精制溶栓酶对家兔血浆t－PA和PAI的影响

精制溶栓酶对家兔血浆ｔ－ＰＡ和ＰＡＩ的影响雷丹青广西医科大学蛇毒研究所南宁５３００２１纤溶系统是机体阻止血栓形成的屏障,ｔ－ＰＡ（纤溶酶原激活剂）是纤溶系统的关键物质,ｔ－ＰＡ对纤维蛋白原有极高的亲和力,它能选择性的激活血凝块中的纤溶酶原生成纤溶酶,...     

纤溶酶原激活物抑制因子—1蛋白分子的结构与功能

纤溶酶原激活物抑制因子－１（ＰＡＩ－１）是组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）和尿型纤溶酶原激活物（ｕ－ＰＡ）的特异性抑制剂。对ＰＡＩ－１分子的结构与功能的认识,有助于了解ＰＡＩ－１作用的机理。本综述了近年来对ＰＡＩ－１蛋白分子结构与功能研究的进展,介绍了ＰＡＩ－１分子中一些区域的作用以及影响ＰＡＩ－１抑制活性的一些因子。     

凝血酶激活的单链尿激酶型纤溶酶原激活剂的构建、表达、纯化和性质研究

用Ｋｕｎｋｅｌ突变法,将单链尿激酶型纤溶酶原激活剂（ｓｃｕ－ＰＡ）ｃＤＮＡ基因中编码Ｐｒｏ１５５—Ｌｙｓ１５８的片段定点突变,并将此突变的ｓｃｕ－ＰＡ（ｔｓｃｕ－ＰＡ）的ｃＤＮＡ克隆到表达载体ｐＣＭ－β－ｎｅｏ中,与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞．获得的稳定表达株在无血清培养基中２４ｈ的表达量为６２０ＩＵ／１０６细胞．经锌离子螯合Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析得到ｔｓｃｕ－ＰＡ纯品．ＳＤＳ－ＰＡＧＥ显示ｔｓｃｕ－ＰＡ分子量为５３ｋＤ左右,与预期的结果相符．ｔｓｃｕ－ＰＡ是由凝血酶激活而不是由纤溶酶激活,但激活后也能转变为双链分子（ｔｃｕ－ＰＡ）．ｔｓｃｕ－ＰＡ仍保持了ｓｃｕ－ＰＡ的血纤维蛋白亲和性．酶动力学研究表明,激活后的ｔｓｃｕ－ＰＡ水解Ｓ２４４４的Ｋｍ和Ｋｃａｔ值与高分子量尿激酶（ＨＵＫ）相似．体外溶栓实验结果表明,ｔｓｃｕ－ＰＡ可以选择性地溶解富含凝血酶的血凝块,对贫凝血酶的血凝块作用不大     

人胎肺细胞的条件化培养液中两种类型纤溶酶原活化物的分离

用正常人胎肺细胞体外培养,从其培养液中分离纤溶酶原活化物（ＰＡ）,通过ＣＭ－ＳｅｐｈａｄｅｘＣ－５０层析,硫酸铵沉淀和Ｆｉｂｒｉｎ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ,Ｌｙｓｉｎｅ－Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ亲和层析及ＳｅｐｈａｄｅｘＧ－５０凝胶过滤等步骤,从１０．５ｌ条件培养液中分离纯化得到两种类型的纤溶酶原活化物,ｔ－ＰＡ９０μｇ,ｕ－ＰＡ８００μｇ．在还原条件下ＳＤＳ－ＰＡＧＥ均显示单带,分子量ｔ－ＰＡ为７２ｋＤ,ｕ－ＰＡ为５４ｋＤ,纤溶比活分别为１５６０００ＩＵ／ｍｇ蛋白和１０６０００ＩＵ／ｍｇ蛋白．     

