圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因-sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约１０ｋｂ的ＤＮＡ片段。对其中１．８ｋｂ的ＰｖｕⅡ－ＳａｃⅡ片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有１１７０个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为４４７位的ＡＴＧ,终止密码子为１６１４位的ＴＧＡ,推测其编码一个３８９个氨基酸的蛋白质产物。利用ＢＬＡＳＴＸ程序进行了分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanK的克隆及功能研究

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。对其中1.8kb的PvuII-SacII片段进行了序列分析,结果表明：此片段中含有一个具有1170个核苷酸的完整开放阅读框,起始密码子为447位的ATG,终止密码子为1614位的TGA,推测其编码一个389个氨基酸的蛋白质产物。利用BLASTX程序进行的分析揭示,此基因编码一个肌氨酸单体氧化酶。基因功能研究结果表明,此基因与圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成直接相关,命名为sanK。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因一sanL的结构与功能

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段.序列分析表明此片段中除含有sanK外,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框——sanL.sanL与sanK的转录方向相同,具有1281个核苷酸,起始密码子为345位的ATG,终止密码子为1623位的TGA.利用Blastx程序进行的分析揭示,此基因可能编码一个赖氨酸-2-氨基转移酶.基因功能研究表明,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的.     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因—sanL的结构与功能

利用染色体步移策略,以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌中克隆到了一个大约10kb的DNA片段。序列分析表明此片段中除含有sanK外,在sanK的上游还有一个完整开放阅读框——sanL。sanL与sanK的转录方向相同,具有1281个核苷酸,起始密码子为345位的ATG,终止密码子为1623位的TGA。利用Blastx程序进行的分析揭示,此基因可能编码一个赖氨酸2氨基转移酶。基因功能研究表明,该基因是圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成所必需的。     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因：—sanJ的克隆及功能研究

以尼可霉素生物合成相关的基因片段为探针,从圈卷产色链霉菌cosmid基因文库中筛选到１个大约７．５kb的ＤＮＡ片段,交ＤＮＡ片段克隆到载体pBluescripM13-的KpnⅠ位点,得到了重组质粒pNL2200.对pNL2200中外源ＤＮＡ片段进行了一系列的亚克隆及部分核苷酸序列分析。结果表明,２．３kb的SalⅠ－ＢaｍＨⅠＤＮＡ片段中含有１个完整的开放阅读框,起始密码子为２７１位的ＧＴＧ,终止密码子为１９５４位的ＴＧＡ,该基因的大小为１６８６bp,编码１个大小为５６１个氨基酸的蛋白质产物。利用blastx程序的蛋白质数据库中进行同源比较,结果揭示此基因产物与腺苷酸形成酶超家族的连接酶有４４％的一致性,此外,该基因的破坏导致圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成能力的丧失,证明它是尼可霉素生物合成所必需的,命名为其为sanＪ。     

Tn4560在圈卷产色链霉菌中的转座及其在尼可霉素生物合成相关基因克隆中的应用

采用常规转化方法用来自天蓝色链霉菌J1 5 0 1的质粒pUC1 1 6 9(pMT6 6 0∷Tn45 5 6∷vph)多次转化尼可霉素产生菌圈卷产色链霉菌野生型 71 0 0的原生质体 ,均未得到转化子。采用限制性热衰减法于 5 0℃ ,3 0min溶菌制备 71 0 0的原生质体 ,获得了转化子 ,但转化频率极低 ,只有 0 4个转化子 μgDNA。用来自 71 0 0的pUC1 1 6 9再转化不含pUC1 1 6 9的 71 0 0原生质体 ,转化频率提高 1 0 3 ～ 1 0 4 倍。于 3 9℃ ,MM Vio条件下培养携带有pUC1 1 6 9的 71 0 0孢子 ,Tn45 6 0发生转座 ,筛选到 40 6 8个转座菌落 ,并从中得到 8株尼可霉素阻断突变株 ;对这 8株突变株的总DNA进行Southern杂交分析表明 ,Tn45 6 0至少在 4个不同的位点插入到 71 0 0的染色体上。用实验室已获得的与尼可霉素生物合成有关的 3 0kbDNA片段为探针和经不同酶切的 8株突变株的总DNA进行Southern杂交 ,结果表明 ,除阻断突变株Nik5有杂交信号且杂交信号大小均同野生型…     

圈卷产色链霉菌尼可霉素生物合成基因sanA的克隆、结构和功能

圈卷产色链霉菌是尼可霉素产生菌,经紫外线诱变后,以赤星灰霉为指示菌筛选到遗传稳定的尼可霉素生物合成阻断突变株,选择其中的NBB19为受体,以质粒pIJ702为克隆载体,从野生型圈卷产色链霉菌的DNA文库中克隆到了6kb的DNA片段,能互补NBB19使之恢复尼可霉素的产生能力.对6kbDNA片段中的部分片段进行了序列分析,结果表明2710bpDNA片段包含一个1365bp的完整开放阅读框架,编码一个由454个氨基酸残基组成的蛋白质,该基因命名为sanA.蛋白序列数据库比较结果表明,sanA编码的蛋白质氨基酸序列与Pyrococcus horikoshii的甲基转移酶有较高的同源性,353个氨基酸残基中有25%的一致性.用基因破坏策略研究了sanA的功能,野生型菌株sanA基因被破坏后导致失去合成尼可霉素的能力,表明sanA是尼可霉素生物合成中的一个新的重要基因.     

