小鼠(BALB/c）未分化型免疫球蛋白重链可变区(VH）基因的克隆

我们曾报道了由小鼠胎儿基因文库中克隆 未分化型免疫球蛋白重链恒定区CE基因的 研究结果〔3,。与此同时我们还从小鼠基因文库 中克隆出未分化型免疫球蛋白重链可变区VH 基因。并对其进行了初步的研究。免疫球蛋白 的重链和轻链可变区的空间叠折形成了抗原－ 抗体结合位点,这对于结合特异抗原具有重要 作用[1,27。因此克隆与研究免疫球蛋白可变区基 因对于认识抗体的特异性、多样性都有一定的 意义汇‘,‘,。     

抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体可变区基因的5＇RACE扩增及序列分析

目的：克隆并分析抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链和重链的可变区基因。方法：从分泌抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的杂交瘤细胞株中提取总RNA,根据小鼠IgG恒定区序列设计特异性引物,通过5’RACE法扩增其轻链和重链的可变区基因,克隆入pMD18-T载体,测序并分析其可变区序列。结果：3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体的重链可变区基因序列全长均为423bp,编码141个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长均为393bp,编码131个氨基酸残基;在GenBank中对氨基酸序列进行比对分析,均符合小鼠IgG可变区基因的特征;根据Kabat法则对3株抗体轻链和重链可变区氨基酸序列进行分析,确定了3个抗原互补决定区、4个框架区和前导肽。结论：通过5＇RACE法得到了3株抗人前列腺干细胞抗原单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构、人源化改造奠定了基础。     

β淀粉样肽单克隆抗体可变区基因的5′RACE扩增及序列分析

目的:克隆并分析抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因。方法:从分泌抗β淀粉样肽单克隆抗体的杂交瘤细胞株A8中提取总RNA,根据恒定区序列设计基因特异性引物,通过5′RACE法扩增抗体的轻链和重链可变区基因,测定并分析可变区基因序列,并克隆入pMD18-T载体。结果:重链可变区基因序列全长450bp,编码150个氨基酸残基;轻链可变区基因序列全长429bp,编码143个氨基酸残基。在GeneBank中对氨基酸序列进行比对分析,二者均符合小鼠IgG可变区基因的特征。根据Kabat法则对A8抗体轻链和重链可变区氨基酸序列基因进行分析并确定了3个抗原互补决定区(CDR)、4个框架区(FR)和信号肽。结论:通过5′RACE法得到了抗β淀粉样肽单克隆抗体轻链与重链可变区基因,为进一步研究抗体三维结构,以及对该抗体进行人源化改造奠定了基础。     

人癌胚抗原单链抗体基因的构建和筛选

从分泌抗癌胚抗原(carcinoembryoni antigen, CEA)单抗的杂交瘤细胞株C50中提取总RNA, 逆转录成cDNA, PCR扩增分别得到抗体轻、重链可变区基因, 再利用两对PCR引物合成和扩增得到全单链抗体基因. 将含轻、重链可变区序列的DNA片段克隆于含噬菌体基因Ⅲ的噬菌粒pCANTAB5. 重组克隆在噬菌体表面表达基因Ⅲ与单链抗体的融合蛋白. 表达具抗原结合活性的单链抗体的重组噬菌体可以通过亲和筛选的方法筛选得到并富集. 利用该方法我们可以从许多分泌不同抗体的杂交瘤细胞RNA中快速克隆和筛选功能性抗体可变区基因.     

抗HFRSV人单抗可变区基因克隆及其序列测定

从杂交瘤细胞株87—2提取细胞总RNA．反转录合成cDNA链,进行PCR反应。其中扩增重链可变区一对引物分别与人免疫球蛋白重链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补;扩增人λ轻链可变区引物与人免疫球蛋白λ轻链v区基因5＇端和J区基因3＇端互补。将重、轻链可变区基因的PCR扩增产物分别插入M13噬菌体．经转化筛选分别获得重组克隆。双脱氧法测定其序列,所得核苷酸序列经计算机分析,轻、重链可变区基因长度分别为309bp和405pb,编码103个氨基酸和135个氨基酸,有明显抗体可变区特征,具有骨架区和抗原互补区。     

甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体轻链和重链可变区基因的巢式PCR扩增及序列分析

目的：采用巢式PCR对甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链基因进行扩增,对获得的基因进行序列分析,并找出克隆鼠Igκ轻链和重链可变区基因的通用方法。方法：设计22对扩增鼠Igκ轻链可变区和重链可变区基因的引物,对6株鼠抗人甲型H1N1流感病毒血凝素单克隆抗体的轻链和重链可变区基因进行克隆并测序,与NCBI公布的鼠免疫球蛋白序列比对分析。结果：巢式PCR方法可以有效避免单克隆抗体克隆过程的假基因,并且得到的单克隆抗体的氨基酸序列均符合鼠免疫球蛋白可变区特征。结论：建立了克隆鼠免疫球蛋白轻链和重链可变区基因的通用方法,为后期克隆鼠源性单克隆抗体的可变区基因提供了基础,并为研究甲型H1N1流感病毒血凝素与抗体的结合位点提供了实验数据。     

血清学检测H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆的分析

目的 为分析H-Y噬菌体Fab抗体特异性,筛选用于抗体亲和力提高的H-Y噬菌体Fab抗体阳性克隆.方法 以从噬菌体Fab抗体库中筛选到具有雄性特异性结合活性的阳性克隆A6、A8、E6为基础,通过C57BL/6鼠脾细胞为抗原的ELISA分析3株阳性克隆的特异性,镜下观察亲和力较好的A8阳性克隆ELISA结果,利用生物信息学方法预测分析该克隆的抗体基因可变区序列和结构.结果 ELISA分析显示3株阳性克隆具有雄性特异性,其中A8阳性克隆具备较好的雄性特异性.A8克隆具有免疫球蛋白轻链和重链可变区结构,其重链、轻链可变区分别属于VHI和VκIV基因家族.结论 A8阳性克隆可用于后续的导向筛选和抗体基因改造等研究工作.     

人源抗肿瘤坏死因子—α噬菌体抗体的基因结构分析

从混合的噬菌体抗体库中筛选到了抗人ＴＮＦα的人源单克隆抗体,并对筛选到的抗体基因进行了序列测定和分析。结果表明,筛选到的４个特异性抗ＴＮＦα噬菌体抗体克隆的重链的重链基因序列相同,该重链基因长６８１ｂｐ,编码２２７个氨基酸残基,属于人免疫球蛋白第Ⅲ家族,其中１－１１９位氨基酸残基为重链可变区（ＶＨ）,１２０－２２７位为重链恒定区１（ＣＨ１）。４个噬菌体抗体克隆的轻链均缺失,因此实际上筛选到的是单重     

抗人CD3单抗重,轻链可变区基因的体外扩增,克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５＇端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个     

抗HEV嵌合抗体的构建及在CHO细胞中的表达

通过RT-PCR方法从分泌戊型肝炎(戊肝)病毒中和性鼠源单克隆抗体(单抗)8C11的杂交瘤细胞中克隆出抗体基因的重链可变区(VH)、轻链可变区(VK)序列,并分别克隆到含有人gamma 1重链和kappa轻链恒定区序列的pcDNA3.1/Hygro和pcDNA3.1( )质粒中,共转染中华仓鼠卵巢癌细胞(CHO)细胞.RT-PCR结果表明,转染的CHO细胞转录了嵌合重链及轻链基因,间接ELISA及Western blot结果表明:翻译出的两种多肽在细胞内正确组装成嵌合抗体分子,并可分泌至细胞外,表达的嵌合抗体保留了原鼠单抗的抗原结合特异性及对8H3结合抗原的增强作用.8C11嵌合抗体的成功表达可降低鼠源性,为探讨戊肝抗体治疗的可能性奠定了基础.     