蝮蛇抗栓酶对不稳定性心绞痛患者血中部分凝血及纤溶指标的影响

测定３８例不稳定性心绞痛（ＵＡＰ）患者血中纤维蛋白原（Ｆｇ）含量、组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）活性、血管性假血友病因子（ｖＷＦ）活性和血小板聚集率水平（ＰＡｇＴ）并与２１名正常人对比。患者中１８例用蝮蛇抗栓酶治疗,２０例行常规治疗。结果显示：ＵＡＰ患者血中ＰＡＩ－１、ｖＷＦ以及ＰＡｇＴ水平明显增高,ｔ－ＰＡ水平明显降低;蝮蛇抗栓酶组治疗后血中Ｆｇ、ＰＡＩ－１、ＰＡｇＴ水平均明显下降,使ｔ－ＰＡ水平明显升高;常规治疗组治疗前后各项指标无明显变化。认为蝮蛇抗栓酶对ＵＡＰ有可靠疗效     

去卵巢大鼠血浆组织型纤溶酶原激活物（t—PA）与其抑制物 …

目的：了解性激素对血栓形成的影响,方法：用发色底物方法测定去卵巢大白鼠及对照组血浆组织型纤溶酶原激活物（ｔ－ＰＡ）与其抑制物（ＰＡｌ）活性,结果：去卵巢组大白鼠血浆ｔ－ＰＡ与对照组比较无显著性差异（Ｐ〉０．０５）。而去卵巢组大白鼠血浆ＰＡＩ比对照组明显降低,两组比较有显著性差异（Ｐ〈０．０５）,结论：去卵巢组血浆中ＰＡＩ降低,可能与卵巢激素的减少有关。卵巢激素会促使 ＰＡＩ合成释放增加,这可能是服     

u-PA/t-PA嵌合型纤溶酶原激活剂(ut-PA)的构建、表达、纯化和性质研究

将尿激酶原（ｐｒｏ－ＵＫ）ｃＤＮＡ和组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）Ａ链ｃＤＮＡ克隆到Ｍ１３ｍｐ１８中,经过二次寡核甘酸诱导的大片段定点删除和一次寡核苷酸诱导的多位点突变,得到ｕ－ＰＡ（Ｌｅｕ１４４－Ｇｌｙ４０８）／ｔ－ＰＡ（Ｓｅｒ１－Ｔｈｒ２６３）（ｕｔ－ＰＡ）融合基因．将ｕｔ－ＰＡ融合基因克隆到表达载体ｐＣＭ－βｎｅｏ中,与ｐＣＭ－ｄｈｆｒ共转染ＣＨＯ／ＤＨＦＲ－细胞,筛选稳定表达株．收集无血清表达上清,经苯甲脒柱纯化得到ｕｔ－ＰＡ纯品,ＳＤＳ－ＰＡＧＥ和纤维蛋白自显影显示ｕｔ－ＰＡ有两种分子量形式,分子量分别为６８ｋＤ和６１ｋＤ．纤维蛋白亲和性试验表明,ＬＵＫ（低分子量尿激酶）对纤维蛋白没有亲和性,而含有ＬＵＫ的ｕｔ－ＰＡ则对纤维蛋白表现出很强的亲和性,但ｕｔ－ＰＡ的亲和性略低于亲本ｔ－ＰＡ．     

蕲蛇酶抗栓作用机理的初步分析

动物实验结果示,蕲蛇酶能裂解纤维蛋白原成为可溶性纤维蛋白,降低血中纤维蛋白原浓度,抑制血小板聚集,对抗在酶诱导的血浆凝块订的血浆凝块回缩,因而发挥防血栓形成作用。对纤维蛋白平板试验无直接溶纤作用,但能增加实验动物血中ｔ－ＰＡ活性。可能通过促使血管内皮细胞释放ｔ－ＰＡ而发挥溶栓作用。     

