水稻内生成团泛菌YS19与菠萝泛菌YJ76共培养提高环境胁迫生存适应性

成团泛菌(Pantoea agglomerans)YS19和菠萝泛菌(Pantoea ananatis)YJ76是从水稻(Oryza sativa)“越富”品种中分离得到的2株优势内生固氮细菌。利用YS19和YJ76共培养方式模拟菌体栖息微环境,探索潜在的种间生物效应,发现适量的YJ76能够促进YS19共质体的形成并且YJ76细胞可以参与到YS19的共质体结构中,YS19?YJ76接种量比例为10?3时促进效果最为显著。相比之下,当使用吲哚产量显著下降的YJ76突变株Δzwf与YS19共培养时,上述促进效应均显著减弱。与单独培养相比,共培养显著提高了两个菌株对重金属Zn²⁺、四环素、紫外线以及干燥的耐受能力,YS19分别提高了63.9%、56.0%、57.4%、72.0%,YJ76分别提高了147.9%、172.7%、266.3%、348.6%。结果表明水稻的两种主要内生菌YS19和YJ76在共栖息时表现为强烈的协同作用,而YJ76产生的吲哚信号分子在这个过程中起到重要调节作用。     

内生菌与植物的相互作用：促生与生物薄膜的形成

植物内生菌由于其独特的生态学地位而广受关注,近年来有关植物内生菌与宿主相互作用的研究取得了很大进展.本文综述了植物内生菌通过分泌促生物质、拮抗病原菌等实现与宿主共生互作,同时植物为内生菌提供适宜的黏附表面,使其形成以生物薄膜(biofilm)为主要形式的多细胞聚集体结构以更好地适应周围的生存环境,从而更加高效地对植物产生促生作用.本文论述了内生菌在与植物的互作中形成的多细胞聚集结构在抵抗非生物胁迫方面的独特生理及生态学意义,结合水稻内生成团泛菌YS19形成多细胞聚集体symplasmata现象及其生物学效应,对未来有关植物内生菌的研究方向提出了一些看法.     

水稻内生优势成团泛菌GFP标记菌株的性质与标记丢失动力学

为研究内生细菌对宿主植物侵染定殖的机理和其共生生物学作用 ,对水稻内生优势成团泛菌 (Pantoeaagglomerans)YS19与绿色荧光蛋白 (GFP)标记的YS19B ::gfp菌株的生长动力学进行了比较研究 ,探讨了成团泛菌YS19B ::gfp的标记稳定性和荧光性质 .标记菌株与野生型菌株相比 ,最大比生长速率和最大生物量仅减小 12 4 %和 6 % ,代时延长 14 0 % .成团泛菌YS19B ::gfp在指数期连续传代培养 10 0代后 ,GFP标记的保持率为 89 1% ,建立了标记菌株在有标记丢失存在时的生长动力学模型 :dX+ dt =μ+ (1-p)X+ ,解析出细胞分裂时标记丢失的概率p =9 75 6× 10 -7,确定了方程的模型参数 .标记菌株的荧光光谱在激发波长为 4 0 0nm时 ,最大发射波长为 5 0 8nm ,与供体菌株完全相同 .在LB培养基上生长时 ,成团泛菌YS19B ::gfp的GFP产生时间在指数期末期到稳定期较快 ,并于培养至 2 0h时达到最高 ,同时单位菌体生物量的荧光强度也达到最大 .结果说明 ,在GFP标记后成团泛菌YS19B ::gfp的生长仅受到较小影响 ,不致对成团泛菌的生理活动造成大的改变 ,同时由于该菌对宿主的侵染能力比其它内生细菌要强得多 ,因而该菌对植物的侵染活性影响也较小 ,该菌仍然可以保持其内生优势地位 .该标记的稳定性比较高 ,荧光产生正常 ,很适     

