A1区替换提高人BDD-FⅧ重链的分泌并缓解其与轻链共转基因细胞链分泌的不均衡性

双载体转凝血Ⅷ因子基因(FⅧ)可有效克服腺相关病毒(AAV)载体容量限制,但FⅧ重链分泌的低效性导致重、轻链分泌的不均衡。重链分泌的低效性源自其A1区存在与内质网蛋白质分子伴侣结合的位点。本文在我们最近运用蛋白质剪接的双载体共转B区缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因研究的基础上,将重链的A1区替换为猪FⅧ的A1区,用融合蛋白内含子的重链和轻链转基因实验,定量分析了重链的分泌及其对共转重链和轻链基因细胞分泌剪接BDD-FⅧ蛋白和活性的影响。结果显示,变构体重链单独转基因时其分泌得到明显改善,达到89±12 ng/ml,明显高于人BDD-FⅧ重链的分泌(25±9 ng/ml);该变构体重链与轻链共转基因细胞分泌的剪接变构体BDD-FⅧ和活性分别为219±51 ng/ml和1.47±0.22 U/ml,明显高于剪接的人BDD-FⅧ的分泌量和活性(1 16±32 ng/ml和0.8±0.11 U/ml)。单独变构体重链和轻链转基因细胞合并培养后,其培养上清中检测到剪接的变构体BDD-FⅧ和活性,分别为38±7 ng/ml和0.22±0.05 U/ml,提示为不依赖细胞机制的蛋白质剪接所产生。结果表明,A1区替换后重链分泌的增强,可促进基于蛋白质剪接技术的双载体共转重链和轻链基因细胞分泌的剪接BDD-FⅧ水平和活性,并可缓解链分泌的不均衡性,为动物体内应用双AAV载体共转BDD-FⅧ重链和轻链基因研究奠定了实验基础。     

二硫键形成促进双载体转断裂B区缺失型凝血因子Ⅷ基因

双载体共转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)重链和轻链基因是克服腺相关病毒载体(AAV)容量限制的一种策略, 但重链分泌的低效性产生链不均衡性,影响转基因的功效．假设重、轻链链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,本文将BDD-FⅧ的重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys．双载体培养的COS-7细胞共转染突变重链和轻链基因,Western blot显示细胞内二硫键交联的重、轻链蛋白形成,ELISA和Coatest分析细胞培养上清的BDD-FⅧ重链分泌量和生物活性,分别为(109 ± 13) μg/L和(0.65 ± 0.12) U/ml,明显高于共转野生型重链和轻链基因细胞((71 ± 11) μg/L和(0.35 ± 0.05) U/ml)．结果表明,链间二硫键形成可提高双载体转BDD-FⅧ基因的功效,为进一步动物体内运用双AAV载体转BDD-FⅧ基因提供了实验依据．     

亮氨酸拉链提高小鼠血浆中剪接的凝血因子Ⅷ凝血活性

培养细胞实验表明,亮氨酸拉链通过改善内含肽(intein)的蛋白质剪接效率,提高双载体转B区缺失型凝血因子Ⅷ(BDD-FⅧ)基因细胞剪接FⅧ蛋白的分泌量和活性.本文从C57BL/6小鼠门静脉注射含亮氨酸拉链和Ssp DnaB内含肽融合的BDD-FⅧ的重链和轻链基因双表达载体,48 h后,检测到血浆的重链分泌量和FⅧ活性分别为(298±67)μg/L和(1.15±0.29)U/mL,明显高于不含亮氨酸拉链的双载体转BDD-FⅧ基因对照小鼠((179±59)μg/L和(0.58±0.19)U/mL).结果表明,亮氨酸拉链通过改善蛋白质反式剪接,提高基于蛋白质剪接的双载体转BDD-FⅧ基因小鼠血浆的凝血活性,为进一步双腺相关病毒(AAV)载体转BDD-FⅧ基因的甲型血友病基因治疗研究提供了依据.     

vWF-ΔPro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FVIII基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除．前肽缺失突变体vWF (vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白．为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合Ssp DnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性．结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21 ng/mL,活性为1.78±0.18 IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12 ng/mL和1.05±0.13 IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19 ng/mL和1.95±0.22 IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性．为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据．     

