Ⅰ～Ⅳ型登革病毒包膜蛋白B细胞中和表位的鉴定

登革病毒包膜蛋白(Dengue virus envelope protein,DENV E)是诱导中和抗体主要的蛋白,登革病毒包膜蛋白Ⅲ区(Dengue virus envelope protein domainⅢ,DENV EDⅢ)是构建DENV亚单位疫苗的主要靶标,但是其B细胞中和表位目前了解不多。我们采用两组覆盖DENV-1EDⅢ的重叠多肽(12肽和16肽)同27株针对DENV-1EDⅢ中和单抗反应,筛选DENV EDⅢ上B细胞表位。采用该方法,我们发现了一高度保守的Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位和一高度保守的DENV-1血清型特异性B细胞中和表位,分别位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第309~320位和第381~392位(Amino acid residues 309~320,and 381~392;aa 309~320和381~392)。Ⅰ～Ⅳ型DENV共同交叉中和B细胞表位在Ⅰ～Ⅳ型DENV分离株中存在高度保守共同序列310 KEVAETQHGT319,DENV-1E蛋白中E309、V312、A313和V320不影响蛋白抗原性。DENV-1血清型特异性B细胞中和表位(DENV-1E蛋白氨aa 381~392)在DENV-1分离株中高度保守,在黄病毒属其它病毒中不保守。我们也发现一具有DENV-1分离株特异性的B细胞中和表位位于DENV-1E蛋白氨基酸残基序列第329~348位。这些新发现的DENV-1E蛋白EDⅢ上B细胞中和表位可能有助于研制新的DENV亚单位疫苗。     

登革2型病毒E蛋白结构域III的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus,DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV-1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病[1,2]。E蛋白是位于DENV表面的结构蛋白,由495个氨基酸组成,它既含有黄病毒亚群特异的和登革病毒血清型特异的抗原表位,又有与中和,血凝抑制作用有关的抗原表位,是病毒颗粒的主要包膜蛋白[3]。Modis等研究表明,DENV-2型E蛋白以延伸的二聚体形式平铺在病毒表面,折叠成3个不…     

登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备

登革病毒(Dengue virus, DENV)属于黄病毒科(Flaviviridae),黄病毒属(Flavivirus),为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型(DENV- 1,2,3,4),主要通过埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病 [1,2].     

登革病毒血清型特异单克隆抗体的制备和鉴定

登革病毒 (Dengue virus,DENV) 是全球传播最为广泛的虫媒病毒,由于缺乏快速鉴别感染病毒血清型的诊断技术,导致异型交叉感染引起重症登革出血热病例居高不下。为实现免疫学方法快速鉴别诊断不同血清型DENV感染,本研究采用哺乳动物细胞293T表达并纯化了4种DENV血清型NS1蛋白,免疫小鼠后通过杂交瘤技术制备了针对NS1蛋白的单克隆抗体。利用酶联免疫吸附方法 (Enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)、间接免疫荧光法 (Indirect immunofluorescence assay,IFA)、免疫斑点杂交试验 (Dot blotting) 以及蛋白质免疫印迹试验 (Western blotting) 确认所制备的单克隆抗体能够有效识别天然病毒NS1以及重组NS1蛋白。获得的单克隆抗体包含2株可识别1–4型DENV NS1蛋白的通用型抗体及3株分别针对DENV-1、DENV-2和DENV-4的血清型特异抗体。以所制备的DENV NS1抗体为基础,采用双抗体夹心ELISA可快速鉴别不同血清型DENV。DENV血清型特异单克隆抗体的制备和甄别DENV血清型ELISA方法的建立为快速鉴别感染DENV血清型的临床诊断奠定了基础。     

登革2型病毒E蛋白结构域Ⅲ的表达及多克隆抗体制备

登革病毒（Dengue virus,DENV）属于黄病毒科（Flaviviridae）,黄病毒属（Flavivirus）,为单股正链RNA病毒,有4个不同的血清型（DENV-1,2,3,4）,主要通过埃及伊蚊（Aedes aegypti）和白纹伊蚊（Aedes albopictus）传播,可引起登革热、登革出血热、登革休克综合征等多种疾病。     

登革病毒受体的研究进展

登革病毒(Dengue virus,DENV)是登革热(DF)、登革出血热和登革休克综合征(DHF/DSS)的病原体.根据包膜蛋白的抗原性的不同,DENV可分为4个血清型,即DENV1～4.由于血清型比较复杂,目前关于病毒受体仍未得出明确一致的结论.但近几年取得了一些引人注目的进展,比如研究发现甘露糖受体(MR)、CLEC5A等作为DENV的受体,可能在病毒进入宿主细胞过程中发挥重要作用.为此,就近几年关于DENV受体以及病毒进入细胞的机制作一综述.     

