水稻巯基蛋白酶抑制剂的纯化及其性质研究

水稻的糠皮和胚经生理盐水浸取、离心后的上清液加热至８０℃处理１０ｍｉｎ,离心获得的上清液调ｐＨ至８．０,得到沉淀。沉淀溶解于０．０１ｍｏｌ／ＬＨＣｌ,经透析冷冻干燥得水稻巯基蛋白酶抑制剂（ＣＰＩ）粗品;粗品再经ＤＥＡＥ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ柱线性离子梯度洗脱和ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００柱分子筛层析,即可获得在ＰＡＧＥ、ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和ＨＰＬＣ上均为单一蛋白带的ＣＰＩ样品。经上述步骤,ＣＰＩ可被纯化５８倍。经ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－１００和ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测定其分子量均为１２０００,Ｎ末端氨基酸为Ｐｒｏ,等电点５．６．水稻ＣＰＩ经１００℃处理１０ｍｉｎ后,其抑制活性无任何变化,在ｐＨ２．０～９．０之间,活性也不发生改变,但ｐＨ在９．０以上,其活性逐渐下降,水稻ＣＰＩ对木瓜蛋白酶是一种高亲和性的抑制剂,它对木瓜蛋白酶和无花果蛋白酶有强抑制作用,对菠萝蛋白酶仅有弱抑制作用,但对胰蛋白酶则全无抑制作用;其抑制类型属竞争性抑制剂类型,Ｋ＿ｉ值约３．５×１０￣（－８）ｍｏｌ／Ｌ对木瓜蛋白酶的抑制摩尔比约为１：１。     

水稻巯基蛋白酶抑制剂研究进展

综述水稻巯基蛋白酶抑制剂 (Oryzacystatin ,OC)近年的研究进展。巯基蛋白酶抑制剂 (CPI)统称为胱蛋白超家族。OCI含有CPI家族的典型保守序列Glu -Val-Val-Ala -Gly ,这是其抑制活性不可缺少的区段。利用水稻cDNA文库还克隆得到OCII。OCI与OCII之间在序列上有高度的同源性 ,但在对蛋白酶的抑制作用上有显著差异。OC对鞘翅目昆虫有较强的抗虫性。在抗病方面 ,OC可抑制稻瘟病菌丝体的生长     

水稻巯基蛋白酶抑制剂cDNA在大肠杆菌中的表达

根据从水稻未成熟种子cDNA文库中筛选出的水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacys-tatin)cDNA序列,利用聚合酶链反应(PCR)技术扩增出Oryzacystatin编码区,插入到温度敏感型大肠杆菌表达载体的PtPL启动子下游．该质粒带有温度敏感型阻遏子的编码基因cIts857。转化大肠杆菌DH5a后。通过升温诱导,Oryzacystatin在大肠杆菌中获得高教表达,SDS—PAGE表明分子量约为12kDa。与预期结果一致,表达量占细菌可溶性蛋白总量的10％以上,对巯基蛋白酶的抑制活性检测表明,可溶性蛋白组分对木瓜蛋白酶有明显的抑制活力。     

水稻巯基蛋白酶抑制剂的分子修饰与其对稻瘟病菌的抑制作用

水稻巯基蛋白酶抑制剂（ＣＰＩ）经用二硫苏糖醇,对氯汞苯甲酸和碘乙酸修饰后,对木瓜蛋白酶的抑制活性并无改变;用Ｎ－乙基顺丁烯二酰亚胺与ＣＰＩ反应,可以测出ＣＰＩ分子内有１９个巯基被修饰,被修饰后,抑制活性仍无改变,表明水稻ＣＰＩ的抑制活性不需要巯基参与;应用Ｎ－溴代丁二酰亚胺与ＣＰＩ反应,可测出ＣＰＩ分子内有２个Ｔｒｐ被修饰,修饰后,抑制活性全部丧失,表明Ｔｒｐ是保持抑制活性所必需的基团。水稻巯基蛋白酶抑制剂和丝氨酸蛋白酶抑制剂对稻瘟病菌丝体的生长均有抑制作用,但后者的抑制作用比前者更强,若将两种抑制剂混合使用,则对稻瘟病菌丝体的抑制作用非常强烈;当抑制剂加入量达７２μｇ时,即可产生明显的抑制作用。     