半衰期延长获得PAI－1抗性的t—PA突变体的构建、表达及特性分析

用基因重级及定位突变技术成功地构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１区缺失突变体ｔ－ＰＡｄｅｌＫ１、ＰＡＩ－１结合位点缺失突变体ｔ－ＰＡｄｅｌ（２９６－３０２）及两的组合突变全ｔ－ＰＡｄｅｌ（Ｋ１,２９６－３０２）,并在ＣＯＳ－７细胞中实现三的暂时性表达,在ＣＨＯ细胞中实现了ｔ－ＰＡｄｅｌ（Ｋ１,２９６－３０２）的稳定性表达。对表达产物的生物学特性分析表明,ｔ－ＰＡｄｅｌ（２９６－３０２）及ｔ－ＰＡｄｅｌ（Ｋ１     

组织型纤溶酶原激活剂（t—PA）cDNA序列的测定

已经从ｍｅｌａｎｏｍａ细胞系中成功地获得了人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ，在此基础上用双脱氧终止法测定了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ编码区全序列及３’非编码区部分序列，并发现与Ｐｅｎｎｉｃａ等发表的ｒ－ＰＡｃＤＮＡ序列相比，有两处差异，其一是第１７２５位核苷酸残基为Ｃ而非Ａ，并使此处序列与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比新产生一个ＳｔｙＩ切点，但由于差异发生在密码子第三位，没有引起编码的氨基酸变化；其二是第     

蚯蚓体内一种纤溶酶原激活剂(e-PA)的部分性质研究

从赤子爱胜蚓（Ｅｉｓｅｎｉａｆａｅｔｉｄａ）中纯化出的一种纤溶酶原激活剂（ｅ－ＰＡ）在纤维蛋白平板上可表现出三种活性,分别记为：ＣＦＰｇ,ｕＣＦＰｇ和ｕＣＦ．为更好了解各种活性与ｅ－ＰＡ的纤溶能力的关系,考察了在ＳＤＳ和不同抑制剂存在下各种活性的变化．结果表明,ＳＤＳ可以增强ＣＦＰｇ活性且使得ｅ－ＰＡ变得对一些抑制剂更敏感;ｌｅｕｐｅｐｔｉｎ,ｃｈｙｍｏｓｔａｔｉｎ,ｐｅｐｓｔａｔｉｎ,ａｐｒｏ－ｔｉｎｉｎ,ｐｈｅｎｙｌｍｅｔｈｙｌｓｕｌｆｏｎｙｌｆｌｕｏｒｉｄｅ（ＰＭＳＦ）和ｄｉｔｈｉｏｔｈｒｅｉｔｏｌ（ＤＴＴ）对ｕＣＦ没有影响;ｐｅｐ－ｓｔａｔｉｎ能增强ＣＦＰｇ和ｕＣＦＰｇ活性,Ｅ－６４（一种巯基抑制剂）能增强ｕＣＦＰｇ和ｕＣＦ活性．这些现象说明不能简单将ｅ－ＰＡ归结为丝氨酸蛋白酶或巯基蛋白酶．此外又以纤溶酶原为底物,分析了ｅ－ＰＡ在体外降解天然蛋白质的肽键特异性,结果表明：ｅ－ＰＡ可以切割碱性氨基酸,小的中性氨基酸及Ｍｅｔ的羧基端,同时ｅ－ＰＡ确能将纤溶酶原切割为纤溶酶;这一结论为ｅ－ＰＡ有可能成为新型溶栓药物提供了生化基础．     

t-PA K1区的同源模建及Kringle区与Lysine相互作用的研究

利用同源模建方法预测了ｔ－ＰＡＫ１区的三维结构。通过结构叠合确定了ｔ－ＰＡＫ１、Ｋ２区,纤溶酶原Ｋ１、Ｋ４区及ＵＫ Ｋ区的Ｌｙｓｉｎｅ结合口袋。静电势计算及疏水性分析表明,在ｔ－ＰＡ Ｋ２Ｃ Ａ２区以及纤溶酶原Ｋ１、Ｋ４区与纤维蛋白裸露的Ｌｙｓｉｎｅ之间在明显的的静电势互补和疏水面契合。确定了Ｋｒｉｎｇｌｅ区结合口袋与Ｌｙｓｉｎｅ亲和重要所基酸,分析了ｔ－ＰＡＫ１区,ＵＫ Ｋ区不能结合Ｌｙｓｉｎｅ     

