态进行监测;以清水作为空白对照,以20%氯虫苯甲酰胺为药剂对照,评价了螟黄赤眼蜂Trichogramma chilonis、螟黄赤眼蜂+苏云金杆菌、螟黄赤眼蜂+金龟子绿僵菌、螟黄赤眼蜂+莱氏绿僵菌、螟黄赤眼蜂+爪哇棒束孢菌、螟黄赤眼蜂+甘蓝夜蛾核型多角体病毒、螟黄赤眼蜂+蠋蝽、螟黄赤眼蜂+蠋蝽+甘蓝夜蛾核型多角体病毒这8种生防措施对玉米田草地贪夜蛾的防控效果。结果表明,草地贪夜蛾在所监测的4个地市全年均有发生,其中佛山监测点的草地贪夜蛾诱捕量高于其它3个监测点,并具有1个明显的发生高峰期（2019年10月中旬至11月中旬）,高峰期与玉米种植面积呈正相关。田间生防试验结果表明,单一释放螟黄赤眼蜂或与其他生防因子联合使用均对草地贪夜蛾有一定的控制作用,处理7 d后的防虫效果为54.87%~76.49%,其中以螟黄赤眼蜂+甘蓝夜蛾核型多角体病毒及螟黄赤眼蜂+蠋蝽+甘蓝夜蛾核型多角体病毒的防治效果最好,防效分别为76.49%及71.56%,但均低于氯虫苯甲酰胺的防虫效果（94.60%）;但14 d后,20%氯虫苯甲酰胺的防虫效果下降至78.51%,而螟黄赤眼蜂+甘蓝夜蛾核型多角体病毒及螟黄赤眼蜂+蠋蝽+甘蓝夜蛾核型多角体病毒的防效呈上升趋势,防效分别为81.31%与83.35%,具有较好的持续性与稳定性,是防治玉米草地贪夜蛾的理想生物防治组合。研究结果为了解广东草地贪夜蛾的发生规律及综合防控提供了相关科学依据与技术支撑。     

简讯

一株侵染黑点银纹夜蛾的多角体病毒初步观察黑点银纹夜蛾幼虫主要危害大豆、甘蓝和白菜,常和银纹夜蛾混合在一起危害农作物。1979年8月,从黑点银纹夜蛾幼虫死尸中分离     

取食不同食物的甜菜夜蛾幼虫感染核型多角体病毒后中肠组织的变化

【目的】观察取食人工饲料和3种寄主植物的甜菜夜蛾Spodoptera exigua 3龄幼虫感染核型多角体病毒后,其中肠组织的病理变化。【方法】核型多角体病毒感染甜菜夜蛾后,剖取围食膜观察在不同时间点围食膜的变化,以及采用组织切片法探究取食人工饲料和不同寄主植物的甜菜夜蛾感染病毒前后其中肠组织的病理变化。【结果】幼虫感毒后的围食膜首先由无色透明、具有弹性的圆桶状结构,变成乳白色、弹性降低的单片状结构,随着感毒后时间的推移,围食膜破坏严重,变成无弹性的碎片状。取食不同寄主植物和人工饲料的甜菜夜蛾在未感染病毒时其中肠组织都没有明显的变化,而感染病毒后甜菜夜蛾中肠组织围食膜被破坏或消失;中肠柱状细胞伸长、变形,细胞间隙变大,排列混乱,细胞脱落,肠壁变厚。此外,核型多角体病毒对取食人工饲料和不同寄主植物的甜菜夜蛾中肠组织的影响也存在差异,对取食人工饲料和黄豆的影响类似且最大、甘蓝次之,蕹菜最小。【结论】核型多角体病毒对甜菜夜蛾中肠组织具有显著的影响,且取食不同寄主植物时其影响存在明显差异。     