元阳梯田地方水稻品种根部内生菌及根际微生物的分离与鉴定

采用组织分离法和土壤稀释涂板法,对元阳哈尼梯田2个地方品种‘月亮谷’和‘红脚老粳’的根部内生细菌及根际土壤细菌进行了分离,研究元阳梯田传统水稻品种特殊的内生菌组成.结果表明: 试验共得到399个菌株.经形态特征及生理生化鉴定,月亮谷根部和其根际土壤分别分离到8和5个属,其中5个属是共有的;红脚老粳的根部和其根际土壤中分别分离到10和7个属,其中6个属是共有的.经分子生物学鉴定,月亮谷根部分离到11个种和5个属,根际土壤分离到8个种和4个属,其中5个种和4个属是共有的;红脚老粳根部分离到9个种和5个属,根际土壤分离到10个种和3个属,其中4个种和2个属是共有的.通过分子生物学鉴定,大部分菌株都可以鉴定到种,而通过形态及生理生化特性只能初步鉴定到属,但两种方法在属层次上的鉴定结果基本一致.元阳地方水稻根部内生细菌及根际土壤细菌具有一定的种属同源性与特异性.     

一株羽毛针禾内生细菌的鉴定、功能及促生特性

【背景】羽毛针禾是沙漠群落演替中的“先锋”草本植物,可在荒漠贫瘠地带繁殖,其生命力顽强、繁殖速度快、种子量大、扩散广。【目的】探究羽毛针禾具有促生效应的内生细菌资源。【方法】从种子中分离出内源性细菌Z1,并对其进行了生物化学、发酵和促生等方面的研究。【结果】Z1菌落呈黄色球形,不透明,中央有小突起,边缘褶皱而湿润,镜检成直杆状,表面有细鞭毛,大小范围为(0.5-1.0)μm×(1.0-3.0)μm。经革兰氏染色试验、靛基质、甲基红、氧化酶、淀粉生产水解试验、V-P试验、明胶液化学试验测定后均呈阳性,甲基红试验、尿素分解实验测定均呈现阴性,是泛生菌属(Pantoea)的细菌。Z1具有产吲哚乙酸的能力,单位产量为3.14 mg/L;而且具有溶磷、解钾、分泌铁载体的能力。Z1菌株最佳发酵培养基条件是:氮源为蛋白胨,碳源是溶性淀粉,无机盐为碳酸钙,pH 9.0。Z1接种小麦10 d后促生效果明显,叶宽、株高、根长等指标分别增长了60.0%、13.5%和8.0%;小麦幼苗的叶片含水量、总叶绿素含量、氮含量、可溶性蛋白等指标均有显著提升(P<0.05)。【结论】Z1是一株具有促生潜力的功能菌...     

北京泛菌的生长特性及快速鉴定方法研究

[目的]研究分析了杏鲍菇软腐病病原菌北京泛菌的生长特性以及病原菌的快速鉴定方法,从而为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。[方法]测定了北京泛菌在不同温度、不同种类抗生素、不同浓度的杀菌剂二氧化氯的生长情况,以及采用特异性引物进行PCR鉴定病原菌。[结果]北京泛菌生长的最适温度28℃,对硫酸链霉素、羧苄青霉素等7类抗生素敏感,在含有50 mg/L的杀菌剂二氧化氯的培养基中不能生长,引物对hrp LF/R、wzx CF/R、tua GF/R和lps DF/R在北京泛菌能够扩增出目的条带。[结论]明确了北京泛菌的生长特性,50 mg/L的杀菌剂能够有效杀灭病原菌,并开发了4对特异性引物用于病原菌的快速、准确鉴定,为杏鲍菇软腐病的防控打下基础。     

