Characterization of the Hemolytic Properties of an Extract from Phaeocystis globosa Scherffel

Phaeocystis globosa Scherffel, an organism that causes harmful algal blooms, is a genus of the family Prymnesiophyta (or Haptophyta) with eurythermal and euryhaline characteristics. P. globosa has been confirmed to produce hemolytic substances, which are a mixture of liposaccharides. In the present study, the hemolytic properties of extract of P. globosa are analyzed further. The effects of temperature, pH,different divalent cations, and membrane lipids on extract-induced hemolysis are discussed, as is the possible hemolytic mechanism. The results of the present study showed that the hemolytic activity of the extract was approximately 127.1 hemolytic units (HU)/L. The hemolytic reaction became fastest and a 50% decrease in absorbance was induced at 30 min at 37℃, and at pH 7.0; Hg^2 was the strongest inhibitor of the hemolysis compared with the other divalent cations and many membrane lipids, except for phosphatidic acid, inhibited the hemolytic activity to different degrees. These results suggest that the toxin may make pores in the surface of red blood cells and that Hg^2 either combines with the hemolysin or closes the pores,hence inhibiting its further hemolytic reaction. The toxin probably has no specific membrane receptor in the red blood cell membrane.     

球形棕囊藻生长的营养需求研究

以球形棕囊藻(Phaeocystis globosaScherffel)香港株(Hongkong strain,HK)和汕头株(Shantou strain,ST)为材料,采用正交实验方法研究了氮、磷、铁、微量元素及维生素等营养因子对其生长的影响。磷是球形棕囊藻香港株和汕头株生长的首要限制因子,在添加磷的培养基中,球形棕囊藻生长较快,在无磷培养液中,藻细胞生长较慢,其死亡速率超过生长速率,一般不形成正常生长曲线。汕头株的比生长速率极差值远高于香港株,表明汕头株棕囊藻的生长对营养盐更为敏感。磷酸盐对球形棕囊藻生长的影响极为显著(p<0.01),硝酸盐的影响达到显著水平(p<0.05),而铁、微量元素及维生素对球形棕囊藻生长影响不显著,表明自然海水中铁、微量元素及维生素的含量对球形棕囊藻的生长不构成限制。各因素影响的主次次序为P>N>微量元素>铁>维生素。本研究结果提示,海水富营养化是我国南海海域球形棕囊藻赤潮发生的关键诱因之一。     

实验室培养球形棕囊藻溶血毒素的提取、分离及其生成特征

研究从实验室培养的球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)提取溶血毒素的条件,探讨不同生长期球形棕囊藻溶血毒素的生成特征,用薄层色谱法对溶血成份进行了初步分析。结果表明,球形棕囊藻细胞壁的超声波破碎最适条件为：功率600W,4℃下处理30min。对数生长期、平稳期和衰亡期藻细胞适宜处理量分别为每次3000、2000、1000ml;在球形棕囊藻生长的平稳期和衰亡期具有明显的溶血活性,对数生长期溶血活性很低,甚至检测不到。球形棕囊藻溶血毒素至少含有4种糖脂类化合物。     

球形棕囊藻游离单细胞的密度与囊体形成的关系研究

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa Scherffel)主要以囊体形态形成赤潮,由单细胞向囊体形态的转变是赤潮爆发的关键。本研究推测囊体形成的前提是游离单细胞达到一定密度阈值,当密度低于该阈值时,囊体无法形成。基于此,本文探究了不同条件(温度、营养充气搅动、摄食压力、初始密度)下囊体形成时游离单细胞的密度。结果显示:不同培养条件下,囊体形成所需的游离单细胞密度不一致,但都达到了104cells/mL的数量级;稀释试验表明,利用f/2培养基稀释使游离单细胞的密度小于104cells/mL时,囊体不能形成,而密度大于104cells/mL的游离单细胞对照组,在24 h内便有囊体形成。总的来说,游离单细胞在高密度情况下更容易形成囊体。     