圈卷产色链霉菌san7324和san7324L基因阻断对形态分化和尼可霉素产生的影响

【目的】圈卷产色链霉菌全局性调控基因wblA阻断突变后,尼可霉素不再产生。RNA-seq和转录分析表明san7324基因在野生型菌株中可以正常转录,而在wblA阻断突变株(ΔwblA)中不能转录,为此本文旨在揭示san7324与尼可霉素产生的关系。【方法】利用同源双交换策略对san7324进行基因阻断,而后通过基因遗传回补及对尼可霉素生物合成相关基因的转录分析等方法研究san7324的功能。【结果】在相同培养条件下,阻断突变株Δsan7324与野生型菌株相比失去了合成尼可霉素的能力。我们通过同源比对发现圈卷产色链霉菌中还存在一个与san7324同源的基因san7324L,该基因的阻断导致尼可霉素产量降低。当san7324和san7324L两个基因同时被阻断后,得到的突变株Δsan7324-san7324L生长稀疏而且不能正常发育分化形成灰色表型的孢子或孢子链,只能形成白色表型的气生菌丝,同时也丧失了合成尼可霉素的能力。当这两个基因(san7324-san7324L)回补双突变株后,则恢复了野生型的表型(能形成孢子链并恢复尼可霉素的产生)。进一步的研究初步表明san7324和san7324L的阻断主要影响了尼可霉素生物合成基因簇中途径特异性调控基因sanG的转录水平,从而影响圈卷产色链霉菌的发育分化和尼可霉素的产生。【结论】该结果为链霉菌形态分化与生理代谢关系的研究提供了更多的证据,同时为多效调控基因wblA作用机制的阐明奠定了基础。     

圈卷产色链霉菌分化相关基因——saw1的结构和功能

用双脱氧链终止法进行了分化基因——saw1的双链测序.结果表明在1500bp的DNA片段中有一个完整的开读框架(ORF),其编码区是在419bp至1252bp处.其产物与已知的天蓝色链霉菌whiG的氨基酸序列有89%的同源性.当把1500bp的saw1DNA片段插入到链霉菌表达质粒载体pIJ702后,构建的重组质粒转化天蓝色链霉菌孢子形成缺陷突变株C71,可使C71形成孢子和灰色色素.用基因破坏的策略进一步研究了该基因的生物学功能,结果表明saw1在圈卷产色链霉菌气生菌丝到孢子形成的发育转变中有重要作用,是分化中控制孢子发育起始的一个重要基因.     

圈卷产色链霉菌7100分化相关基因——sawE的结构与功能

以天蓝色链霉菌的whiB基因为探针,从圈卷产色链霉菌7100的总DNA部分文库中克隆了含有whiB同源序列的28kb DNA片段,并对其中的14kb片段进行了序列测定。序列分析表明,该片段含有一个完整的开放阅读框—sawE。预测的蛋白质结构及同源性分析显示,sawE与天蓝色链霉菌孢子形成早期的关键基因whiB高度同源,编码产物为一个调控蛋白。sawE的破坏使圈卷产色链霉菌7100的分化终止在气生菌丝阶段,在延长培养时间的情况下仍保持白色的表型,菌丝不能分隔,不能形成成熟的灰色孢子,结果表明sawE基因是一个与圈卷产色链霉菌分化有关的重要基因。     

圈卷产色链霉菌分化及其特性的研究

链霉菌分化的分子生物学研究是一个饶有兴趣并富有挑战性的世界前沿研究课题.在原核生物的分化研究中,主要以枯草杆菌(Bacillus subtilis)作为模式系统,但枯草杆菌的生命周期尤其是分化过程远比链霉菌简单,不象链霉菌有基质菌丝、气生菌丝、菌丝螺旋和孢子分隔那样的发育分化过程[1].在真核生物中也有分化研究的报道,如构巢曲霉、酵母等.由于真核生物的基因结构比原核生物复杂得多,弄清分化中基因调控的关系就更加困难.因此,选用链霉菌作分化研究的材料有其独一无二的优越性.国际上有关链霉菌的分子生物学研究,近年来主要以链霉菌的抗生素生物合成基因和链霉菌的分化基因两个大的方面作为研究的热点和主攻方向,并展开了一些开拓性的研究.     