基于蛋白质反式剪接的双载体凝血Ⅷ因子基因转移

以intein的蛋白反式剪接为工具,研究了运用双载体的真核细胞凝血Ⅷ因子（FⅧ）基因转移,通过翻译后剪接得到完整的功能性FⅧ蛋白.将B结构域大部分缺失（Δ761~1639）的人功能性FⅧ（BDD-FⅧ）cDNA于剪接所需保守残基Ser1657前断裂为重链和轻链,分别与106和48个氨基酸的mini Ssp DnaB intein的N端（IntN）和C端（IntC）编码序列融合,构建一对在质粒pcDNA3.1的强启动子CMV驱动下的真核表达载体.用脂质体共转染至293细胞和COS-7细胞,培养48h后,收集细胞上清,用ELISA检测培养上清中剪接形成的BDD-FⅧ蛋白水平,用Coatest法检测上清的功能性FⅧ生物活性,并用Western blot观察细胞内的BDD-FⅧ蛋白质剪接.结果显示,两种细胞培养上清中有较高水平的剪接BDD-FⅧ蛋白形成,分别达到（137±23）和（109±22）ng/mL,由细胞内和细胞外（培养上清）的剪接共同组成 并检测到培养上清中较高水平的FⅧ生物活性,分别为（1.05±0.16）和（0.79±0.23）IU/mL,包括细胞内、外剪接产物BDD-FⅧ共同形成 细胞总蛋白的Western blot进一步显示共转染后细胞内高效剪接形成的BDD-FⅧ蛋白.表明intein可用于双载体系统真核细胞FⅧ基因转移,并不完全依赖细胞内的剪接产生具有高FⅧ生物活性的BDD-FⅧ蛋白,为进一步在甲型血友病基因治疗研究中应用双腺相关病毒载体（AAV）转运FⅧ基因,克服AAV载体的容量限制提供了依据.     

Met662和Asp1828的Cys突变增强蛋白内含子对共表达的BDD-FVIII因子重链和轻链的剪接

本文旨在通过B区缺失型凝血因子8(BDD-FVⅢ)重、轻链间二硫键形成,改善蛋白质反式剪接效率,提高双载体转BDD FVⅢ基因功效. 将BDD-FVⅢ重链A2区的Met662和轻链A3区的Asp1828突变为Cys,用蛋白内含子融合的重链和轻链基因共转染HEK293细胞,Western印迹检测到细胞内BDD-FVⅢ剪接量的提高以及重、轻链间二硫键的形成,用ELISA和Coatest测得细胞分泌至培养上清的剪接BDD-FVⅢ的量(119±14 ng/mL)和活性(1.06±0.08 IU/mL),明显高于野生型BDD FVⅢ重链和轻链基因共转染细胞的量(81±12 ng/mL)和活性(0.70±0.15 IU/mL);混合培养的转突变重链和轻链基因细胞培养基中剪接BDD FVⅢ的量(17±5 ng/mL)和活性(0.15±0.03 IU/mL),与混合培养的转野生型重链和轻链基因细胞 (分别为21±9 ng/mL和0.18±0.05 IU/mL)相近,反映不依赖细胞机制的蛋白质反式剪接. 结果表明,重、轻链间二硫键形成通过增强蛋白质反式剪接提高双载体转BDD FVⅢ基因的功效. 为进一步运用双AAV载体动物体内转BDD-FVⅢ基因提供了实验依据.     

vWF-△Pro改善基于蛋白质剪接的双载体BDD-FⅧ基因转移

多聚体von Willebrand因子(vWF)的功能之一是保护凝血Ⅷ因子(FⅧ)免受蛋白水解引起的快速清除.前肽缺失突变体vWF(vWF-ΔPro)不能形成多聚体,但可以结合FⅧ蛋白.为探讨vWF-ΔPro对基于蛋白质反式剪接作用介导的双载体转FⅧ基因后连接的FⅧ蛋白的分泌和活性的影响,将vWF-ΔPro基因和融合SspDnaB内含肽的B结构域缺失型FⅧ(BDD-FⅧ)断裂基因共转染293细胞进行转基因的瞬时表达,用Western印迹检测了单独转染vWF-ΔPro基因细胞的vWF-ΔPro表达量和蛋白形式,并检测了其对FⅧ的结合力;用ELISA法观察分泌至培养上清中的剪接的BDD-FⅧ,并用Coatest法检测由其产生的生物活性.结果显示,vWF-ΔPro转基因细胞呈现二聚体蛋白表达形式,其结合FⅧ的能力与转野生型vWF基因细胞相近;vWF-ΔPro共转染细胞上清中剪接BDD-FⅧ蛋白浓度为198±21ng/mL,活性为1.78±0.18IU/mL,明显高于未转染vWF-ΔPro基因的细胞对照(91±12ng/mL和1.05±0.13IU/mL),与共转染野生型vWF基因细胞对照相近(221±19ng/mL和1.95±0.22IU/mL),表明vWF-ΔPro可显著改善内含肽剪接的BDD-FⅧ蛋白的分泌和生物活性.为vWF-ΔPro转基因的基于蛋白质剪接技术双AAV载体转BDD-FⅧ基因动物体内实验提供了依据.     