营养胁迫下球形棕囊藻(Phaeocystis globosa Scherffel)的生长行为及溶血活性

近年来,我国广东沿海连续出现大面积球形棕囊藻(Phaeocystis globosaScherffel)赤潮,产生溶血毒素等有害物质,给当地的海洋养殖业造成重大的经济损失。研究不同的生长时期及半连续培养时不同营养盐胁迫下,球形棕囊藻溶血毒素的产生行为。结果显示,批量培养的球形棕囊藻处于生长平稳期末时,溶血活性最大((21±1)units/L);半连续培养时,营养盐限制对球形棕囊藻的生长有明显的抑制作用,其中Fe3 及N盐限制影响最为明显。同时,营养盐限制也可促进棕囊藻溶血毒素的合成,其中Fe3 和-Mn2 的限制性时球形棕囊藻溶血活性显著增强。这些结果表明,球形棕囊藻溶血毒素的产生与藻细胞的生长可能受不同机制的调节,溶血毒素的合成可能是环境胁迫下棕囊藻维持生存的一种策略。     

二氧化氯对球形棕囊藻的抑制和杀灭作用

以海洋赤潮生物-球形棕囊藻汕头株(Phaeocystis globosa,ST strain)为材料,研究了ClO2对不同起始藻密度的棕囊藻的抑制和杀灭作用．结果表明,ClO2对球形棕囊藻有明显的抑制和杀灭作用．藻密度为2．35×10^9cells·L-1时,高于0．74×10-2mmol·L-1的ClO2对棕囊藻生长有一定的抑制作用。高于2．96×10-2mmol·L-1的ClO2对棕囊藻具有显著的杀灭作用．藻密度与ClO2浓度之间存在一定的剂量关系．藻密度为2．35×10^9、1．18×10^9、4．70×10^8、1．18×10^8 cells·L-1时。其96h的有效杀藻浓度分别为2．96×10^-2、2．22×10^-2、1．48×10^-2和0．59×10^-2mmol·L^-1．藻密度越高。杀灭单位藻细胞所需ClO2的浓度越低．ClO2作为杀藻剂在赤潮治理中具有很好的应用前景．     

不同氮源对球形棕囊藻生长的影响

采用实验室培养的方法比较了6种不同氮源-硝态氮、尿素、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸、腺嘌呤对典型赤潮藻球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)生长的影响。结果表明,6种氮源均能不同程度地促进球形棕囊藻的生长,但比生长速率和光合作用效率具有显著差异性。将球形棕囊藻在不同浓度氮源下的最大比生长速率分别拟合Monod方程,得出球形棕囊藻在硝态氮、尿素、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和腺嘌呤等6种氮源下的最大比生长率分别为1.05,1.17,0.82,0.87,1.09,0.90d^-1,相应的半饱和常数分别为9.132,23.758,85.519,7.104,23.94,10.959μmol/L。其中,高氮浓度(8820μmol/L)下腺嘌呤对球型棕囊藻的生长具有显著抑制作用。相比较而言,球形棕囊藻对甘氨酸的亲和力最高。当硝态氮、尿素、甘氨酸、精氨酸、谷氨酸和腺嘌呤的浓度分别为8820,882,882,8820,882,0.441μmol/L时,球形棕囊藻的最大光合效率(Fv/Fm)分别为0.619,0.620,0.579,0.595,0.648,0.667。由此可见,氮源对球形棕囊藻的生长和光合作用具有显著影响;球形棕囊藻能够利用多种无机和有机氮源,与其它仅能利用无机氮源的浮游植物相比,更具有竞争优势。     

充气和搅动对球形棕囊藻生长及囊体形成的影响

球形棕囊藻生活史中包含游离单细胞和球形囊体两种生活形态,但是实验室中培养的球形棕囊藻经常无法形成囊体。研究通过向培养基中泵入过滤空气,以及给培养基提供不同程度的搅动,研究了充气和搅动对球形棕囊藻生长及囊体形成的影响。充气和搅动均显著提高了囊体的数量,并且提高了囊体内细胞的生长速率。但是充气对于囊体直径及囊体内细胞密度并无显著影响。搅动则明显的提高了囊体直径和囊体内细胞数量。然而,尽管充气以及搅动有利于球形棕囊藻囊体的形成,但是培养的囊体直径依然小于自然海区中囊体的大小。     