用人MHC转基因小鼠模型鉴定高致病禽流感病毒核蛋白CTL表位

目的:筛选高致病禽流感病毒核蛋白(NP)中可用于高致病禽流感病毒感染检测或疫苗设计的CTL表位,为评价疫苗接种效果和开发新型疫苗奠定基础。方法:根据NCBI公布的NP的核苷酸序列设计特异性引物,以2006年深圳株高致病禽流感H5N1病人分离的病毒cDNA为模板扩增NP全长基因(1500 bp)并测序。通过生物信息学方法,预测NP氨基酸序列中潜在的HLA-A觹0201限制性表位。构建重组pJW4303-NP核酸疫苗并肌肉免疫HLA-A2/DP4转基因小鼠,利用ELISPOT法筛选特异性CTL表位。结果:克隆了2006年深圳株高致病禽流感NP基因,构建的重组pJW4303-NP核酸疫苗能在体外COS-7细胞中表达,免疫小鼠后能引起小鼠产生特异性的体液免疫和细胞免疫。结论:生物信息学和转基因小鼠模型筛选相结合的方法,能用于高致病性禽流感核蛋白CTL表位的筛选。     

福建省白纹伊蚊中登革病毒的分离与鉴定

近年来福建省登革热(Dengue fever,DF)输入性病例持续存在,且登革热的主要传播媒介白纹伊蚊在全省内广泛分布,为了解福建省福州市登革热的媒介白纹伊蚊携带登革病毒(Dengue virus,DENV)状况,2017年10月7日在福州市台江区元一花园小区内开展伊蚊监测,采用双层叠帐法捕获255只白纹伊蚊蚊体研磨液上清提取核酸后用实时荧光RT-PCR法检测DENV特异性核酸,将检测阳性的蚊体研磨液上清接种C6/36细胞进行病毒分离,成功分离到1株DENV病毒株mosquito13/Fujian/2017;经实时荧光RT-PCR法鉴定所分离病毒株的血清型为I型;利用型特异性引物通过RT-PCR扩增病毒E基因并测序进行分子遗传特性分析;E基因核苷酸和氨基酸同源性分析显示,该毒株与2017年10月17日同小区本地登革热病例血清中分离得到的登革毒株E基因序列完全一致,与越南2014年分离株KT825033/Vietnam/2014核苷酸(99.7%)和氨基酸(99.8%)同源性最高;系统进化树分析表明所分离登革病毒毒株的基因型为I型,与东南亚地区的越南,泰国,柬埔寨等国家进化关系相近,可能输入来源于东南亚国家。本研究证实了登革热外潜伏期的存在以及白纹伊蚊在登革热疫情传播过程中的媒介作用,提示在登革热的防控工作中媒介登革病毒监测、检测的重要性,也提示福建省需要加强输入来源监测,特别是东南亚入境人员的监测。     

烟曲霉抗原Asp f16HLA-A*0201限制性的CD8+CTL抗原表位生物信息学预测与实验室鉴定

目的 预测与鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A *0201限制性CD8+细胞毒性T细胞(CTL)抗原表位.方法 以国人常见的HLA-A*0201位点为靶点,依据生物信息学软件扫描烟曲霉特异性抗原Asp f16的全部427个氨基酸序列.使用HLA-A *0201转基因小鼠制备骨髓来源的树突状细胞(DC)和CTL.流式细胞仪技术检测DC表面MHC Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c的表达来验证其是否成熟.ELISPOT试验检测烟曲霉抗原多肽特异性CTL产生的细胞因子IFN-γ.四聚体(Tetramer)试验证实烟曲霉特异性CTL与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的亲和性.结果 根据与MHC I类分子结合的半衰期评分,选择了3个HLA-A*0201限制性抗原表位.流式细胞仪分析示成熟DC高表达HLA Ⅱ类抗原,CD80,CD86和CD11c.Tetramer试验证实烟曲霉特异性T细胞受体与抗原肽,HLA-A*0201分子复合体的高亲和性.ELISPOT实验结果 表明烟曲霉抗原肽体外可以活化CD8+CTL,被负载了抗原肽的DC刺激活化后可以产生IFN-γ.结论 本研究成功鉴定烟曲霉抗原Asp f16的HLA-A*0201限制性CD8+CTL表位,可作为疫苗设计的候选表位,为进一步研发新型抗烟曲霉疫苗提供参考.     