马铃薯蛋白酶A抑制剂的纯化与性质

采用硫酸铵沉淀、Sephadex G-50和CM柱层析,从马铃薯汁中纯化蛋白酶A（protease A,PrA）抑制剂,并对其部分性质进行研究。蛋白酶A抑制剂为单亚基,相对分子质量为16．71kDa。热稳定性良好,抑制最佳pH范围为5—5．5,最佳反应时间为1．5h,对PrA抑制类型为竞争和非竞争性混合抑制作用。     

茶树巯基蛋白酶抑制剂基因cDNA在大肠杆菌中的表达

通过RT-PCR法扩增出茶树中巯基蛋白酶抑制剂基因(Tea cystatin,TC)cDNA编码区序列,定向克隆到表达载体pET 32 a( )上,得到重组质粒pET-TC,在表达宿主菌BL21 trxB(DE3)中高效表达,产生分子量约为31.8 kD a的特异融合蛋白。实验表明:随着诱导时间的延长,表达的融合蛋白Trx-TC的产量逐渐增加,特异蛋白的表达量最高可占菌体总蛋白的35.4%;在15℃、25℃、30℃和37℃四个不同诱导温度下,均能诱导产生融合蛋白;IPTG终浓度在0.5 mm ol/L~5 mm ol/L范围内均能诱导产生融合蛋白,表达的产物主要以可溶性蛋白形式存在。另外,体外酶促反应表明表达的融合蛋白Trx-TC对木瓜蛋白酶有明显的抑制活性。     

水稻cDNA文库的构建及巯基蛋白酶抑制剂cDNA的分离

取开花后2周左右的水稻未成熟种子提取总RNA,分离mRNA,进而反转录合成cDNA并定向插入λgt22A克隆载体,经体外包装建成水稻未成熟种子的表达型 cDNA文库,经测定库容量达 1.5 × 10⁶ Pfu.进一步人工合成水稻巯基蛋白酶抑制剂(Oryzacystatin)编码基因5＇-端保守的21Nt的寡核苷酸经末端标记作为探针,从 2.1×10⁴Pfu中筛选出 9个阳性克隆,经鉴定其中 8个含有完整的水稻巯基蛋白酶抑制剂编码序列,对 1号克隆的序列分析表明,其除含有 309 bp的水稻巯基蛋白酶抑制剂编码序列外,在 5＇-端及 3＇-端还分别含有 84 bp和 497 bp的非编码序列,其中 3＇-端带有AATAAAA两个加尾信号以及31 Nt的Poly(A)尾,同水稻巯基蛋白酶抑制剂基因组序列比较,编码区碱基序列完全一致,但5＇-端和3＇-端非编码区有明显差异,其中加尾信号以后的cDNA碱基序列中含有大量的不连续插入.     

用聚焦层析法纯化人巯基蛋白酶抑制肽C-hCRI_c

以肾衰病人尿为材料,通过碱变性、酸变性和热变性除去部分杂质和尿蛋白。然后用羧甲基-木瓜蛋白酶-琼脂糖4B亲和层析,最后用多缓冲剂聚焦层析,把人的巯基蛋白酶抑制肽C(human cysteine proteinase inhibitor C,简称 hCPI_C)和其他的hCPI_C分开,制备得高纯度、高活性的hCPI_C。在SDS-PAGE中为均一条带,每mg蛋白可抑制50单位木瓜蛋白酶活性的50-63％。     

水稻半胱氨酸蛋白酶抑制剂基因的克隆及其mRNA在水稻中的组成型表达

从40年代发现豆科植物中存在蛋白酶蛋白抑制剂以来,在动物、植物和微生物体内已发现普遍存在着多种类型的蛋白酶抑制剂(PI)。人们往往是为了研究某种蛋白酶的作用机制或出于某种应用目的去分离和研究PI的,对PI的真正生理功能尚不十分清楚。一般认为除防止体内不必要的蛋白降解作用、调节蛋白代谢及调节各种蛋白酶的生理活性外,很多植物的PI还具有抑制某些病源微生物及某些昆虫体内蛋白酶的作用,从而对植物有防卫功能。Hilder等和Johnson等已分别将属于丝氨酸蛋白酶抑制剂的豇豆蛋白酶抑制剂及马铃薯PⅠⅠ和PⅠⅡ基因转入烟草,结果转基因烟草对烟芽夜蛾(He-     