硝酸盐对球形棕囊藻生长和硝酸还原酶活性的影响

以我国南海海域分离的赤潮原因种——球形棕囊藻(Phaeocystisglobosa)为材料,研究了不同硝酸盐浓度下藻细胞生长及硝酸还原酶活性的变化。当培养基中不含硝酸盐时,藻细胞内硝酸还原酶的活性保持在非常低的水平,藻细胞的生长受到限制,不能形成正常的生长曲线:当培养基中硝酸盐浓度为3.62μmol.L-1时,藻细胞的硝酸还原酶活性和比生长速率达到最大。在含有硝酸盐的培养基中,接种培养后第9天藻细胞硝酸还原酶活性达到最大值,并且在4种不同硝酸盐浓度下,藻细胞硝酸还原酶活性的差异性达到极显著水平(P<0.01)。在接种培养第16天藻细胞密度达到最大值,并且4种不同硝酸盐浓度培养的藻细胞密度之间的差异性也达到极显著水平(P<0.01)。实验结果表明,在培养基中添加不同浓度的硝酸盐,对球形棕囊藻细胞硝酸还原酶的活性和藻细胞的生长有极显著的影响,含有较高硝酸盐的富营养化海域有利于球形棕囊藻细胞的持续生长。     

有害赤潮生物球形棕囊藻对卤虫的毒性研究

利用1997年10月和1998年6月分别在广东汕头饶平海域和香港海域分离到的球形棕囊藻,即球形棕囊藻香港株(Phaeocystis globosastrain HK)和球形棕囊藻汕头株(Phaeocystis globosastrain ST),在实验室条件下研究其对四日龄卤虫(Artemia sinica)的急性毒性。结果表明,对数生长期的HK株藻液24h对卤虫LC₅₀约为2.9×10⁵cell·mL^-1。对数期的ST株对卤虫的毒性难以达到半致死浓度,衰亡期的ST株24h对卤虫LC₅₀约为9.89×10⁶cell·mL^-1。在上述浓度下两者半致死时间分别为20.91h和26.62h,而对数生长期的HK株和衰亡期的ST株的培养物过滤液24h对卤虫LC₅₀则分别为7.1×10⁵cell·mL^-1和1.457×10⁷cell·mL^-1,且在该浓度下的半致死时间分别为26.56h和28.02h。实验表明,HK株藻液和滤液的毒性均大于ST株,且藻液的毒性均大于滤液。     

红树植物木榄有机溶剂提取物对球形棕囊藻的抑制效应

基于化感作用原理,利用有机溶剂对红树植物木榄(Bruguiera gymnorrhiza)叶片中的活性物质进行连续提取分离,分别得到正己烷相、乙酸乙酯相、正丁醇相和水相提取物。利用这些提取物进行抑藻实验,通过测定球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)的细胞密度发现:四种组分提取物对球形棕囊藻均具有显著的化感抑制作用;正己烷相和乙酸乙酯相提取物对球形棕囊藻的抑制效果明显优于正丁醇相和水相提取物的抑制效果。正己烷相提取物和乙酸乙酯相提取物对球形棕囊藻的48hEC₅₀分别为14.90mg/L和12.18mg/L。研究表明,藻细胞初始接种密度影响提取物的抑藻效应,低接种密度时抑制率极高,而随着接种密度的升高抑制率下降;接种密度极高时,提取物不但不会抑制甚至还会促进藻细胞的生长。     

二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质、DNA含量的影响

分析了二氧化氯(1.0、1.5、2.0、2.5mgL-1,作用96h;2.5、6.0、8.0、16.0mgL-1,作用60min)对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质含量、氨基酸组成、核酸含量的影响,用透视电镜对二氧化氯(0.5mgL-1,0.8mgL-1)作用24h后藻细胞形态的变化进行了观察,以探讨二氧化氯去除赤潮藻的机理。结果表明,二氧化氯对球形棕囊藻叶绿素a、蛋白质、DNA的含量均有影响。实验各组(1.0-2.5mgL-1,2.5-16.0mgL-1)球形棕囊藻的叶绿素a、蛋白质、DNA的含量均显著低于对照。二氧化氯浓度超过2mgL-1时,球形棕囊藻的叶绿素a、蛋白质、DNA的含量持续降低,氨基酸相对含量发生明显变化;半胱氨酸、酪氨酸和赖氨酸等的相对含量明显降低,而组氨酸、缬氨酸和苯丙氨酸则明显增加。当二氧化氯(2.5-16.0mgL-1)作用3min后,DNA漏出率在13%-18%之间;电镜观察发现,二氧化氯可使细胞膜破损,引起内容物外泄。这些结果显示,二氧化氯能以单分子形式进入细胞,引起叶绿素、蛋白质结构的变化,并破坏藻细胞膜系统,最终导致藻细胞死亡。     