三种夜蛾科昆虫核型多角体病毒DNA相关性的研究

核型多角体病毒属杆状病毒科,主要感染鳞翅目、双翅目和膜翅目的昆虫,具有90～160kb长的双链,超螺旋DNA基因组。现已发现约500种核型多角体病毒,这些病毒之间有什么关系？它们的亲缘关系如何？我们以甘兰夜蛾核型多角体病毒（简称MbNPV）、甜菜夜蛾核型多角体病毒（简称SeNPV）和斜纹夜蛾核型多角体病毒（简称SINPV）为材料,用限制性内切酪和分子杂交技术对它们的基因组DNA进行比较研究,并对其中一种病毒MbMV多角体蛋白基因进行了定位,现将结果报道如下;材料和方法1材料甜菜夜蛾和斜纹夜蛾健康幼虫,病毒麦种MbNPV、SeN…     

苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒的形态及其形态发生电镜观察

一、苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒和包涵体的形态观察苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒感染健康的 3龄期甜菜夜蛾幼虫 ,从典型症状的病死虫中提纯多角体 ,置于扫描电镜下观察 ,发现有典型的四角形的多角体外 ,还观察到菱形的和长方形的多角体 ;而多角体经超薄切片的样品中 ,还看到三角形的多角体。出现菱形、长方形及三角形的多角体形态 ,未见前人报道。病毒粒子的杆状形态没有变化 ,采用五种限制性内切酶 ,分析苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒基因组 ,观察其酶切图谱 ,以及计算其各酶解片段的分子量 ,与前人报道的结果一致 ,未发生变化 (见另文报道 )…     

斜纹夜蛾核多角体病毒egt基因的核苷酸全序列分析及同源性比较

测定了斜纹夜蛾核多角体病毒(Spodoptera litura multinucleocapsid nuclear polyhedrosis virus, SlNPV)中山大学分离株(Zhongshan University isolate, ZSU)蜕皮甾体尿苷二磷酸葡糖转移酶(Ecdysteroid UDPglucosyltransferase, EGT)基因的核苷酸全序列。该基因编码框包含1530个核苷酸,有509个氨基酸组成的蛋白质,分子量为58.5kD,TATA框位于ATG上游44处。在终止密码子TAA下游13位,有真核生物基因mRNA转录poly(A)加尾酶信号序列：AATAAA。同源性比较显示,SlNPV egt基因推测的氨基酸序列与其它昆虫杆状核多角体病毒EGT序列同源性很高,与海灰翅夜蛾核多角体病毒(Spodoptera littoralis nuclear polyhedrosis virus, SliNPV)同源性最高,核苷酸和氨基酸序列同源性分别为84%和91%,而且有一些与EGT结构和功能密切相关的氨基酸是绝对保守的;根据EGT蛋白进行分子进化树分析,把昆虫杆状病毒EGT主要分成两大类。     

利用杆状病毒表达系统表达金鱼生长激素I基因

以不含起始密码ATG的质粒Psxivvi⁺X3为转移载体,将编码金鱼生长激素I的Cdna插入粉纹夜蛾核型多角体病毒(TnNPV)基因组中,构建了形成多角体的重组病毒株TnNPV—SX⁺gfGHl21a。该毒株能利用合成多角体XIV串联启动子,在重组病毒感染的草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda,Sf)昆虫细胞及银纹夜蛾幼虫中表达金鱼生长激素I基因。感染离体细胞及虫俸后的蛋白SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳表明．所表达的蛋白分子量为22．5kDa,与理论计算值相符。Westem印迹证实。金鱼生长激素特异蛋白得到表达。     

黄地老虎质型多角体病毒病的研究

黄地老虎质型多角体病毒的多角体有两种类型：多角形和四边形,大小分别为0.6—2.7μ和0.7—2.8μ。病毒粒子近球形,外壳上有管状物,病毒粒子大小为50—70nm。黄地老虎质型多角体的毒力较高,用1×108多角体／ml的浓度感染3龄幼虫,死亡率达93．9％。石腊切片观察感染6和10天的黄地老虎幼虫,中肠柱状细胞和围食膜内都含有大量多角体。超薄切片观察感染2、4、7天的柱状细胞内形成病毒粒子和多角体。杯状细胞感染较柱状细胞晚。感染4天的围食膜内发现有带毛的游离病毒粒子。     