云南省登革3型病毒全基因组序列特征研究

为阐明云南省2013年和2016年登革3型病毒(DENV-3)流行株的全基因组分子进化特征及流行病学特点。采用C6/36细胞培养法从登革热患者血清中分离病毒,用RT-PCR法扩增新分离DENV-3的全基因组序列,采用ClastalX1.83和MEGA6等生物信息学软件进行核苷酸和氨基酸同源性及系统进化分析。结果从云南省本地登革热患者血清中分离到10株DENV-3,其中西双版纳州2013年5株(简称版纳分离株),德宏州瑞丽市2016年5株(简称瑞丽分离株)。经RT-PCR和序列测定,获得这10株DENV-3的全基因组序列(10 707nt),其开放读码框(95~10 265)编码3 389个氨基酸。基于全基因组或各种结构蛋白和非结构蛋白基因的系统进化分析表明,版纳分离株均为基因II型(genotype-II),瑞丽分离株均为基因I型(genotype-I),并各自高度聚集为同一进化群并与东南亚流行株具有较近亲缘关系。版纳分离株间和瑞丽分离株间的全基因组核苷酸(氨基酸)同源性分别为99.75%~99.91%(99.40%~99.91%)和99.21%~99.68%(98.78%~99.57%),并与DENV-3原型株(H87)的核苷酸(氨基酸)同源性分别为94.21%~94.34%(97.88%~98.14%)和93.81%~93.98%(97.12%~97.67%)。与H87株比较,本次云南分离株结构蛋白和非结构蛋白分别存在26和63个氨基酸位点的改变。本研究证实,云南省西双版纳州2013年流行的DENV-3为基因II型,瑞丽市2016年流行的DENV-3为基因I型,它们的传播来源分别为老挝和缅甸北部边境地区。本次云南DENV-3分离株与H87株间存在明显差异,但决定病毒抗原性和毒力的关键位点未见明显变化。     

Ⅱ型登革病毒NS1蛋白的表达及其免疫血清的制备

目的原核表达、纯化II型登革病毒NS1A蛋白(NS1蛋白1～180氨基酸即DENV2 NS1A),将其免疫动物制备免疫血清并鉴定。方法构建重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A,转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,IPTG低温诱导表达。表达的融合蛋白经Hitrap Talon crude柱亲和层析纯化后,免疫雌性日本长耳兔获得抗DENV2 NS1A兔抗血清,用Western blot和免疫荧光检测免疫血清对重组麻疹病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6Xhis的识别和结合特性。结果重组融合质粒p ET22b-p64K-L-DENV2 NS1A经双酶切和测序证明构建正确。表达的重组融合蛋白相对分子质量为100 000,纯化后蛋白纯度在85%以上,免疫获得的抗DENV2 NS1A兔抗血清可识别重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis表达的DENV2 NS1蛋白。结论原核表达并纯化了DENV2 NS1A蛋白,建立了基于NS1蛋白的重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的Western blot和免疫荧光检测方法,为登革热疫苗研制中重组病毒MV_(S191)-DENV2 NS1 6XHis的质检奠定了基础。     

The Limitation of Rapid Tests for DENV2 Infection in Host with Unique Immune Status: Low NS1 Antigenemia and Deficient Antibody Responses

正Dear Editor,Dengue infections are caused by all four serotypes of dengue virus (DENV1–4). In recent years it has been confirmed that DENV-1 and DENV-2 are co-circulated in Guangzhou, Guangdong, China (Lai et al. 2015; Luo et al.2017). DENV-2 strains were imported from Thailand and Indonesia (Luo et al. 2017; Zhao et al. 2014, 2016), and had become the second local circulated serotype in Guangzhou.     

登革病毒感染的检测技术研究进展

登革病毒(dengue virus,DENV)是引起登革热(dengue fever,DF)的病原体,经蚊叮咬而传播疾病.DF主要流行于热带和亚热带地区.目前,DF已经发展成一个日益严重的全球性公共卫生问题.2012年,DF被列为全球最重要的蚊虫传播性疾病.快速而准确的针对DENV感染的检测技术能够有效地控制DF的爆发及减少死亡病例.目前DENV感染的检测技术主要有病毒分离培养、分子生物学诊断及血清学诊断三类,三类检测技术各有优缺点,应该根据具体情况选用适当的检测手段.     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒(HCMV)特异性细胞毒T细胞(CTL)免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白(HLA-A*2402-BSP)的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E.coli)中有效表达HLA-A*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端(N端)区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E.coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A*2402限制性HCMVpp65341-349抗原肽(QYDPVAALF,QYD)的可溶性HLA-A*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24 供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8 T细胞的0·09%～0·37%。这些结果为进一步研究HLA-A*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