基因库构建

924350由可变基因文库产生抗体的细胞筛选法:存储库的收集[英〕/Hawkins,R.E.…/Eur.J.Im-munol一1992,22(3)一567~570〔译自DBA,1992,11(11),92一06028」 用(4一羚基一3一硝基苯酚)乙酸(NP)一家禽势球蛋白免疫小鼠,初次免疫后7天收集脾细胞。由用抗原包被磁性珠粒筛选的细胞DNA制备重链可变(VH)基因文库,再由未筛选细胞的DNA或mRNA制备基因文库。VH基因文库与V一入一1基因结合,该基因以Fv片段形式在大肠杆菌中表达,并通过结合(4一经基一3一碘一5一硝基苯酚)乙酸一家畜血清清蛋白而进行筛选。抗原结合克隆的频率,筛选细胞DNA或…     

抗人CD3单抗重、轻链可变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

根据免疫球蛋白重链和轻链可变区基因５’端序列和Ｊ区序列,化学合成适合于体外扩增抗体重、轻链可变区基因的二对引物。从体外培养的ＯＫＴ３杂交瘤细胞中提取总ＲＮＡ,反转录生成ｃＤＮＡ,以ｃＤＮＡ为模板,分别加入合成的重、轻链可变区引物进行ＰＣＲ,扩增出抗体重、轻链可变区基因片段。将扩增产物分别插入ｐＵＣ１９质粒,筛选出阳性克隆,用链终止法进行ＤＮＡ序列测定。所测重链可变区基因全长３５７ｂｐ,编码１１９个氨基酸,轻链可变区基因全长３２１ｂｐ,编码１０７个氨基酸。     

抗人大肠癌重组单链抗体的研制

应用重组噬菌体抗体系统制备了重组单链抗体。首先从抗人结肠癌ND-1单抗杂交瘤细胞中提取mRNA,利用反转录多聚酶链反应(RT-PCR)扩增出单抗重链可变区(V_H)及轻链可变区(V_L)片段,再通过连接DNA合成单链抗体可变区片段(ScFv),然后经双酶切后克隆到pCANTAB5E载体中,在E.coliTGI细胞中表达出噬菌体融合蛋白,用抗原阳性噬菌体感染E.coliHB2151细胞,产生单链抗体,该单链抗体既保持了原单抗的特异性,应用上又优于原单抗。     

抗人血管内皮生长因子单链抗体基因的构建、表达及活性鉴定

鼠单克隆抗体E11能与人血管内皮生长因子(VEGF)特异结合,已用于临床检测恶性肿瘤细胞VEGF的表达,并初步证明其体内抑瘤活性。为便于大规模生产,特进行基因工程改造,构建小分子的单链抗体(scFv)。首先通过逆转录及多聚酶链式反应(PCR),分离并克隆E11的可变区基因。经测序表明,E11轻链可变区(VL)基因全长333bp,编码111个氨基酸,归属小鼠轻链可变区基因第Ⅲ亚组。重链可变区VH基因全长369bp,编码123个氨基酸,归属小鼠重链可变区基因Ⅱ(A)亚组。然后用一编码亲水性多肽接头的DNA片断将E11单抗轻、重链可变区基因连接,构建表达质粒pET-15YV,在大肠杆菌BL21(DE3)中进行表达。表达产物(包含体)经变性及复性后,用免疫组化法检测该单链抗体结合抗原(颊癌)能力。对颊癌组织检测的结果表明,基因工程抗体scFv与亲代抗体一样,具有较高的组织特异性。本研究获得的抗人VEGF单链抗体具有潜在的临床价值,为肿瘤放射免疫显像及以血管为靶标的抗血管生成治疗奠定了基础。     

人免疫球蛋白重链可变区基因引物设计方法的改良

针对抗体胚系基因数据库的数据不断更新和完善,为获得人全部免疫球蛋白(Ig)重链可变区基因,改进引物设计方法,自主设计针对可变区基因高度保守的框架区1(FR1)和框架区4(FR4)的引物,提取未经免疫的健康人外周血单个核细胞,通过RT-PCR扩增重链可变区基因.其DNA序列与GenBank数据库和IMGT/V-QUEST软件比对,序列分析符合人免疫球蛋白重链基本框架结构,为胚系基因重排产生的序列.多个克隆的测序结果对比分析显示了良好的多样性.获得的重链序列为研制基因工程抗体及构建噬菌体抗体库奠定了物质基础,也为扩增其他物种Ig可变区基因的引物提供新的设计思路.     

