红细胞的毛细管区带电泳

系统研究了毛细管区带电泳对红细胞测定的操作条件和方法特点。对人、鸡、兔和猪的红血球进行了分析,结果与经典方法无异。在半小时内可一次测定10⁵个细胞,简便、精确。保留值的变异系数小于2％。实验中发现了间歇时间现象并予解释。     

抗人重组肿瘤坏死因子(rHTNFα)单克隆抗体的研制

肿瘤坏死因子(TNF)对许多肿瘤细胞具有细胞毒和抑制生长的作用。为进一步研究TNFα的结构和功能,并为临床研究提供rHTNFα纯品。本实验应用杂交瘤技术制备了一组抗rHTNFct单克隆抗体3、H₂、B₃,B₅、E₆、Zl₂、Z₈和Z₂₀)。ELISA结果证实它们鼻rlL－1、rlL-2、rlFNγ、rlFNα₁及E．Coli菌裂解液(MM₂₉₄)无均交叉反应,仅与rHTNFα有反应。Western blot结果进一步证实这组抗体对rHTNFα的特异性。这组抗体具有不同程度中和rHTNFα细胞毒能力。用抗rHTNFα抗体制备的亲和层析柱纯化rHTNFα,可以得到在SDS-PEAG上分子量为17000道尔顿的rHTNFα纯品。     

T7启动子作用下抗人TNF-α单链抗体的表达

基因工程技术构建的抗人TNF-α单链抗体克隆入表达载体pET15b-Etag中,在T7启动子的作用下,经0.1 mmol/L IPTG诱导,在大肠杆菌BL21(DE3)中获得高效表达,其表达量占菌体总蛋白的38%.表达产物大部分以包涵体形式存在,而一小部分以有活性的可溶性形式出现于细菌的外周质中.这部分可溶性的表达产物占菌体总蛋白的6%,经双抗体夹心法和斑点印迹分析表明它具有抗原结合活性.     

人源天然抗TNF-α ScFv抗体的筛选及性质分析

目的以人肿瘤坏死因子(human tumour necrosis factor-α,human TNF-α)为靶抗原,从构建好的人源天然单链抗体(single-chain antibody fragment,ScFv)噬菌体抗体库中筛选对应的ScFv抗体,验证其中和活性后测定动力学常数(kinetic dissociation,KD)。方法以TNF-α梯度稀释后包被免疫管,对人源天然ScFv噬菌体抗体库进行3轮吸附-洗脱-扩增的富集筛选,制备TNF-α单克隆噬菌体抗体颗粒,经ELISA试验筛选阳性克隆后测序并分析;将正确的阳性抗体序列亚克隆到pET-26b表达载体上,原核表达后用Ni Sepharose 6 Fast Flow介质进行纯化;用MTT比色法对筛选的ScFv进行中和活性验证,并测定其中和抗体的KD。结果通过3轮筛选共得到18个正确的抗体氨基酸序列,对其原核表达及纯化后得到的6株可溶性表达的抗TNF-αScFv进行中和活性验证,并对其中有中和活性的4株ScFv抗体测定KD。结论从人源天然ScFv噬菌体抗体库中成功地筛选出4株抗人TNF-α的ScFv中和抗体,其中1株ScFv抗体的KD为4.80×10~(-8),细胞毒中和率达到48.9%,达到了药用级抗人TNF-α中和抗体的研发要求,为全分子抗体药物的构建及稳定细胞株的筛选奠定了一定的基础。     

从混合的噬菌体抗体库中直接筛选高亲和性的抗肿瘤坏死因子-α人源单克隆抗体

采用噬菌体抗体库技术,从未经免疫的混合人噬菌体抗体库直接筛选抗ＴＮＦα的人源单克隆抗体,３种不同的检测手段表明,经过５轮的筛选,能够与ＴＮＦα结合的噬菌体抗体得到了有效的富集。对所获得的噬菌体抗体克隆进行的初步鉴定表明,７个噬菌体抗体克隆能有效地与人重组ＴＮＦα结合,并且这种结合具有特异性,由这７个噬菌体抗体克隆制备的抗体Ｆａｂ片段也能有效地与ＴＮＦα结合。由此,我们通过噬菌体抗体技术直接获得了ＴＮＦα的人源单克隆抗体,这为进一步制备具有临床应用前景的人源抗ＴＮＦα单克隆抗体打下了基础。     