Ⅲ型登革病毒在THP-1细胞上的ADE模型建立

登革热(dengue fever,DF)是由Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型登革病毒(dengue virus,DENV)引起的急性传染病,抗体依赖增强感染(antibody-dependent enhancement,ADE)是自限性的登革热以及危及生命的登革出血热(dengue hemorrhagic fever,DHF)或登革休克综合症(dengue shock syndrome,DSS)等重症的主要原因。采用不同稀释度的Ⅱ型登革病毒prM前膜抗体与分离自云南西双版纳重症病人的Ⅲ型登革病毒复合感染THP-1细胞,通过实时荧光定量PCR发现亚中和浓度prM前膜抗体诱发THP-1细胞液中更高浓度的病毒载量。在THP-1细胞系上的研究可为后续研究登革病毒ADE打下坚实的基础。     

恶性疟原虫CTL抗原微表位基因重组疫苗的构建和免疫原性预测

选用中国人群常见的MHCⅠ类分子HLA-A2.1和HLA-B51限制性恶性疟CTL抗原表位, 构建了单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh,再将上述表位DNA序列串联,构建成双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts.将3种重组疫苗分别转染C1R/HLA-A2.1和K562/HLA-B51细胞后均证实表达.单表位重组疫苗pcDNA3.1/tr和pcDNA3.1/sh的表达分别促进细胞表面HLA-A2.1和HLA-B51的稳定性.免疫共沉淀实验证实上述表位促进细胞表面HLAⅠ类分子组装,并提示特异性表位在细胞表面的递呈.双表位重组疫苗pcDNA3.1/ts在以上两个不同细胞系中的表达与两个单表位微型基因的表达结果相似,证明双表位肽的串联编码构型不影响肽链中不同表位的特异性抗原递呈.这一研究结果为进一步设计具有广泛覆盖率的多表位恶性疟重组CTL疫苗提供了理论和实验基础.与常规体外CTL实验不同,本研究观察微表位基因在表达特定MHCⅠ类分子的人细胞中进行内源性抗原递呈的过程,其方法更接近人体内环境,对于人类CTL抗原表位的确定和人重组CTL表位疫苗免疫原性的预测具有重要意义.     

新型登革疫苗研究进展

登革病毒(Dengue virus,DENV)以伊蚊为主要传播媒介,可感染人,引起登革热(Dengue fever,DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革热最常见,广泛流行于热带和亚     

登革病毒感染HepG2-严重联合免疫缺陷小鼠模型的建立

缺乏合适的动物模型将严重限制登革病毒（DENV）致病机制研究的进展。本研究旨在构建DENV感染小鼠模型,为阐明其致病机制提供实验材料。首先在严重联合免疫缺陷（ SCID）小鼠腹腔内接种人肝癌细胞株HepG2,构建人鼠嵌合体动物模型;移植后10 d腹腔接种DENV,通过检测病毒在体内分布及主要器官的组织学改变,评价该动物模型的实用价值。结果显示,在SCID小鼠成功移植HepG2并感染DENV后,出现病毒血症及主要器官严重损伤等现象,但无后肢麻痹等人类登革热无关症状。本研究成功构建了SCID-HepG2人鼠嵌合模型,该模型能支持DENV复制,并表现出部分人类DENV感染的临床症状,为研究DENV的致病机制提供了有价值的实验材料。     

新型登革疫苗研究进展

登革病毒(Dengue virus,DENV)以伊蚊为主要传播媒介,可感染人,引起登革热(Dengue fever,DF)、登革出血热(Dengue hemorrhagic fever,DHF)及登革休克综合征(Dengue shock syndrome,DSS),其中以登革热最常见,广泛流行于热带和亚     

一种前景广阔的单剂量、四价减毒登革热疫苗候选物

正登革病毒(Dengue virus,DENV)的迅速传播在全球范围内造成了巨大的健康威胁,居住在超过100个国家,约占全球40%的人口面临着登革病毒传播的风险,其中包括美国。2010年,全球共报告登革病毒感染案例3.9亿,其中0.96亿出现了感染症状。感染登革病毒会造成一系列临床症状,包括与其他疾病无明显差别的轻微发热、典型登革热或者重症登革热。重症登革热的特征是出血和/或血