一株高效解磷菌的筛选鉴定及溶磷性能

【背景】土壤中大部分磷元素是以难溶性磷酸盐的形式存在,不能被农作物有效利用,而传统化学肥料会带来环境污染等问题。【目的】解决土壤磷缺失现状,开发新型、安全、高效的微生物菌肥。【方法】取武汉科技大学图书馆后土壤为试验材料,筛选出一株高效解磷菌。通过个体形态鉴定、生理生化鉴定、16S rRNA基因序列分析鉴定菌株,以NBRIP为基础培养基进行条件优化,借助高效液相色谱进行细菌解磷机理探究。【结果】所筛选的高效解磷菌株为唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)。在20种氨基酸中,D-蛋氨酸对菌株的生长和溶磷促进作用最好,促进效果达到19.09%和16.16%,甲酸钠对菌株的生长和溶磷有抑制效果,抑制效果达到39.08%和10.66%。该菌株通过分泌葡萄糖醛酸、D-L-苹果酸等有机酸溶解环境中的磷酸盐,将菌株制作成菌肥对辣椒幼苗有明显的促生长作用。【结论】利用唐菖蒲伯克霍尔德氏菌(Burkholderia gladioli)分泌有机酸溶解土壤中的磷酸盐,可为生物肥料的制备和应用提供一定的理论参考。     

菠萝渣淀粉功能降解菌筛选及s2b7-4的鉴定

为了加快菠萝渣发酵,本试验通过利用多种选择性培养基,从自然发酵的菠萝渣中分离到多种淀粉分解菌,经过初筛和复筛,获得了降解菠萝渣的淀粉降解功能菌株s2b7-1和s2b7-4,筛选出其最适培养基为改良LB培养基及其优化组合。通过形态、生理生化和分子综合鉴定得出s2b7-4菌株为枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)。     

一株桑树内生拮抗菌的分离、鉴定及发酵条件优化

【目的】利用植物内生拮抗菌防治植物病害是一种有效的生物防治手段。本研究从健康桑树中分离筛选桑椹菌核病拮抗性内生细菌,为桑椹菌核病生物防治提供优良菌种。【方法】釆用组织分离培养法及抑菌圈法分离、筛选桑椹菌核病拮抗性内生细菌;根据菌体形态、培养特征、生理生化特性及基于16S rDNA序列的系统发育分析,对抑菌活性显著且稳定的菌株进行菌种鉴定;进而利用菌丝生长速率法检测活性发酵液的抑菌谱与热稳定性,并通过单因素及正交试验优化该菌株产生抑菌活性物质的发酵条件。【结果】从健康桑树中共分离获得55株内生细菌,其中XP-27菌株对核盘菌PZ-2的抑菌活性稳定且拮抗效果明显;XP-27菌株形态、培养特征、生理生化特性与芽孢杆菌属相符,基于16S rDNA序列的系统发育分析结果显示该菌株与多株甲基营养型芽孢杆菌(Bacillus methylotrophicus)的亲缘关系最近,且处于系统发育树的同一分枝,故将XP-27菌株鉴定为甲基营养型芽孢杆菌,命名为B.methylotrophicusXP-27;抑菌谱与热稳定性实验结果表明XP-27菌株对灰霉菌SWU5、腐霉菌SWU3等10种常见植物病原菌具不同程度的抑制作用,且其发酵滤液热稳定性强;发酵条件优化结果表明该菌株最佳培养基配方与培养条件为:牛肉膏1.00%,淀粉1.50%,K_2HPO_4 0.05%,MgSO_4·7H_2O 0.10%,初始pH值为8.0,培养温度为30°C,接种量为7%,发酵时间为120 h。【结论】筛选获得的桑树内生细菌B. methylotrophicus XP-27对桑椹菌核病病原菌核盘菌PZ-2具有显著拮抗作用,可作为开发桑椹菌核病生防制剂的候选菌株。     