利用杆状病毒载体在棉铃虫血细胞中表达大肠杆菌β－半乳糖苷酶

用携带大肠杆菌β－半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体pAc36O－B－gal与野生型的苜蓿丫纹夜蛾(AcNPV)DNA同时转染草地夜蛾细胞,经x—gal筛选和空斑纯化得到重组型杆状病毒AcNPV－β－gal。该重组病毒能有效地感染棉铃虫血细胞系,并高效表达出受AcNPV多角体蛋白启动子控制的、具有生物活性的外源基因产物－－β－半裂糖苷酶。80％以上的酶蛋白能分泌到细胞外,培养液中酶活可达每毫升50000单位以上,约相当于170μg酶蛋白。用要SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳分离表达产物和β－半乳糖苷酶在凝胶上的特异性显色反应分析,重组病毒在棉铃虫血细胞中表达的AcNPV多角体蛋白－－大肠杆菌β－半乳糖苷酶融合蛋白是以5种活性的多聚体或复合物形式存在的。     

红棕灰夜蛾核型多角体病毒的研究

红棕灰夜蛾 Sarcopolia illoba(Butler)是鳞翅目夜蛾科害虫。分布于我国东北、华北、华东、华中及苏联、日本、朝鲜、印度等地。幼虫多食性,为害烟草、甘蓝、马铃薯、甜莱、大豆、豌豆、菜豆等作物。1984年在哈尔滨大豆田中,从该虫幼虫自然死虫体内分离出一株核型多角体病毒。我们对该病毒的形态学进行了观察。这种病毒在国内外尚未见报道。并对12种夜蛾科害虫:迹幽夜蛾(Discestra stigmosa)、甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)、黄地老虎(Scotia segetum)、小地老虎(S.ipsilon)、银纹夜蛾     

用构建的新型BmNPV载体在家蚕高效表达人β-干扰素

构建了家蚕核多角体病毒(Bombyx mori nuclear polyhedrosis virus,BmNPV)新型载体pBm92,该载体将多角体蛋白基因的起始密码ATG改变为ATT,然后在多角体蛋白基因的+12位后连接有5个外源基因的克隆位点。将HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的+12位后,构建了pBmIFN+12;同时构建了HuIFN－β克隆在－3位后的转移载体pB．mIFN－3。将两种转移载体DNA分别与BmNPV基因组DNA共转染Bm—N细胞。利用重组病毒不产生多角体蛋白的特征,筛选重组病毒。用HuIFN－β基因探针与重组病毒DNA进行杂交鉴定。重组病毒BmIFN+12感染Bm-N细胞,其上清IFN活性为2．0×10⁶Iu／ml,将BmIFN+12注射5龄家蚕虫体,表达水平为5．O×10⁷Iu／ml,是HulFN-β基因克隆在多角体蛋白基因的-3位后获得的重组病毒表达量的2—4倍。构建的新型BmNPv载体能够在家蚕高效地表达HuIFN-β。家蚕虫体生产的rHulFN-β蛋白具有天然HuIFN-β的抗原性。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫体系中的表达

利用组建的苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)非融台蛋白基因转移载体将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因成功地插入粉纹夜蛾(Tn)NPV中,HBsAg基因在感染了重组病毒的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞以及粉纹夜蛾和蓖麻蚕等虫体中获得了表达,免疫电镜下观察到典型的乙型肝炎病毒表面抗原22nm颗粒。感染重组病毒的蓖麻蚕预蛹每克蛹重可产HBsAg蛋白1．6μg。表达产物经DEAE－纤维素层析得到的HBsAg粗提物可作临床检测用,再经抗体亲和柱层析可得到纯的HBsAg。     