前肽缺失体vWF改善FⅧ基因断裂转移细胞的重链和活性分泌

通过转von Willebrand因子(vWF)的前肽缺失突变体(vWF-△Pro)基因,探讨了vWF-△Pro对双载体转凝血Ⅷ因子(FⅧ)基因的影响.将vWF-△Pro基因和B-区缺失型FⅧ( BDD-FⅧ)的重、轻链基因共转染HEK293细胞48 h后,ELISA检测重链的分泌量为(142±29) ng/ml,明显高于未转vWF-△Pro基因细胞(87±15) ng/ml;未转vWF-△Pro基因时单独转重链基因的重链分泌水平很低,vWF-△Pro存在时重链分泌量明显提高,但不如共转基因时的重链分泌,提示轻链可反式促进重链分泌;单独转轻链或与重链共转基因时轻链分泌水平均较高,且不受vWF-△Pro影响;Coatest法检测分泌的凝血活性显示,转vWF-△Pro基因可使细胞分泌的凝血活性明显高于未转vWF-△Pro基因细胞(0.80±0.15 IU/ml vs 0.41±0.08 IU/ml).另外,转vWF-△Pro基因条件下,合并培养转重链和转轻链基因细胞的培养上清中,也检测到FⅧ凝血活性(0.23±0.09IU/ml),提示vWF-△Pro有助于分泌的重、轻链形成功能性异源二聚体.表明转vWF-△Pro基因可促进双链转FⅧ基因,为进一步动物体内实验奠定了基础.     

铜绿假单胞菌popN-突变子Ⅲ型分泌水平及与蛋白酶关系的研究

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Ⅲ型分泌系统(typeⅢ secretion system,TTSS)是重要的细菌致病因子之一,能够将酶蛋白直接注入到宿主细胞内,导致细胞损害的发生。重点研究了TTSS中的popN基因的功能,通过构建popN^-突变子,发现该突变子在非诱导条件下,能够分泌酶蛋白,显示popN基因编码的蛋白对TTSS蛋白的分泌具有负调控作用。进一步研究发现,popN^-突变子在不同培养基中TTSS的分泌水平存在着显著差异,影响对popN基因的功能的判断。为了解决这一矛盾,从几个方面分析了造成表型差异的可能因素,确定蛋白酶对TTSS分泌蛋白的降解作用,是表型差异存在的主要原因,从而首次系统地阐明popN^--突变子在不同培养基中都具有TTSS组成型表达的表型,对于深入研究TTSS的调控机制具有重要意义。     

铜绿假单胞菌popN-突变子Ⅲ型分泌水平及与蛋白酶关系的研究

铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa) Ⅲ型分泌系统(typeⅢ secretion system,TTSS)是重要的细菌致病因子之一,能够将酶蛋白直接注入到宿主细胞内,导致细胞损害的发生。重点研究了TTSS中的popN基因的功能,通过构建popN^-突变子,发现该突变子在非诱导条件下,能够分泌酶蛋白,显示popN基因编码的蛋白对TTSS蛋白的分泌具有负调控作用。进一步研究发现,popN^-突变子在不同培养基中TTSS的分泌水平存在着显著差异,影响对popN基因的功能的判断。为了解决这一矛盾,从几个方面分析了造成表型差异的可能因素,确定蛋白酶对TTSS分泌蛋白的降解作用,是表型差异存在的主要原因,从而首次系统地阐明popN^--突变子在不同培养基中都具有TTSS组成型表达的表型,对于深入研究TTSS的调控机制具有重要意义。     