Purification and Characterization of a Rice Cysteine Proteinase Inhibitor

A proteinaceous substance that inhibited the activity of papain (EC 3.4.22.2) was found in seeds of rice, Oryza sativa L. japonica. This cysteine proteinase inhibitor (CPI) was purified by a series of purification procedures including CM-Sephadex C-50, Sephadex G-75, and DEAE- Sephadex A-50 chromatography. The CPI was a single polypeptide with a molecular weight of about 12,000, with an isoelectric point at pH 5.3. The CPI was stable below 100°C and between pH 2.2 ~ 9.0. The inhibition of papain by the CPI was non-competitive, with a Ki value of 2.44 × 10^-8 m. The complete inhibition of papain was reached by an equimolar concentration of the CPI.     

Letter to the Editor: 1H, 15N and 13C NMR Resonance Assignments of Staphostatin A, a Specific Staphylococcus Aureus Cysteine Proteinase Inhibitor

The increasing antibiotic resistance of an important human pathogen Staphylococcus aureus calls for the development of new therapeutic strategies. Staphylococcal cysteine proteases have been suggested as targets for such therapies. The recent discovery of staphostatins, specific protein inhibitors of these enzymes, gives prospects for the design and production of synthetic, low molecular weight analogs which might become drugs. We have decided to structurally characterize staphostatin A, a representative inhibitor of staphylococcal cysteine proteases, and to assess its binding mode to the target protease with the view of clarifying the specificity determinants. Here we report the (1)H, (15)N and (13)C NMR resonance assignments of staphostatin A.     

镰形扇头蜱两个组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶新基因的克隆与序列分析

蜱是动物常见的外寄生虫,并且传播多种人和动物的疾病,严重危害畜牧业发展和人类健康。为了寻找基因工程疫苗候选抗原基因,根据半胱氨酸蛋白酶的保守性氨基酸序列及镰形扇头蜱氨基酸密码子偏好设计引物,PCR扩增、测序并分析得到2个镰形扇头蜱的半胱氨酸蛋白酶基因片段cysA和cysB,再通过RACE的方法得到全长基因序列。cysA全长168bp,编码332个氨基酸;cysB全长1153bp,编码335个氨基酸。经过分析, CysA和CysB均与其他蜱种或物种的组织蛋白酶L样半胱氨酸蛋白酶有高度同源性,两者均含有半胱氨酸蛋白酶活性位点处的保守性氨基酸序列, 因此cysA, cysB均为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶L-样半胱氨酸蛋白酶基因。RT-PCR分析表明,CysA和CysB在镰形扇头蜱的不同发育阶段表达情况不一。     

萌发绿豆中水解大豆胰蛋白酶抑制子蛋白酶的纯化及固定化

大豆是豆类植物中最早发现存在蛋白酶抑制子的 ,由于其存在影响了豆类的利用价值 ,因此研究人员一直在寻找着解决办法。采用加热处理方法不能彻底钝化豆类蛋白的蛋白酶抑制子活性 ,且豆类蛋白的含硫氨基酸主要存在于各类蛋白酶抑制子中 ,从豆类蛋白中除去抑制子蛋白将大大降低其营养效价。本研究的目的是试图寻找一种可在常温下降解豆类胰蛋白酶抑制子的蛋白酶 ,从而钝化豆类的胰蛋白酶抑制活性。在前期工作中 ,我们发现枯草杆菌蛋白酶 (Ｓｕｂ ｔｉｌｉｓｉｎ)可在在常温下降解花生及大豆胰蛋白酶抑制剂[1] ,近期我们的研究表明 ,Ａｌｃａ…     

粘质赛氏菌胞外蛋白酶的提取、纯化及部分性质研究

经过硫酸铵３０％～５０％分级沉淀、二步柱层析可获聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的粘质赛氏菌胞外蛋白酶制品,收率可达５３％,并制备了酶的结晶,该酶以ＳｅｐｈａｄｅｘＧ１００柱层析及ＳＤＳ－ＰＡＧＥ测得分子量约为８１０００,该酶的最适ｐＨ为７．０,最适温度为４５℃,Ｚｎ２＋、Ｍｎ２＋、Ｆｅ２＋、Ｃｕ２＋、Ｃｏ２＋等重金属离子不同程度地抑制酶活性。