轮状病毒vp8基因在原核系统中的初步表达

通过RT—PCR反应获得轮状病毒Wa株vp8基因的cDNA片段,将其克隆入pGEX—5X—1表达载体中,构建重组质粒pGEX—VP8,转化大肠杆菌JM109,筛选阳性克隆子并对插入片段vp8进行序列测定,诱导后通过SDS—PAGE检测重组蛋白,并观察表达量随时间变化的特征。结果显示,测序结果与vp8序列一致,VP8蛋白的表达量在诱导后6—8h达到高峰。     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段.首先用Primer5.0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMD18-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度ZeocinTM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33/pPICZα-A-VP2.工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55 kDa,比预期的41kDa大.凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28%,表达量可达23 mg/L.间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清.     

鲤鱼生长激素和对虾白斑病毒囊膜蛋白VP28的融合表达及功能研究

鲤鱼生长激素GH是鲤鱼生长腺体分泌并促进鲤鱼生长的一种分泌蛋白.对虾白斑综合病毒(WSSV)VP28蛋白为囊膜蛋白,是病毒感染宿主的必需因子.根据gh和vp28的上下游序列,分别设计合成两对引物,PCR扩增gh和vp28基因,将基因gh和vp28按先后次序融合后插入穿梭质粒pPIC6αC多克隆位点,构建成重组分泌表达穿梭质粒pPIC6αC-(gh vp28),用Bstx1单酶切穿梭质粒pPIC6αC-(gh vp28)线形化,转化毕赤酵母X-33.重组菌株30℃甲醇诱导,实现在酵母中的融合分泌表达,获得融合蛋白.表达产物经SDS-PAGE检测和Western Blot印迹鉴定,显示与预期大小66kD相吻合的融合蛋白带.用Ni2 -柱纯化后的基因工程蛋白注射鳌虾进行蛋白生物功能测试,结果表明该蛋白获得了促鳌虾生长和抗WSSV感染的双重功效.     

法氏囊病病毒vp2基因在酵母中的分泌表达及鉴定

应用Pichia酵母表达系统高效分泌表达了传染性传染性法氏囊病病毒vp2基因片段。首先用Primer5．0设计1对引物P1、P2,以插入IBDV vp2基因的PMDl8-T-VP2载体为模板,扩增出带有终止密码子的1.4kb片段,将此片段正向亚克隆到酵母表达载体pPICZα-A上,将构建好的重组载体pPICZα-A-VP2用Sac Ⅰ内切酶线性化后,电击转化整合入Pichia PastorisX-33酵母菌,经高浓度Zeocin^TM筛选、表型鉴定、诱导表达及表达产物的鉴定,得到高效表达vp2基因的酵母工程菌X-33／pPICZα-A-VP2。工程菌72h培养上清的SDS-PAGE电泳与免疫印迹结果显示,vp2基因表达产物大小约为55kDa,比预期的41kDa大。凝胶薄层扫描结合Bradford蛋白质总含量测定结果表明,表达产物占工程菌培养上清总蛋白的28％,表达量可达23mg／L。间接ELISA结果表明重组表达产物能够有效地区分法氏囊病病毒标准阳性与阴性血清。     

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5'端(1bp～750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E.coli.BL21(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验.结果表明JL94株与国外分离株CRW-8株、BEN-307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96.98%和98.05%,说明JL94株与CRW-8株、BEN-307株属于同一VP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26%;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MA104细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性.     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP28的表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp28的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp28基因,成功构建重组表达载体pET22b-vp28并转化大肠杆菌BL21(DE3).基因工程菌株37℃IPTG诱导,表达产物经Western-blot和SDS-PAGE检测显示有与预期大小32kDa相符合的目的蛋白.用Ni2+-柱纯化的目的蛋白分别直接注射螯虾和包被饲料投喂螯虾,实验结果表明vp28在大肠杆菌中的表达产物有显著提高虾体抗WSSV感染力的作用,而且注射效果更好.     

对虾白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19的融合表达及其抗病毒感染作用

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp 19的序列,设计并合成引物,PCR扩增得到vp19基因并克隆到pGEM‐T载体中,经过BamHⅠ/Hind Ⅲ酶切、连接并将vp19插入到pET32b表达载体中.用重组质粒pET32b-vp19转化大肠杆菌Origami(DE3)pLysS,在IPTG诱导下,融合蛋白Trx-VP19以可溶性的形式得到表达,经SDS-PAGE和Western-blot检测显示其分子量与预期的大小相符合.目的蛋白经Ni2+柱纯化并定量后分别直接注射鳌虾和包被饲料投喂鳌虾.实验结果表明注射Trx-VP19可以提高鳌虾个体抗WSSV感染力的作用.     