重组人TNF-α在大肠杆菌表达、纯化及生物学活性鉴定

[目的]获得人TNF-α蛋白,并鉴定其生物学活性。[方法]通过对人源TNF-α序列进行密码子优化构建了p Cold-TNFα原核表达载体,完成了TNF-α重组蛋白的表达,建立了两步分离纯化方案,并利用Western Blot和细胞刺激实验检测了重组人TNF-α蛋白抗原性和生物学活性。[结果]利用大肠杆菌成功表达重组人TNF-α蛋白,经酶切纯化后的人TNF-α蛋白不含标签序列,纯度达95%,收率约70%,并具有良好的生物学活性。[结论]获得具有生物学活性的人TNF-α蛋白,为进一步的中和抗体研究奠定了基础。     

通过构建轻链二级库对人源抗TNF-α抗体进行亲和力成熟

通过构建轻链二级库的方法,对人源抗ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ进行轻链置换,并筛选出具有更高亲和力的人源抗ＴＮＦ－α单抗的Ｆａｂ。首先用ＲＴ－ＰＣＲ技术扩增正常人全套抗体轻链基因,并与已获得的人源抗ＴＮＦ－α单抗的重链基因配对,构建人源抗ＴＮＦ－α噬菌体抗体轻链二级库,然后筛选与ＴＮＦ－α具有更高亲和力的克隆,经过三轮的生物淘筛（ｂｉｏｐａｎｎｉｎｇ）,获得了比原来的人源抗ＴＮＦ－α单抗Ｆａｂ具有更高亲和     

天花粉蛋白胰酶肽图谱的毛细管区带电泳法分析

目的:以天花粉蛋白胰蛋白酶解肽段为测定对象,用毛细管区带电泳法(CZE)研究天花粉蛋白的肽图谱分离条件。方法:采用未涂层石英毛细管(长50cm,内径75μm,有效长度42cm),以50mmol/L磷酸盐和150mmol/L三氟乙酸溶液为运行缓冲液,在25℃、pH2.0和压力为3447.4Pa(×10s)的条件下进样,以12kV恒压电泳分离,检测波长214nm。结果:运用CZE也能较好地对天花粉蛋白进行肽图谱分离,在缓冲体系中加入离子对试剂三氟乙酸,可极大地改善多肽的峰形和分辨率;同时运用反相高效液相色谱(RP-HPLC)技术,也很好地鉴定了部分肽段在CZE和RP-HPLC肽图谱中的对应关系。结论:与传统的RP-HPLC分析天然或重组蛋白肽图谱相比,CZE也不失为一种鉴定蛋白肽图谱的有效、快速和简单的方法。     

靶向于TNF-α和RANKL的人源化抗体对DBA/1小鼠单关节炎的保护作用

目的制备同时拮抗肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factorα,TNF-α)和核因子κB受体活化因子配体(re-ceptor activator of NF-κB ligand,RANKL)的人源化单克隆抗体(h8G12),通过单关节炎小鼠模型,评估h8G12在抑制TNF-α引起的炎症反应和拮抗RANKL引起的骨破坏中的保护作用。方法培养稳定表达h8G12的CHO细胞株,观察细胞生长状态,用间接ELISA检测细胞培养上清中h8G12的表达水平。纯化的h8G12经SDS-PAGE、West-ern blot分析及鉴定,用间接ELISA观察其亲和力。通过向DBA/1小鼠膝关节腔注射人TNF-α重组蛋白和人RANKL重组蛋白,建立单关节炎小鼠模型。用组织学评估观察不同给药方案[阴性对照组、阳性对照组、阿达木单抗(adalimumab,ADA)组和h8G12组]对小鼠单关节炎引起的炎症浸润、软骨侵蚀、膝关节腔内破骨细胞分化的保护作用。结果 CHO细胞株培养96 h时细胞生长状态良好,可稳定分泌h8G12;纯化的h8G12纯度可达90%,Western blot可见特异性条带,且可与rh TNF-α和rh RANKL结合。在单关节炎小鼠模型中,苏木精-伊红染色显示,h8G12组关节腔、周围软组织及骨髓腔内炎性细胞浸润明显少于阳性对照组,炎症评分降低了50%,治疗效果与ADA相似。甲苯胺蓝染色显示,h8G12组病理评分出现显著下降,h8G12治疗后小鼠关节结构相对完好,关节软骨厚度接近正常水平。抗酒石酸酸性磷酸酶染色显示,h8G12组关节腔内破骨细胞明显减少。结论 h8G12可有效抑制TNF-α引起的炎症反应和拮抗RANKL引起的骨破坏,为类风湿关节炎的治疗提供了新方法。     