小菜蛾肠道成团泛菌PxG45的分离鉴定及其抗真菌活性

【目的】昆虫肠道共生细菌是栖息在昆虫肠道中的微生物,是肠道微生物群落中最主要的成员。它们对昆虫的生长发育、营养吸收以及免疫系统均具有重要影响。本研究通过对小菜蛾Plutella xylostella肠道共生细菌进行分离培养和功能鉴定,以探究肠道共生细菌对小菜蛾适应性的影响及其对真菌的广谱抑制作用。【方法】利用体外平板培养分离纯化小菜蛾3龄幼虫肠道细菌PxG45菌株,结合形态学、16S rDNA基因测序和生理生化测定进行菌种鉴定。利用生物测定探究PxG45对小菜蛾3龄幼虫存活率及球孢白僵菌Beauveria bassiana侵染小菜蛾3龄幼虫对存活率的影响。通过平板对峙法检测PxG45对球孢白僵菌的抑制作用,进一步检测PxG45对植物病原真菌希金斯炭疽菌Colletotrichum higginsianum、刺盘孢炭疽菌C.camelliae、尖孢镰刀菌古巴专化型4号生理小种Fusarium oxysporum f. sp.cubense race 4、茄链格孢菌Alternaria solani、稻瘟病菌Magnaporthe oryzae和丁香假单胞菌杨梅致病变种Pseudomona...     

水稻内生成团泛菌YS19共质体形成差异表达蛋白MalE及其兼职功能

成团泛菌YS19是从水稻“越富”品种中分离的一种优势内生细菌,与宿主水稻互作时具有多种促生作用,其形成的共质体(symplasmata)结构与菌体抗逆及与宿主互作有重要意义．研究发现了一种在YS19共质体形成阶段高表达的差异蛋白,对其用肽指纹图谱进行鉴定,发现其属于周质空间麦芽糖结合蛋白家族．克隆了该蛋白质的基因,重组表达并分离纯化了该蛋白质,发现它是一种兼职功能蛋白,其不仅参与麦芽糖的ABC运输系统,而且在强酸环境下不易发生变性沉淀,并可通过疏水面的显著暴露结合底物蛋白来发挥分子伴侣活性,这些兼职功能构成了菌体抗逆生存适应性的重要分子基础．     

Trichoderma species form endophytic associations within Theobroma cacao trichomes

Trichoderma species are usually considered soil organisms that colonize plant roots, sometimes forming a symbiotic relationship. Recent studies demonstrate that Trichoderma species are also capable of colonizing the above ground tissues of Theobroma cacao (cacao) in what has been characterized as an endophytic relationship. Trichoderma species can be re-isolated from surface sterilized cacao stem tissue, including the bark and xylem, the apical meristem, and to a lesser degree from leaves. SEM analysis of cacao stems colonized by strains of four Trichoderma species (Trichoderma ovalisporum-DIS 70a, Trichoderma hamatum-DIS 219b, Trichoderma koningiopsis-DIS 172ai, or Trichoderma harzianum-DIS 219f) showed a preference for surface colonization of glandular trichomes versus non-glandular trichomes. The Trichoderma strains colonized the glandular trichome tips and formed swellings resembling appresoria. Hyphae were observed emerging from the glandular trichomes on surface sterilized stems from cacao seedlings that had been inoculated with each of the four Trichoderma strains. Fungal hyphae were observed under the microscope emerging from the trichomes as soon as 6 h after their isolation from surface sterilized cacao seedling stems. Hyphae were also observed, in some cases, emerging from stalk cells opposite the trichome head. Repeated single trichome/hyphae isolations verified that the emerging hyphae were the Trichoderma strains with which the cacao seedlings had been inoculated. Strains of four Trichoderma species were able to enter glandular trichomes during the colonization of cacao stems where they survived surface sterilization and could be re-isolated. The penetration of cacao trichomes may provide the entry point for Trichoderma species into the cacao stem allowing systemic colonization of this tissue.     