模拟氮沉降对石栎和苦槠幼苗土壤呼吸的影响

用LI-8100开路式土壤碳通量测量系统测定模拟氮沉降4种不同处理水平(0、60、120\,240 kg · hm^-2 · a^-1)下石栎(Lithocarpus glabra)和苦槠(Castanopsis sclerophylla)幼苗的土壤呼吸速率及土壤温度、含水量对其土壤呼吸的影响。结果表明,氮沉降对土壤呼吸的影响根据施氮水平和幼苗的种类不同而异。低氮(60 kg · hm^-2 · a^-1)处理下石栎和苦槠的土壤呼吸速率平均值分别为(4.014±0.812)μmol · m^-2 · s^-1和(5.170±0.689)μmol · m^-2 · s^-1,比对照组(0 kg · hm^-2 · a^-1)土壤呼吸速率平均值(3.802±0.948)μmol · m^-2 · s^-1和(3.557±0.906)μmol · m^-2 · s^-1分别高5%和45%;两树种在中、高氮处理下均出现对土壤呼吸明显的抑制。其中石栎中、高氮实验组的土壤呼吸速率分别为(2.653±0.681)μmol · m^-2 · s^-1、(2.592±0.736)μmol · m^-2 · s^-1, 比对照组低27%和29%。苦槠中、高氮实验组的土壤呼吸速率为(3.563±0.402)μmol · m^-2 · s^-1、(3.466±0.994)μmol · m^-2 · s^-1, 比对照组低7%和8%;石栎在高氮(240 kg · hm^-2 · a^-1)处理水平下,其土壤呼吸速率同10cm土壤温度之间呈现显著的指数关系(R²=0.811,P=0.001),而在低、中氮实验均未发现有明显指数关系。苦槠各处理水平下其土壤呼吸与土壤温度之间均未发现有明显的指数关系;在土壤呼吸与5cm土壤含水量的相关性方面,仅有苦槠高氮实验组表现出明显的二次方程关系(R²=0.722),而其低、中氮实验组及石栎各实验组均未有明显的相关性;与单因素(温度、含水量)拟合它们与土壤呼吸速率的方程相比,多元回归分析得到的土壤呼吸速率同土壤温度和含水量之间的拟合方程在P=0.05水平上能更好地解释土壤呼吸的变化情况。石栎和苦槠在氮沉降处理下的土壤呼吸温度系数Q₁₀值分别为2.29、1.95、1.59和1.46、1.41、1.76,同对照组2.64和1.78相比,均有明显降低,且两者Q₁₀值的变化分别呈递减和先减小后增大的趋势,表明氮沉降是影响石栎和苦槠土壤CO₂通量的一个重要因素。     

研究: 载脂蛋白E拟肽EpK对apoE-/-小鼠动脉粥样硬化的影响

前期设计合成了一种模拟人载脂蛋白E(apoE)结构域的小分子多肽EpK,体外实验证实该拟肽具有抑制巨噬细胞炎症及增强高密度脂蛋白(HDL)介导细胞胆固醇外流的作用．本文拟借助慢病毒体系分泌性表达EpK,研究EpK在体对apoE基因敲除(apoE^-/-)小鼠动脉粥样硬化斑块的影响．将11月龄雌性apoE^-/-小鼠18只,随机分两组,分别经眼球后静脉丛注射pWPI慢病毒(Lv-GFP对照组)和含EpK的重组慢病毒(Lv-EpK组)．小鼠普食喂养,间隔采血监测血脂状态,检测血浆对氧磷酯酶(PON1)活性,病毒注射18周后小鼠安乐死,从主动脉根部连续冰冻切片及主动脉胸腹段纵剖面(en face)进行油红O染色分析斑块面积,采用实时荧光定量PCR检测小鼠肝脏相关基因的mRNA表达水平,蛋白质印迹检测血浆中apoA-Ⅰ、PON1及血清淀粉样蛋白A(SAA)水平．结果显示：慢病毒感染小鼠可成功在血循环中检测到EpK,与Lv-GFP对照组比较,Lv-EpK组apoE^-/-小鼠的血脂及脂蛋白分布、apoA-Ⅰ水平、PON1活性无明显改变,但EpK组小鼠的主动脉斑块面积较对照组显著减少(主动脉根部斑块面积(0.87±0.07) mm² vs (1.03±0.08) mm²,P < 0.05;主动脉胸腹段斑块占管腔比42.0% vs 55.8%,P < 0.01)．EpK可显著降低血中SAA水平,并抑制肝脏炎症因子TNF?琢和IL-6的表达．结果说明,EpK拟肽具有减退apoE^-/-小鼠动脉粥样硬化斑块的作用,其机制可能与其发挥的抗炎作用有关．     