人源抗TNF—α抗体Fab基因的单链化及其表达和纯化

构建人源抗TNF－α单链抗体基因,并尝试其在E.coli中的表达和纯化,采用人工接头,按VH－linkerVL的结构将人源抗TNF－a的VH,VL基因拼接成单链抗体（ScFv)基因,并将构建好的ScFv基因插入表达载体pQE30,转染E.coli M15,以IPTG诱导表达,Ni-NTA树脂纯化表达产物,构建的ScFv基因长723bp, 列分析表明,该序列拼接正确,SDS－PAGE显示,用重组的pQE30转化的M15菌经诱导后,有相对分子质量（M）约为52000的外源蛋白表达,Ni-NTA树脂纯化的表达产物纯度大于90％,因此,成功地构建了人源抗TNFa的ScFv基因,并在E.coli DH5a中表达和纯化的该基因的产物。     

基于HUVEC细胞表面ELAM-1表达的抗TNF-α抗体活性检测方法北大核心CSCD

旨在建立抗TNF-α单克隆抗体生物学活性测定的方法。肿瘤坏死因子TNF-α能刺激人脐静脉内皮细胞HUVEC表达黏附分子ELAM-1,通过抗TNF-α抗体中和TNF-α来抑制这种表达,从而建立该抗体的生物学活性检测方法,并进行验证。结果表明,建立抗体活性检测方法,验证方法的特异性较好、回收率为92.1%-102.1%,方法重复12次,RSD为7.66%。在50%-150%的线性良好,相关系数为0.99。该活性检测方法适于抗体体外活性的检测。     

用一种新型的PCR方法快速制备人TNF-α缺失突变体

人肿瘤坏死因子 α(hTNF α)的 2个Loop区 2 9～ 36、141～ 146是受体的主要结合部位 .应用一种新型的PCR方法 ,快速制备了这 2个Loop区的缺失突变体 ,并对其活性进行了研究 .结果表明 :这种新型的PCR方法在制备缺失突变体中具有快速、简便、经济等优点 ,值得推广 ;缺失蛋白对L92 9细胞的毒性作用明显降低 ,表明这 2个区域为hTNF α发挥其生物作用所必需     

血清TNF-α与糖尿病微血管病变的关系

目的:研究肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-alpha;TNF-α)与糖尿病微血管病变的关系.方法:将67例糖尿病患者,通过是否合并微血管痛变,分成无微血管病变组(DMI组)32例,合并微血管病变组(DM2组)35例,设正常时照组25例对比,用放射免疫法测得血清TNF-α,三组间进行比较.测受检者总胆固醇、甘油三酯、空腹血糖、糖化血红蛋白等指标,三组间比较.结果:2型糖尿病患者肿瘤坏死因子-α水平显著高于正常对照组(P＜0.01),糖尿病合并微血管病变组较糖尿病无微血管病变组其表达也明显升高(P＜0.01).结论:TNF-α表达的上调可能与糖尿病微血管病变的发生、发展关系密切     

抗重组人肿瘤坏死因子单克隆抗体对内毒素血症家兔氧提取功能的影响

本工作采用渐进性低氧法降低总氧运输量,从而观察抗重组人肿瘤坏死因子（rhTNFα）单克隆抗体对内毒素血症家兔氧提取功能的影响。结果表明,在DO2－VO2的关系中,抗体保护组类同于对照组,可清楚地分为"非依赖"与"依赖"两部分;无关抗体组类同于内毒素组,从呼吸空气开始从未出现坪区。抗体保护组的临界氧运输量（DO2c）和合并氧提取率分别为10．80±3．21ml／（min·kg）和0．690,与对照组（分别为10．18±1．69和0．730）无显著差异（P＞0．05）;无关抗体组合并氧提取率为0．408,显著低于抗体保护组（P＜0.05）。在血浆中TNFα浓度,无关抗体组在各时间点上均显著高于抗体保护组（P＜0.01）。实验结果表明,精确特异性的重组人TNFα单抗具有阻断或逆转内毒素血症氧提取障碍的病理过程。     