球形棕囊藻对五种水生动物的急性毒性作用

利用室内半静水法研究球形棕囊藻培养液、藻细胞悬浮液、去藻细胞滤液、藻细胞内容物、藻细胞碎片以及溶血毒素粗提物对卤虫(Artemia sinica)、褶皱臂尾轮虫(Brachionus plicatilis)、蒙古裸腹潘(Moina mongolia)、赤点石斑鱼幼鱼(Epinephelus akaara)和南美白对虾(Penaeus vannamei)5种水生动物的影响,并对其致毒途径进行分析.结果表明,与对照相比,培养液、藻细胞悬浮液处理卤虫,其运动速度下降,培养液、藻细胞悬浮液与毒素粗提物处理轮虫72 h,存活率显著降低(P＜0.05),卤虫、轮虫消化道中充满藻细胞,提示摄食球形棕囊藻可能是引起卤虫、轮虫中毒的主要途径.培养液、滤液和藻细胞内容物对赤点石斑鱼幼鱼均有显著的致死作用,而藻细胞碎片和溶血毒素粗提物对幼鱼的存活无明显影响,表明球形棕囊藻细胞表面并不存在毒性物质,球形棕囊藻可能会分泌有毒物质进入水体,进而影响鱼类的生长.培养液、藻细胞悬浮液、去藻细胞滤液、毒素粗提物处理蒙古裸腹溞72 h虽有死亡,但存活率与对照无显著差异;南美白对虾的情况与蒙古裸腹溞类似,表明球形棕囊藻及相关组分对蒙古裸腹溞和对虾的影响较小.这些结果表明,球形棕囊藻对不同生物的毒害作用不同;摄食和分泌有毒、有害物是球形棕囊藻引致生物中毒的主要途径;除了溶血毒素以外,球形棕囊藻还可能产生其他鱼毒性物质.     

湛江棕囊藻对南美白对虾虾苗和多种鱼苗的毒性研究

测定了湛江棕囊藻赤潮海水和棕囊藻(Phaeocystis globosa)对南美白对虾(Penaeus vannamei Boone)虾苗、青石斑鱼(Epinephelus awoara)、鲻鱼(Mugil cephalus)和尖吻鲈鱼(Latescal carifer)鱼苗的毒性。结果表明,棕囊藻对虾苗有一定的毒性,24 h LC50为1.0×109 cells L-1,去除囊泡液后的棕囊藻碎片对虾苗毒性较弱,细胞密度为1.0×109 cells L-1时,24 h虾苗的死亡率仅为10%,赤潮海水对虾苗无毒性;棕囊藻囊泡液对青石斑鱼有一定毒性,24 h LC50为囊泡液占海水总体积的10.9%,赤潮海水对青石斑鱼苗无毒性;棕囊藻对尖吻鲈鱼和鲻鱼鱼苗无毒性。     

球形棕囊藻(Phaeocystis globosa)叶绿体psaA基因片段的序列分析

根据GenBank中检索到的南极棕囊藻(Phaeocystis globosa)psaA基因序列设计psaAL和psaAR引物,对球形棕囊藻(Phaeocystis globosa),的psaA基因片段进行PCR扩增并测序,获得了629bp的DNA序列。应用clustal X对球形棕囊藻P1、P2株系和南极棕囊藻的psaA基因片段序列进行比对,结果表明,球形棕囊藻psaA基因片段序列无插入／缺失,核苷酸差异率为3.34％。应用DNAstar分析软件推断球形棕囊藻和南极棕囊藻的psaA基因对应的氨基酸序列和RNA二级结构,发现它们的氨基酸序列差异不大,序列中209个氨基酸只有1个发生了变化,其氨基酸变异率为0．48％;除部分结构域比较相似外,RNA二级结构上体现一定程度的差异,这可能对棕囊藻的分子分类研究有参考价值。因所获得的psaA基因片段序列及氨基酸序列具有种的极端保守性,不适宜用作Phaeocystis属种间的分子分类研究。     

18SrDNA序列分析鉴定棕囊藻香港株P2为球形棕囊藻

有毒赤潮原因种棕囊藻(Phaeocystis sp.)生活史复杂,且形体微小,缺乏明确可靠的分类标准。1997、1999年中国东南沿海发生两次棕囊藻赤潮,但目前种的鉴定仍存在混乱。本文测定了香港海域一株棕囊藻赤潮原因种P₂的18SrDNA部分核苷酸序列,序列长度为650bp,并对其进行了分子鉴定,结果表明其为球形棕囊藻(P.globosa)。     