前肽缺失vWF促进细胞分泌蛋白质剪接的L303E／F309S突变体凝血第八因子

该文旨在探索前肽缺失von Willebrand子（vWF-△Pro）对蛋白质剪接的L303E／F309S突变体凝血第八因子（FVIII）分泌的影响。将vWF-△Pro基因与蛋白内含子融合的F聊重链和轻链基因共转HEK293胞。结果显示,转vWF－△Pro细胞的剪接蛋白FVIll分泌量和活性分别为（196±27）ng／mL和（1．39±0-31）IU／mL,明显高于对照细胞的（116±24）ng／mL和（0．91±0．18）IU／mL。表明vWF－△Pro可提高剪接的L303E／F309S突变体FVⅢ蛋白分泌量和活性。     

猪VⅢ因子A1和A3结构域对翻译后剪接的人/猪杂合VⅢ因子的促分泌作用

凝血VⅢ因子(fVⅢ)蛋白的低效分泌以及基因过大是基于转fVⅢ基因的甲型血友病基因治疗的不利因素。本室前期用内含肽(intein)的蛋白质反式剪接实验证明,运用双载体共转fVⅢ基因,通过翻译后蛋白质剪接,轻链可顺式促进fVⅢ蛋白的分泌。本文用猪fVⅢ蛋白的A1和A3结构域替换人fVⅢ蛋白相应的结构,构建人/猪杂合fVⅢ(human/porcinehy-bridfVⅢ,HP-fVⅢ),研究基于内含肽的双载体转HP-fVⅢ基因后剪接HP-fVⅢ的分泌和活性。构建一对分别融合SspDnaB内含肽的HP-fVⅢ重链和轻链基因表达质粒,瞬时共转染COS-7细胞,用ELISA和Coatest法定量分析分泌至培养上清中HP-fVⅢ的剪接和生物活性,用Western blotting检测了细胞内HP-fVⅢ的剪接。结果显示,双载体转HP-fVⅢ基因细胞上清的剪接HP-fVⅢ蛋白量为(184±34)ng/mL,活性为(1.18±0.22)IU/mL,明显高于双载体转人fVⅢ基因[蛋白量为(48±12)ng/mL,活性为(0.31±0.10)IU/mL],提示猪fVⅢ的A1和A3结构域能显著促进内含肽剪接的HP-fVⅢ的分泌和活性;另外,还在混合培养的分别转内含肽融合HP-fVⅢ重链和轻链基因细胞上清中检测到剪接的HP-fVⅢ蛋白量为(27±5)ng/mL,活性为(0.19±0.07)IU/mL,提示内含肽对HP-fVⅢ的剪接可不依赖细胞机制,分泌出胞的前体蛋白仍可进行剪接反应;双载体转HP-fVⅢ基因细胞内检测到与转hfVⅢ基因阳性对照细胞内hfVⅢ条带大小接近的剪接HP-fVⅢ蛋白条带,进一步证实HP-fVⅢ的剪接。该结果为进一步在动物体内应用内含肽的双腺相关病毒载体转HP-fVⅢ基因奠定了实验基础。     

L303E/F309S突变促进细胞分泌内含肽连接的B区缺失型凝血VIII因子

凝血VⅢ因子(FVⅢ)尽管与凝血V因子具有相似的结构,但其分泌的低效性不仅限制了重组产品在甲型血友病患者中的广泛应用,也困扰基于转FVⅢ基因的基因治疗。为了提高FVⅢ的分泌效率,在我们以前用内含肽(intein)的蛋白质剪接功能介导的双载体转B区缺失型FVⅢ(BDD-FVⅢ)基因研究的基础上,探讨了重链L303E/F309S双突变对剪接BDD-FVⅢ蛋白分泌的影响。PCR突变法将L303E/F309S双突变引入我们以前构建的融合Ssp DnaB内含肽的野生型重链(HCIntN),得到融合内含肽的重链突变基因(DMHCIntN),与融合内含肽的轻链(IntCLC)基因共转染培养的293细胞,用ELISA检测了培养上清中的重链多肽和剪接的BDD-FVⅢ蛋白浓度,用Coatest法分析了培养上清的凝血生物活性。结果显示,单独转DMHCIntN和DMHCIntN与IntCLC共转染细胞上清中的分泌的重链多肽浓度分别为(35±12)ng/ml和(178±19)ng/ml,高于单独转HCIntN细胞和HCIntN与IntCLC共转细胞[(14±6)ng/ml和(127±23)ng/ml];共转DMHCIntN和IntCLC细胞上清中剪接的BDD-FVⅢ蛋白浓度和活性分别为(128±24)ng/ml和(1.01±0.15)U/ml,明显高于共转HCIntN和IntCLC细胞[(90±12)ng/ml和(0.71±0.14)U/ml];另外,单独转DMHCIntN和IntCLC的细胞合并培养后的上清也检测到剪接的BDD-FVⅢ蛋白[(20±3)ng/ml]和活性[(0.17±0.07)U/ml]。结果表明,双突变可提高重链的分泌效率并明显被轻链顺式提高,伴之以剪接BDD-FVⅢ的分泌增加,表明内含肽对双载体转BDD-FVⅢ基因功效的改善并表现出不依赖细胞机制的BDD-FVⅢ剪接作用。为进一步动物体内实验运用内含肽的双AAV转重链双突变BDD-FVⅢ基因研究奠定了基础。     