人源抗狂犬病病毒单克隆抗体的构建及验证

目的利用人源抗狂犬病病毒ScFv噬菌体抗体库,构建单克隆抗体(单抗)轻、重链质粒,瞬时表达,纯化后验证具有高中和活性的单抗。方法以从ScFv噬菌体抗体库中筛选获得特异性抗体为模板,PCR扩增抗体轻、重链可变区序列,构建人源全分子抗体瞬时转染质粒;轻、重链质粒混合后转染HEK293 EBNA1细胞,瞬时表达全分子抗体。采用Mabselect SuRe介质手动亲和纯化抗体,Nano Vue超微量分光光度计测定蛋白质的质量浓度,快速荧光灶抑制试验(rapid fluorescent focus inhibition test, RFFIT)进行体外中和效价验证。结果成功构建22个轻链质粒,15个重链质粒。通过真核细胞瞬时表达后,经手动亲和纯化后,获得22株单抗。除1株抗体外,其余21株抗体的蛋白质量浓度均>300μg/mL;部分抗体纯度均在90%以上。中和活性结果显示,5株在1 500~1 800 IU/mg之间;8株在800~1 500 IU/mg之间;7株在500~800 IU/mg之间;其余2株在500 IU/mg以下。结论成功构建并验证获得20株中和活性>500 IU/mg的人源抗狂犬病病毒单抗,为单抗混合制剂的研究奠定了基础。     

重组人肿瘤坏死因子α(hTNFα)衍生物发酵条件的研究

本文对一种新型重组人肿瘤坏死因子衍生物（命名为ｈＴＮＦＤ）的发酵条件进行了初步研究。通过实验优化选择了适宜该衍生物表达的培养基、ＩＰＴＧ使用浓度、诱导时期以及诱导时间的长短等,并在５０Ｌ发酵罐进行了中试规模的放大培养,菌体的收获量湿重可达１６４３ｇ／Ｌ,ｈＴＮＦＤ表达量占总蛋白的６０％,纯化的衍生物比活为１０１×１０１０Ｕ／ｍｇ,比原型ｈＴＮＦα提高了４６５倍,具有潜在的临床应用价值。     

人源性抗TNFα小分子抗体的改构和分析

在获得人源性抗人TNF α单链抗体 (ScFv)基因序列的基础上 ,对ScFv的连接肽部分进行基因改造 ,并构建了Fab抗体基因。改构前后的ScFv分别重组入表达载体pBV2 2 0 ,经 42℃热诱导 ,在E .coliDH5α中表达了ScFv蛋白 ,得到分子量约为 30kD的重组蛋白质 ,改构前后ScFv的表达量分别占菌体总蛋白质的 6 .5 %和13 .8%。同时构建Fab可溶性表达载体并转化非抑制型菌株HB2 15 1,经IPTG诱导 ,在约 5 0kD分子量处呈现一条新生蛋白质条带。从大肠杆菌裂解液中对ScFv进行了复性和层析纯化 ,对Fab基因的表达产物进行了亲和层析纯化 ,并证实 :(1)改构后ScFv在大肠杆菌中的表达量有所提高 ;(2 )改构前后的ScFv与Fab均具有与hTNF α相结合的活性 ,具有GGGGS连接肽的ScFv与hTNF α的亲和常数为 6 .70× 10 4 (mol/L) -1,而改构后具有(GGGGS) 3 连接肽的ScFv的亲和常数提高为 7.2 7× 10 5(mol/L) -1,Fab与hTNF α的亲和常数为 7.6 1× 10 5(mol/L) -1,Fab与改构后ScFv的亲和力无明显差异 ;(3)ScFv与Fab均有中和hTNF α细胞毒的作用 ,具有(GGGGS) 3 连接肽的ScFv与Fab的中和活性基本相同 ,但均明显低于一株鼠源性单抗     