基于叶绿素荧光研究球形棕囊藻在富磷条件下的生长特性

棕囊藻属于定鞭藻纲、定鞭藻目,广泛分布在不同海洋生态环境中。有报道指出,棕囊藻时常在北太平洋温带港湾、挪威海、北海、英吉利海峡及南极海域等地方引发的大规模有害赤潮。近年来,我国东海海域和南海粤东海域均发生较大面积的棕囊藻赤潮,给当地的水产养殖业带来了严重的影响。除此之外,棕囊藻具有特殊的生理机制,可以产生二甲基硫化物(DMS),对整个海域的气候状况,酸雨酸雾的形成以及全球硫循环都有重要的意义。本文以球形棕囊藻为研究材料,设置3组较高的磷浓度处理(5mg·L^-1、10mg·L^-1和20mg·L^-1),利用细胞记数和叶绿素荧光测定等方法研究了该藻在不同富磷浓度下的生长情况。结果显示,不同磷浓度下的藻体荧光值变化均呈现"S"型曲线,表明藻细胞的生长经历缓慢期,快速期和平缓期3个阶段;同时,试验所设置的磷浓度对球形棕囊藻的叶绿素荧光值有一定的影响,其中在5mg·L^-1磷浓度下的藻体荧光值最低,在第7天只有802μg·L^-1,而在10mg·L^-1和20mg·L^-1磷浓度下的藻体荧光值较高,在第7天分别达到836μg·L^-1和850μg·L^-1,表明磷营养可以促进藻细胞的生长增殖,但在较高磷浓度下,这种促进作用不明显。结果还显示,较低浓度的磷(5mg·L^-1)减缓与限制了藻细胞的生长,在5mg·L^-1磷浓度下的藻最大特定比生长速率和细胞密度分别只有0.704d^-1和190cells·mL^-1。相对而言,20mg·L^-1磷浓度下的藻最大特定比生长速率和细胞密度最高,分别达到了0.771d^-1和250cells·mL^-1。研究结果揭示,水体中的磷营养浓度的变化是导致藻细胞大量增殖的一个主要的外在因素,而利用叶绿素荧光来测定藻细胞生长是一种快速、简便和可靠的方法,在今后有害水华监测过程中应该多加利用,以更及时、准确地预测预报有害水华的发生,降低其对经济、环境和社会造成的潜在危害。     

不同形态的磷源对球形棕囊藻生长及碱性磷酸酶的影响

研究了不同浓度和形态的无机磷(DIP)和有机磷(DOP)对球形棕囊藻细胞生长、培养基中磷浓度的变化以及碱性磷酸酶活性的变化的影响。在缺磷和大分子DOP(卵磷脂)作为磷源的情况下,碱性磷酸酶活性迅速提高,在第9天达到了最大值,其活性分别为19.11U和18.28U,显然在缺磷胁迫下和大分子DOP的利用过程中碱性磷酸酶起着重要作用。DIP(磷酸二氢钾)和小分子DOP(β-甘油磷酸钠)都容易直接被球形棕囊藻吸收利用,碱性磷酸酶活性变化不明显。     

Ca~（2＋）对蝮蛇蛇毒溶血毒素构象的影响

利用荧光光谱学对８ＰＬＡ＿２和Ｃａ￣（２＋）相互作用的研究表明,Ｃａ￣（２＋）在ＢＰＬＡ＿２中十分重要。在Ｃａ￣（２＋）存在时,底物与ＢＰＬＡ＿２的结合使酶中色氨酸残基周围的环境变得较为疏水,荧光发射谱蓝移达９ｎｍ,而无Ｃａ￣（２＋）存在时却无此现象发生;实验证明ＢＰＬＡ＿２分子中有一较强的疏水区,Ｃａ（２＋）可明显增强这一区域的疏水性;另外,我们还发现Ｇａ￣（２＋）与酶的结合与酶中唯一的Ｈｉｓ残基有关。     

Ca2＋对蝮蛇蛇毒溶血毒素构象的影响

利用荧光光谱学对BPLA₂和Ca^2＋相互作用的研究表明,Ca^2＋在BPLA₂中十分重要.在Ca^2＋存在时,底物与BPLA₂的结合使酶中色氨酸残基周围的环境变得较为疏水,荧光发射谱蓝移达9nm,而无Ca^2＋存在时却无此现象发生;实验证明BPLA₂分子中有一较强的疏水区,Ca^2＋可明显增强这一区域的疏水性;另外,我们还发现Ca^2＋与酶的结合与酶中唯一的His残基有关.