紫色红曲霉Mp-21 MpMcrA基因的克隆与生物信息学分析

McrA为最近在构巢曲霉(Aspergillus nidulans)中发现的全局调控因子，具有调控丝状真菌生长发育和次级代谢的作用，利用生物信息学分析方法找到并克隆紫色红曲霉（Monascus purpureus）中mcrA基因，将其命名为MpMcrA。分析MpMcrA蛋白质理化性质、亲疏水性、亚细胞定位、信号肽、跨膜区域及磷酸化位点、转录因子结合位点以及蛋白质二级结构。利用ProtParam、ProtScale、PSORTII、SignalP4.1等生物信息学软件对MpMcrA进行系统分析。 结果表明，MpMcrA基因长1 356 bp，其中含有3个外显子，2个内含子，编码410个氨基酸，与构巢曲霉序列比对蛋白相似性高达64％。预测结果显示，MpMcrA属于亲水蛋白，位于细胞核可能性大，不存在跨膜区域，不属于膜蛋白；不存在剪切位点，不属于分泌蛋白；基因含有54个潜在的磷酸化位点；可能存在5个转录因子结合位点；蛋白结构大部分为无规则卷曲，整体结构较松散。对MpMcrA基因进行了生物信息学分析，得到了基因特征和分析结果。初步确定MpMcrA基因为构巢曲霉同源mcrA基因，在红曲霉中未见有报道。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

HLA-A*2402-BSP在大肠杆菌中的优化表达及其四聚体的制备和鉴定

HLA-A^*2402是中国人群中最常见的等位基因之一,为研究该基因型人群的人巨细胞病毒（HCMV）特异性细胞毒T细胞（CTL）免疫应答,需要制备负载相应抗原肽的HLA-A^*2402四聚体。以RT-PCR方法克隆HLA-A^*2402重链基因的cDNA,并构建了羧基端融合生物素化酶BirA底物肽(BSP)的HLA-A^*2402重链胞外域融合蛋白（HLA-A^*2402-BSP）的表达载体,但该载体不能在大肠杆菌(E. coli)中有效表达HLA-A^*2402-BSP融合蛋白;通过对氨基端（N端）区域编码区的密码子进行优化,构建了同义突变的HLA-A^*2402-BSP表达载体,融合蛋白在E. coli中获得了高效表达。进而制备了负载HLA-A^*2402限制性HCMV pp65_341-349抗原肽(QYDPVAALF, QYD)的可溶性HLA-A^*2402-QYD单体分子和四聚体,获得的四聚体具有与HLA-A24⁺供者抗原特异性CTL的结合活性,特异性CTL的频率为总CD8⁺T细胞的0.09％～0.37％。这些结果为进一步研究HLA-A^*2402限制性的特异性CTL免疫应答规律奠定基础。     

Environmental induced variations in leaf dark respiration and net photosynthesis of <Emphasis Type="Italic">Quercus ilex</Emphasis> L.

The relationships between dark respiration rate (R _D) and net photosynthetic rate (P _N) in Quercus ilex L. shrubs growing at the Botanical Garden in Rome were analysed. Correlation analysis of the data sets collected in the year 2006 confirmed the dependence among the considered leaf traits, in particular, R _D was significantly (p<0.05) correlated with P _N (r = 0.40). R _D and P _N increased from March to May [1.40±0.10 and 10.1±1.8 μmol(CO₂) m⁻² s⁻¹ mean values of the period, respectively], when air temperature was in the range 14.8–25.2 °C, underlining the highest metabolic activity in the period of the maximum vegetative activity that favoured biomass accumulation. On the contrary, the highest R _D [1.60±0.02 μmol(CO₂) m⁻² s⁻¹], associated to the lowest P _N rates (44 % of the maximum) and carbon use efficiency (CUE) in July underlined the mobilization of stored material during drought stress by a higher air temperature (32.7 °C).