表达全人源抗人IgE单抗的细胞株构建及筛选

目的:构建及筛选高效表达原创性全人源抗人Ig E单克隆抗体的重组工程细胞株。方法:将采用核糖体展示技术筛选到的原创性全人源抗人Ig E单链抗体(sc Fv)基因改构设计为Ig G1κ型全长抗体,构建重组真核表达质粒并电转染CHO-S细胞,Dot-blot法选取多株高表达克隆进行40ml摇瓶批次培养,再据细胞生长特征及抗体表达量选取高表达克隆进行40ml摇瓶及3L摇瓶流加培养研究,选取候选细胞株并对改构前后抗体的生物学活性进行比较研究。结果:成功构建了p MH3-H、p MH3-L、p CApuro-H、p CApuro-L四种重组真核表达质粒并成功共转染CHO-S细胞。完成了4次电转染8轮细胞克隆筛选,获得两株表达量较高的候选克隆Mab1#和Mab2#,在3L摇瓶流加培养中抗体表达量分别达到470mg/L及499mg/L。生物膜光干涉技术(Bio-Layer Interferometry,BLI)亲和力结果显示Mab1#及Mab2#两株单抗亲和力均达到nmol/L级(10-9),与现有唯一上市的抗人Ig E单抗药物奥马珠单抗(Omalizumab)的亲和力相当。选取Mab1#全长抗体与其改构前的母本单链抗体的表面等离子共振技术(surface plasmon resonance,SPR)中和活性比较结果显示Mab1#抑制h Ig E与FcεRI结合的EC50为3nmol/L,EC90为9nmol/L,较改造前亲和力提高了4.3倍,中和活性(EC50)提高了23.7倍,中和活性(EC90)提高了41.3倍。结论:成功将表达原创性全人源抗人Ig E的单链抗体(约25k Da)改造为亲和力及中和活性均大幅提升的全长抗体(约150k Da),获得2个候选细胞株。     

基于毛细管电泳的快速检测七种人冠状病毒技术方法的建立

近来,一种新型冠状病毒(SARS-CoV-2)引发的COVID-19突发疫情,给全球公众健康和社会经济构成严重威胁。SARS-CoV-2成为继人冠状病毒229E(Human coronavirus 229E,HCoV-229E)、人冠状病毒OC43(Human coronavirus OC43,HCoV-OC43)、严重急性呼吸综合征冠状病毒(Severe acute respiratory syndrome coronavirus,SARS-CoV)、人冠状病毒NL63(Human coronavirus NL63,HCoV-NL63)、人冠状病毒HKU1(Human coronavirus HKU1,HCoV-HKU1)和中东呼吸综合征冠状病毒(Middle East respiratory syndrome coronavirus,MERS-CoV)后第七种感染人类的冠状病毒。本研究以高分辨毛细管电泳技术为基础,针对七种人冠状病毒基因保守区分别设计特异性引物对,经常规PCR扩增后,通过具备单碱基差异分辨率的毛细管电泳分析,实现快速检测七种人冠状病毒的目标。通过构建基于毛细管电泳的人冠状病毒分子靶标,实现同时快速精准鉴定七种人冠状病毒的目的。本研究建立的人冠状病毒毛细管电泳快速检测技术方法具有极高灵敏性和精确性,分辨率高而且特异性好,操作简便成本低廉,为人冠状病毒的临床诊断、口岸快速检测等提供了新的技术支持。     

借助计算机模建与缺失突变技术确定抗人TNF-α单抗Z12识别的抗原表位

钓取抗人肿瘤坏死因子-α(hTNF-α)抗体Z12重、轻链可变区(VH, VL)基因, 根据其氨基酸序列, 运用同源模建方法分别模拟VH和VL结构域的空间构象, 并搭建Fv片段的整体三维结构, 利用分子对接方法建立Fv/hTNF-α作用的复合物模型, 据此模型推测Z12抗体识别的表位为hTNF-α141~146位. 将hTNF-α分为N端1~91和C端92~157两段进行原核表达, 检测结果表明Z12抗体识别的抗原表位位于hTNF-α C端92~157区, 初步证实预测结果可靠. 进一步的实验研究表明, 当把hTNF-α141~146位氨基酸缺失后, Z12抗体识别该缺失体的能力几乎丧失, 提示此抗体特异性识别抗原分子141~146位氨基酸残基.