甜菜夜蛾核多角体病毒BAC-TO-BAC外源基因表达系统的建立

用直接克隆法将miniF-lacZ-attFn7-kan 片段插入甜菜夜蛾核多角体病毒（Spodoptera exigua multicapsid nucleopolyhedrovirus, SeMNPV）〖JP〗美国分离株（SeUS1）基因组的多角体蛋白基因框内,miniF是大肠杆菌F因子复制子,携带miniF的重组病毒能够在大肠杆菌中低拷贝稳定复制,称为bacmid。由于SeUS1由不同的SeMNPV基因型组成,每个bacmid携带了一种病毒基因型,所有bacmid构成了SeUS1分离株的BAC文库。REN对111个bacmid分析表明,SeUS1分离株中除了包含具有完整SeMNPV遗传信息的基因型外,还包括不同类型的缺失基因型。将具有完整SeMNPV基因组的基因型SeBAC10转染昆虫细胞,可产生子代病毒,故SeBAC10是一种在真核细胞和原核细胞中均能复制的穿梭质粒。因为SeBAC10中多角体蛋白基因(Seph)被插入失活,将Seph作为报告基因通过位点特异性重组方式插入位于LacZ框内转座子Tn7的附着靶位点attTn7,得到重组SeBAC10 (即SeBAC10ph)转染甜菜夜蛾培养细胞Se301后,细胞出现典型的病理变化,核中出现多角体,证明SeMNPV BAC-TO-BAC外源基因表达载体系统构建成功。     

四种杆状病毒血清学关系的研究

血清学性质可作为病毒分类鉴定的依据,为此作者提纯芹菜夜蛾核多角体病毒-D克隆株（SfaMNPV-D)与棉铃虫单粒包埋核型多角体病毒（HaSNPV),斜纹夜蛾核型多角体病毒（SLMNPV）,粉蚊夜蛾颗粒体病毒（TnGV)等四种杆状病毒的病毒粒子和多角体蛋白（颗粒体蛋白）作为抗原免疫家兔后制取抗血清,经1%琼脂糖免疫电泳,结果发现多角体病毒之间血清关系比与颗粒病毒血清学关系更密切。     

双基因双重组AcNPV的构建及其杀虫活性

质粒pAcIEneo携带杆状病毒极早期基因IE1启动子驱动的新霉素抗性基因(neo),经酶切回收后插入到质粒pAc34DZ1的SacI位点上,构建成多角体外膜蛋白基因(pe)失活的转移载体pAc34DZ2。我们曾构建了一个多角体完整(ocu+)的表达苏云金杆菌(Bt)截短cryIab基因的重组病毒(1)vAcPhBtT。为了改进这一重组病毒的杀虫效率,将转移载体pAc34DZ2与重组病毒(1)vAcPhBtT DNA共转染Sf9细胞,进行第二次同源重组。由于neo基因的表达,用G418筛选得到重组病毒(2)vAcPhBtTPE^-;Southern blot证明vAcPhBtTPE-的构建是正确的,经SDS-PAGE分析,重组病毒(2)仍然能在昆虫细胞中表达80kD的Bt截短毒蛋白,但不表达34kD的多角体外膜蛋白。电镜观察重组病毒(2)无多角体外膜,碱解时病毒粒子释放的速度快于重组病毒(1)。以重组病毒(2)感染甜菜夜蛾三龄幼虫,LC₅₀比野生型病毒小了接近1倍,LT₅₀提前近2d。     

寄主植物对甜菜夜蛾感染核型多角体病毒后黑化反应关键酶活性的影响

【目的】明确寄主植物对感染核型多角体病毒的甜菜夜蛾Spodostera exigua (Hübner)幼虫体内参与黑化反应的关键酶的影响。【方法】借助紫外分光光度计或酶标仪,测定了取食不同食物(蕹菜、甘蓝、黄豆和人工饲料)的感毒与未感毒甜菜夜蛾幼虫血淋巴中多酚氧化酶、酪氨酸羟化酶和多巴脱羧酶含量。【结果】两因素分析显示,感毒和食物两个因子及其交互作用显著影响幼虫血淋巴中这3种酶的活性;进一步比较发现,取食蕹菜的感毒幼虫多酚氧化酶活性最高,取食甘蓝的次之,而以黄豆和人工饲料为食物的多酚氧化酶活性最低,感毒幼虫血淋巴中其他两种酶活性也表现相同的趋势。【结论】寄主植物能够调控感毒甜菜夜蛾幼虫体内参与黑化反应的关键酶活性,而这些关键酶活性的变化可能与寄主植物调控甜菜夜蛾对核型多角体病毒的敏感性有关。