抗人小细胞肺癌单克隆抗体的重链变区基因的体外扩增、克隆和序列分析

本文从抗人小细胞肺癌单克隆抗体杂交瘤细胞中抽提总RNA,合成第一链cDNA,直接用PCR技术(polymerase chain reaction)扩增出351bp的重链变区基因(V_H),克隆至pUCV_(NP)-PCR载体上,经筛选得一批插入片段为351bp的阳性克隆,经核苷酸序列分析研究,证实已获得了该单克隆抗体的重链可变区基因。     

抗胃癌单抗3H11可变区氨基端序列对抗体活性的影响

采用RT-PCR方法,利用第一骨架区通用引物扩增重链Fd段和κ链的基因,克隆到Fab表达载体中,在大肠杆菌中获得了表达但未检测到抗原结合活性.根据已克隆的3H11 VL、VH的真实序列,重新设计κ链及Fd段5′端引物,分别将骨架区引物在κ链及Fd段5′端所造成的氨基酸残基改变纠正为原始序列,构建分别含有矫正后κ链或矫正后Fd以及二个链均得到矫正的Fab表达载体,这些载体在大肠杆菌中均获得类似水平的表达,对任何一个链的矫正均可部分恢复Fab段胃癌细胞的结合活性.结果说明在构建小分子抗体时,PCR引物引入的轻、重链可变区氨基端氨基酸残基的改变可严重影响所表达抗体的抗原结合活性.     

鼠源抗B型肉毒毒素单链抗体噬菌体文库的构建筛选及抗体免疫学活性的初步研究

B型肉毒毒素重链C-端片段(BoNTB/Hc)经金属螯和层析法纯化后免疫Balb/c小鼠,从其脾淋巴细胞中提取总RNA,反转录成cDNA,用抗体可变区混合引物进行全套抗体重、轻链可变区基因的扩增,体外随机装配成单链抗体(scFv)。将其克隆至pCANTAB5E中,构建单链抗体噬菌体抗体库。结果表明经过4轮"吸附-洗脱-扩增"的富集过程,筛选获得高亲和力的克隆。序列测定符合抗体可变区结构特点。     

抗破伤风类毒素单抗可变区基因的克隆及在大肠杆菌中表达的三种工程抗体

我们采用RT-PCR,从小鼠杂交瘤细胞中扩增并克隆了抗破伤风类毒素(TT)抗体轻、重链可变区,重链Fd区基因,测定了其VH、Vk序列。并在大肠杆菌中表达了Fd片段,ELISA分析的结果表明Fd片段具有抗原结合的能力,但特异性很差。进一步采用SOE,和PCR技术,将VH、VK基因与ScFv连接片段组装成单链抗体(ScFv)基因片段,以及将人重链CH1和Fab基因连接片段组装成Fab基因片段。将它们分别插入含噬菌体fd外壳蛋白3基因的phagem-id pHEN 1中,在辅助噬菌体M 13-VCS作用下,噬菌体表面表达了抗TT的噬菌体单链抗体(phage-ScFv)与噬菌体Fab(phage-Fab),经ELISA检测,表明它们都能与TT特异结合。     

从小鼠胎儿基因文库中筛选分离免疫球蛋白重链C_ε基因

本文阐述了以缺口翻译制备的pIge DNA为探针(4.4×10~6cpm/μg DNA),用吸印法从小鼠胎儿基因文库中筛选分离出免疫球蛋白重链C_ε基因克隆。同时,从扩大培养的噬菌体中提取出DNA,并用EcoRI酶消化,0.7％琼脂糖凝胶平板电泳分离,分离的DNA片段转移至硝酸纤维素滤膜上,以pIgs DNA探针杂交,进而确证有两条阳性带,为免疫球蛋白重链C_s基因。电泳法测定其大小分别约为3.5 kb和3.0 kb。也显示出在小鼠胎儿中的未分化型免疫球蛋白重链C_g基因内有一个限制性内切酶Eco RI位点。