猪支气管败血波氏杆菌hcp基因缺失株构建及其生物学特性研究

【目的】构建猪支气管败血波氏杆菌(Bordetella bronchiseptica,Bb)Ⅵ型分泌系统(T6SS)溶血素共调节蛋白hcp基因缺失株,并对其基本生物学特性进行初步的研究。【方法】使用自杀性质粒介导同源重组的方法敲除猪支气管败血波氏杆菌QH0814菌株hcp基因,并比较hcp基因缺失前后,菌体对细胞的黏附入侵、小鼠毒力及组织载菌量上的差异。【结果】成功构建支气管败血波氏杆菌hcp基因缺失株QH0814Δhcp,连续传50代且遗传稳定;缺失株与亲本株生长无明显差异;缺失株的黏附能力与亲本株差异不显著,但入侵能力显著降低(P0.05);与亲本株相比,半数致死量提高,同时,缺失株对昆明鼠的感染能力也显著降低(P0.05)。【结论】hcp基因的缺失对支气管败血波氏杆菌增殖无影响,但缺失后其入侵能力和定殖能力显著降低,由此推测hcp基因与支气管败血波氏杆菌的入侵和定殖相关。     

一株酸枣内生菌的鉴定及其抗菌活性物质的初步分离

为了从酸枣中筛选出内生菌并分析其代谢产物中的活性成分,用于开发和生产药物,该研究通过组织块分离法和划线分离法,从陕北野生酸枣植株体内分离得到内生菌,采用平板对峙法测定其对7株供试指示菌的抗菌活性,以心神宁片提取液为对照,对各拮抗菌株的发酵液进行薄层层析和高效液相色谱分析。结果表明:从野生酸枣中共分离得到121株内生菌,其中内生细菌49株,内生放线菌6株,内生真菌66株;通过抗菌试验,发现54株内生菌(细菌33株,真菌21株)对1～7种指示菌具有抗菌活性,占分离菌株总菌数的44.63%,其中A-04、A-05、B-03、C-03、C-06和D-04共6株菌株的抗菌谱较广,对7种供试指示菌均具有抑菌活性;薄层层析检测结果显示菌株B-03发酵产物在R_f值为0.46处有与酸枣提取液层析带迁移率相同的显色带,液相色谱分析结果显示其属于黄酮类物质;通过16S rRNA基因序列分析结果显示菌株B-03与Bacillus axarquiensis的相似性为99%。菌株B-03能发酵产生黄酮类或产生与黄酮类类似的化合物,表明酸枣内生菌具有合成黄酮类药物的潜力。     

水稻种子内生泛菌(Pantoea spp.)系统发育多样性及其促生功能

【目的】Pantoea菌株是广泛分布在自然界中的一类功能多样的细菌。本研究对分离自水稻种子内生的Pantoea菌株进行系统发育分析及功能评价,从而确定分类地位、种类多样性、分布特征及功能特性。【方法】采用乙醇-次氯酸钠联合灭菌方法进行水稻种子的表面灭菌,进行内生细菌的分离与纯化;其次将纯化后的菌株进行16Sr RNA基因PCR扩增及序列分析,通过MEGA7软件构建系统发育树;将分离得到的菌株进行功能实验检测,如溶磷、产IAA、产铁载体、拮抗病原真菌等特性,最后检测菌株的溶血性;水稻分型采用SSR方法,并对水稻农学性状如分蘖数、株高、植株重及产量进行调查。【结果】本研究对分离自8个不同基因型水稻种子中的146株内生Pantoea菌株进行系统发育分析及功能评价,结果发现所分离到的泛菌菌株主要属于Pantoea dispersa、Pantoea agglomerans、Pantoea cypripedii以及Pantoea brenneri四个种,其中P. dispersa的菌株数量最多,分布最广,并且存在于所有的8个水稻种子样品中。对其中66株菌进行功能检测,发现86.3%和69.7%的菌株具有溶磷和产IAA能力,有7株菌具有产铁载体能力,未发现对真菌病害Fusarium moniliforme有拮抗作用的菌株,并发现3株菌具有溶血性;本实验未发现泛菌组成与水稻系统发育及农学性状存在明显的相关性。【结论】本研究首次对水稻种子中泛菌的多样性及其功能进行报道,发现不同基因型的水稻种子所含Pantoea种类及组成存在差异,种子选择性地积累了Pantoea类群,大部分菌株具有一定的促生特性。该研究结果有助于进一步探究微生物与植物的共进化、种子微生物的传播途径及作用方式。     