圈卷产色链霉菌lon基因的克隆及酶切分析

圈卷产色链霉菌是从我国东北土壤中筛选的一株Nkkomycin产生菌。在固体基本培养基上具有典型的链霉菌发育分化特征。经诱变得到不产孢子的白色突变株和不能形成气生菌丝的光秃型突变株。部分白色突变株和全部光秃型突变株在形态分化受阻的同时,也失去了产生Nikkomycin的能力。表明在圈卷产色链霉菌中,参与形态分化的基因与抗生素生物合成基因可能密切相关。     

林可链霉菌黑色素生物合成基因的克隆与表达

以pIJ702的melCl－C2基因为探针杂交林可链霉菌（Streptomyceslincolnensis）78－11染色体DNA,呈现出3．2kb的BamHI片段和2．6kb的SphI片段等一系列阳性条带。构建了含3．0～3．5kbBamHI片段的林可链霉菌78-11基因文库,从中分离克隆了黑色素生物合成基因melCl和melC2,并测定了含有mel基因的重组子pRSB336插入片段的全部DNA顺序。3152bpBamHI片段含有5个开放阅读框架,其中melCl和melC2与链霉菌属三个种的相应基因具有较高的同源性。此外,林可链霉菌78－11的melC2基因产物与人和鼠的酪氨酸酶轻微同源,分别为17．3％和24．5％。种种迹象表明,melCl、melC2和orf3组成黑色素生物合成操纵子结构。为了进一步鉴定上述克隆的林可链霉菌78-11黑色素生物合成基因,构建了分别含有新霉素抗性基因启动子和正反方向mel基因的重组质粒pPZ518和pPZ519,并转化变铅青链霉菌TK23。随机挑选的12个pPZ518转化子在R2YE培养基上均能分泌淡褐色色素,而所有的pPZ519和pES1转化子则都呈白色。     

变铅青链霉菌对噬菌体φHAU3抗性与异常修饰之间的相互关系

变铅青链霉菌异常修饰突变菌株ＺＸｌ同时丧失了对噬菌体ＨＡＵ３的抗性,遗传学杂交结果揭示,ＤＮＡ降解和对ＨＡＵ３抗性这两种表型从不发生分离。以ＺＸｌ为宿主和链霉菌低拷贝质粒ＳＣＰ２衍生的载体ｐＩＪ９２２为载体,构建了变铅青链霉菌ＪＴ４６的基因组文库。在８０００多个转化子中获得了一个能使ＺＸ１对ＨＡＵ３显示抗性的杂合质粒,命名为ｐＩＪ８３１０。它除了含有完整的ｐＩＪ９２２外,还携带了大约１１ｋｂ的外源片段。Ｓｏｕｔｈｅｒｎ杂交证实,这个外源片段来源于ＪＴ４６,但在ＺＸ１中完全消失。利用转座子Ｔｎ４５６０对该克隆进行诱变定位,获得了中断噬菌体抗性基因表达的衍生质粒,并已证实Ｔｎ４５６０插入在一个２．５ｋｂ的ＢｄｍＨＩ一ＥｃｏＲＩ片段上。     

阿维链霉菌中aveD基因阻断对阿维菌素合成的影响

利用用于基因破坏的重组质粒pCZ2 (pKC1 1 39∷ 475bpaveD)对阿维菌素 (Avermectin)产生菌阿维链霉菌 (Streptomycesavermitilis) 76- 9的aveD基因进行插入失活 ,将获得的aveD破坏子进行摇瓶发酵和阿维菌素初步提取和HPLC检测 ,发现破坏子仅产生四个主要组分 ,但它们的保留时间分别比Bla、Blb、B2a和B2b的略长。进而将粗提液纯化并获得晶体 ,以UV、IR、NMR ( 1H NMR和13C NMR)和MS进行结构分析 ,并结合HPLC检验 ,证明它们属于C5 氧 阿维菌素B。说明阿维链霉菌的aveD基因破坏 ,不仅丧失了合成阿维菌素A组分的能力 ,也造成了其下游的aveF基因不能表达 ,因此只产生了C5 氧 阿维菌素B。     

林肯链霉菌谷氨酰胺合成酶的酶学性质

在分离纯化的基础上,报道了pH、温度和金属离子对林肯链霉菌(Streptomyceslincolnensis)Z-512谷氨酸胺合成酶(GS)活力的影响及GS底物专一性的研究结果.在动力学性质的研究中,发现林肯链霉菌GS在生物合成反应系统中,对底物NH_4CI的饱和曲线不遵守米氏方程.Hill作图呈两相曲线.在NH_4CI浓度低的情况下,Hill系数大于1,具有正协同效应;当NH_4CI浓度增加到一定程度时,Hill系数小于1,具有负协同效应.这说明NH_4CI不仅作为林肯链霉菌GS的底物,而且作为一种效应物调节GS的活性.林肯链霉菌GS对底物Glu及ATP的饱和曲线遵守米氏方程.在不同的激活离子存在下,GS对Glu、ATP的Km值也不同.