A亚群禽白血病病毒囊膜基因gp85片段在大肠杆菌中的表达

将RAV-1囊膜基因gp85片段亚克隆到表达质粒pET-21d(+)中得到重组表达质粒pET-21d-RAV-1env(BglII/SalI),序列分析表明该插入片段的核苷酸序列和阅读框都与RAV-1囊膜基因相应序列相同.用其转化大肠杆菌BL21(DE3)并经IPTG诱导,SDS-PAGE分析表明RAV-1囊膜基因融合蛋白表达产物约20kD,与理论值相符;IPTG诱导起始时间比诱导持续时间对表达量的影响更大.     

白斑综合症病毒囊膜蛋白VP19、VP28的融合表达及中和抗体的制备

根据GenBank上WSSV囊膜蛋白基因vp19和vp28的序列,设计并合成两对引物,PCR扩增得到vp19和vp28两基因,大小分别为370bp和630bp.通过EcoRI位点连接两基因,再按正确的阅读框插入表达载体pET-22b(+)中,构建出重组表达载体pET-vp(19+28)并转化大肠杆菌BL21(DE3).基因工程菌株35℃IPTG诱导,表达产物经SDS-PAGE检测显示有与预期大小41kDa相吻合的融合蛋白带.用Ni2+-柱纯化的基因工程蛋白免疫新西兰大白兔制备抗血清,进行螯虾活体中和病毒实验,结果表明抗血清对WSSV的中和效率达到了100%.     

猪轮状病毒vp4基因在大肠杆菌中的表达

以猪轮状病毒JL94株核酸为模板扩增该病毒vp4全基因,对扩增产物进行测序及序列比较;根据VP4的5’端(1bp-750bp)特异片段主要决定其活性的观点,再设计一对引物扩增该主要抗原位点基因,将此主要抗原位点基因同pGEX-6P-1载体连接并转化入E．coli．BL2l(DE3)plays,经IPTG诱导表达出蛋白质;对表达的蛋白进行Westernblot分析、纯化和血清中和抗体试验。结果表明：JL94株与国外分离株CRW．8株、BEN．307株vp4全基因片段氨基酸同源性分别为96．98％和98．05％,说明JL94株与CRW．8株、BEN．307株属于同-vP4血清型;经IPTG诱导VP4主要抗原位点基因获得了高效表达,表达量占菌体蛋白的26％;Westernblot结果和所表达的融合蛋白免疫小鼠产生的中和抗体能阻断JL94在MAl04细胞上引起的细胞病变,说明所表达蛋白有良好的生物学活性。     

高山被孢霉ATCC16266△^6—脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中的表达

△^6－脂肪酸脱氢酶基因是形成γ－亚麻酸的关键酶。从含有高山被孢霉△^6－脂肪酸脱氢酶基因的重组质粒pT-MACL6中,酶切出1.4kb的目的片段,亚克隆到大肠杆菌和酿酒酵母的穿梭表达载体pYES2.0,在大肠杆菌中筛选到含有目的基因的重组质粒pYMAD6,用醋酸昔方法转化到酿洒酵母的缺陷型菌株INCSc1中,在SC－Ura合成培养基中,选择得到酿酒酵母工程株YMAD6。在合适的培养基及培养条件下,加入外源底物亚油酸,经半乳糖诱导后,收集菌体。通过GC－MS对酵母工程株进行脂肪酸色谱分析,结果表明,产生了31.6％的γ－亚麻酸,边是迄今为止,国内外△^6－脂肪酸脱氢酶基因在酿酒酵母中表达量最高的报道。     

HIV-1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES-KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV-1辅受体的配体、趋化因子RANTES和SDF-1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体.脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实RANTES和SDF-1可高效表达于HeLa细胞.结果表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV-1感染实验.     

重组人肝素酶在毕赤酵母中的表达

目的:建立肝素酶表达系统,大量制备人肝素酶,用于肝素酶的深入研究,及其抑制剂筛选模型的建立。方法:采用RT-PCR方法从肝癌细胞HepG2中克隆肝素酶全长cDNA,转入毕赤酵母表达体系,经甲醇诱导表达。结果:四唑蓝活性检测结果表明,表达产物具有肝素酶活性;Western印迹证实表达产物可被肝素酶抗体识别。结论:表达产物中含具有肝素酶活性的重组人肝素酶。     

Stathmin SiRNA表达载体抑制stathmin的表达

目的:构建stathmin特异性SiRNA质粒表达载体,探讨其对鼻咽癌5-8F细胞stathmin的沉默作用.方法:合成用于stathmin基因特异性干扰表达的DNA片段,经退火形成双链DNA片段,片段克隆到质粒表达载体pGenesil 1.1上.载体导入JM109菌株进行筛选与扩增,采用酶切和测序对克隆表达载体进行鉴定.应用脂质体将鉴定后的重组表达质粒载体转入鼻咽癌5 -8F细胞,RT-PCR与Western Blot分析stathmin基因表达.结果:经酶切和测序鉴定,插入SiRNA质粒表达载体的stathmin特异性碱基序列和方向正确.重组质粒表达载体转染鼻咽癌细胞后,细胞转染效率达78.8 ±6.8％,stathmin基因在鼻咽癌中的表达明显下降.结论:构建的stathmin基因SiRNA质粒表达载体能抑制stathmin的表达.     