茶树内生草螺菌ZXN111生长素合成及其对云抗-10号植物的促生功能

【目的】以紫娟茶树分离的内生菌水生草螺菌ZXN111为研究对象,通过分子遗传学方法证实该菌株植物生长素吲哚3-乙酸(IAA)合成的主要分子途径。【方法】参考草螺菌基因组信息中IAA合成基因簇,选取与IAA合成密切相关的候选基因,即芳香族氨基酸转氨酶基因(tyrb),通过基因插入突变与基因互补方法,结合茶树组培苗体内促生能力分析,初步验证水生草螺菌生长素合成的主要机制。【结果】植物生长素IAA合成候选基因tyrb突变后,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB 48 h的IAA合成量显著低于野生型菌株ZXN111,且tyrb基因互补后,互补株tyrb::pK19mobΩ2HMB(+)的IAA合成能力得到了显著恢复。茶树促生实验发现,突变株tyrb::pK19mobΩ2HMB接种组的茶树组培苗根长、根重及植株鲜重指标上均显著低于野生菌处理组。【结论】水生草螺菌ZXN111有多条IAA合成途径,其中的吲哚-3-丙酮酸(IPA)是最主要途径,其生长素合成对寄主茶树具有显著的促生功能。     

艾纳香内生真菌Diaporthe sp.次生代谢产物

【目的】从艾纳香内生菌J1中获得活性次生代谢产物。【方法】对菌株J1进行ITS序列分子鉴定,综合运用多种色谱技术对其发酵产物进行分离纯化,结合波谱学技术对其进行结构表征。【结果】经构建系统进化树,鉴定菌株J1为Diaporthe sp.,从该菌株大米培养基中分离得到7个单体化合物,经鉴定分别为Dicerandrol A (1)、Dicerandrol B (2)、4,6-dihydroxy-1H-isoindole1,3(2H)-dione (3)、Cytochalasin H (4)、Cytochalasin J (5)、4,6-dihydroxy-2,3-dihydro-1H-isoindol-1-one (6)、Cerebroside C (7)。所有化合物均为首次从该菌中分得,化合物1对枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis KCTC 1021具有非常强的抑制活性,MIC值为0.125μg/mL。【结论】Diaporthe sp.富含抑菌活性化合物,具有开发成微生物源农药潜力。     

青枯雷尔氏菌胞外多糖合成缺失突变株构建及其生物学特性

【目的】由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物青枯病是一种毁灭性土传病害。胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)是青枯雷尔氏菌关键的致病因子之一。通过构建胞外多糖缺失突变株,研究胞外多糖在青枯病致病中的作用。【方法】从青枯雷尔氏菌FJAT-91的基因组中克隆出胞外多糖合成结构基因epsD同源臂,克隆至自杀性质粒p K18mobsacB,再将庆大霉素抗性基因(Gm)插入同源臂中间,获得重组质粒p K18-epsD。将重组质粒转化至青枯雷尔氏菌FJAT-91感受态细胞中,通过同源重组敲除epsD基因,获得EPS合成缺失的突变株FJAT-91Δeps 。研究突变株与野生菌株在菌落形态、胞外多糖合成、运动能力、定殖能力的差异性。【结果】突变菌株FJAT-91ΔepsD与出发菌株FJAT-91相比:胞外多糖产量显著减少,生长较慢;泳动能力(swimming motility)和群集运动能力(swarming motility)显著降低;在番茄苗根部和茎部的定殖能力显著降低;弱化指数(AI)为0.905,鉴定为无致病力菌株。【结论】胞外多糖在青枯雷尔氏菌的致病中起着关键的作用,本课题研究成果为开发植物疫苗提供了优良的材料与研究基础。