HIV—1辅受体配体的融合表达载体的构建及表达

应用PCR扩增RANTES－KDEL基因,鉴定后与真核表达载体pCMV-S/K连接,构建成HIV－1辅受体的配体,趋化因子RANTES和SDF－1的融合表达载体pCMV-R-K-S-K,酶切鉴定和测序证明成功构建了pCMV-R-K-S-K融合表达载体。脂质体介导pCMV-R-K-S-K转染HeLa细胞,间接免疫荧光证实了RANTES和SDF－1可高效表达于HeLa细胞。细胞表明构建的pCMV-R-K-S-K融合表达载体能在HeLa细胞中高效表达,可用于下一步的HIV－1感染实验。     

外源基因在昆虫杆状病毒表达系统中的表达

随着杆状病毒载体和筛选方法的不断改进,通过Bac-to-Bac方法可以使杆状病毒最大重组率达到100%,缩短了构建重组载体的时间,极大提高了工作效率。另外,研究者开发了一些新的宿主域扩大的昆虫杆状病毒载体,能够在家蚕或蛹内进行高水平表达重组蛋白。昆虫杆状病毒表达系统具有完备的翻译后加工修饰功能和高效表达外源蛋白的能力等特点,是一种非常理想的真核表达系统。利用该表达系统现已成功表达了约千种外源蛋白。以重组杆状病毒为载体的昆虫表达系统、外源基因在该表达系统中的表达情况及在农业领域中的应用进行了介绍。     

Expression of Concern

“MiRNA‐218 regulates osteoclast differentiation and inflammation response in periodontitis rats through MMP9”, Cell. Microbiol. 2019;21:e12979, by Jie Guo, Xuemin Zeng, Jie Miao, Chunpeng Liu, Fulan Wei, Dongxu Liu, Zhong Zheng, Kang Ting, Chunling Wang, and Yi Liu. The Editors of Cellular Microbiology and the publisher John Wiley & Sons agree to publish an Expression of Concern regarding the above article, published online in Cellular Microbiology on November 16, 2018, in Wiley Online Library ( https://onlinelibrary.wiley.com/doi/full/10.1111/cmi.12979 ). In September 2019, the journal was contacted regarding concerns about the data presented in Figures 6 and 7 because of high level of similarities in the graphs presented in these figures. The different bars in the graphs show identical height. The standard deviation bars are also of identical length. Although one graph expresses the number of TRAP‐positive cells (Figure 6b) and the other graphs express the relative mRNA expression of different osteoclast‐related genes (Figure 6c‐g), all graphs are identical. The bars in the graphs in Figure 7 that represent 5 different osteoclast genes show the same height. Figures 6 and 7 show identical mRNA expression for a series of different genes: V‐ATPase, NFATc1, CTSK, DC‐STAMP and TRAP. In December 2019, the journal requested the authors to provide the raw data of the experiments presented in the article and for explanations of the similarities. The authors responded that the similarities were due to unintentional errors and provided Excel spread sheets containing processed data in March 2020. The data provided in the Excel sheets that were sent by the authors were analyzed and it was concluded that the calculations as shown in the Excel sheets are correct. However, the concerns raised regarding similarities in the heights of bars representing different parameters and narrow range of standard deviations presented in Figures 6–7 remained. The authors disagree with the concerns raised. In addition, the editors were concerned by manipulations of western blot images to represent single bands instead of doublets for COL1 in Figures 5 and 8 and for MMP9 in Figures 3A and C, 4C, 5A and D, and 8A. The first issue concerning COL1 bands has been addressed and corrected during the peer‐review process. The latter has been clarified after publication and following a request from the editors for the raw data of all figures in the article. In the published article, western blots of MMP‐9 in Figures 3A and C, 4C, 5A and D, and 8A show active‐MMP‐9 only and do not include pro‐MMP‐9 bands that were present in the original western blot experiments. The authors explained that on the original blots that were provided during the peer‐review process, MMP‐9 show doublets that represent pro‐MMP‐9 and active‐MMP‐9. As no significant difference was found for pro‐MMP‐9, the authors only presented single bands for active‐MMP‐9 in the publication version. The authors’ institution, Shandong University, did not respond to a request from the Publisher and the Editor‐in‐Chief to investigate whether the data arose from the originally reported experiments, are unmodified, and are suitable for publication. As a result, the journal is issuing this expression of concern to readers.