去卵巢大鼠血浆组织型纤溶酶原激活物(t-PA)与其抑制物(PAI)的变化

了解性激素对血栓形成的影响。方法：用发色底物方法测定去卵巢大白鼠及对照组血浆组织型纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）与其抑制物（ＰＡｌ）活性。结果：去卵巢组大白鼠血浆ｔＰＡ与对照组比较无显著性差异（Ｐ＞０．０５）。而去卵巢组大白鼠血浆ＰＡＩ比对照组明显降低,两组比较有显著性差异（Ｐ＜０．０５）。结论：去卵巢组血浆中ＰＡＩ降低,可能与卵巢激素的减少有关。卵巢激素会促使ＰＡＩ合成释放增加,这可能是服用雌激素等避孕药者纤溶活性降低,血液呈高凝状态的重要机制之一     

组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）cDNA序列的测定

已经从ｍｅｌａｎｏｍａ细胞系中成功地获得了人组织型纤溶酶原激活剂（ｔ－ＰＡ）ｃＤＮＡ,在此基础上用双脱氧终止法测定了ｔ－ＰＡｃＤＮＡ编码区全序列及３′非编码区部分序列,并发现与Ｐｅｎｎｉｃａ等发表的ｔ－ＰＡｃＤＮＡ序列相比,有两处差异,其一是第１７２５位核苷酸残基为Ｃ而非Ａ,并使此处序列与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比新产生一个ＳｔｙＩ切点,但由于差异发生在密码子第三位,没有引起编码的氨基酸变化;其二是第１７７７位核苷酸残基（终止密码子后第４位核苷酸残基）为Ｔ而非Ｇ,使与终止密码子相隔３个核苷酸残基处产生了一个新的ＴＧＡ,与Ｐｅｎｎｉｃａ序列相比此处的ＢｓｔＮＩ切点也消失了。     

人组织型纤溶酶原激活剂（t－PA）突变体FrGGI的构建、表达及特性分析

为了获得半衰期延长,特异活性提高及具有ＰＡＬ－１抗性的新型ｔ－ＰＡ溶栓剂,利用基因重组及定位突变技术构建了ｔ－ＰＡ的Ｋ１、Ｋ２区糖基化位点消除,ＰＡＩ－１结合位点缺失,Ｆ与Ｅ区连接序列Ｈｉｓ４４～Ｓｅｒ５０置换为纤粘蛋白Ⅰ型Ｆ区间连接序列ＧｌｕＳｅｒＬｙｓＰｒｏＧｌｕＡｌａＧｌｕＧｌｕ的ｔ－ＰＡ组合突变体ＦｒＧＧＩ,并在中国仓鼠卵巢细胞中获得了高效表达。对表达产物的生物学特性分析表明,ＦｒＧＧＩ在大鼠血浆中的半衰期延长了１５倍,并获得了ＰＡＩ－１抗性,是一株很有希望的新型溶栓剂候选株。     

促乳素抑制培养的大鼠颗粒细胞中卵泡素介导的组织纤溶酶原激活因子的表达

本文主要是观察促乳素（ＰＲＬ）是否曩体外培养的大鼠颗粒细胞中,组织纤溶酶原激活因子（ｔＰＡ）和Ｉ型纤溶酶原激活因子抑制因子（ＰＡＩ－Ｉ）基因表达间的协调作用。我们采用了多种方法,例如ＳＤＳ－ＰＡＧＥ、免疫印迹等,来检测ＰＲＬ对ｔＰＡ和ＰＡＩ－Ｉ基因表达的作用。结果证实：（１）在离体条件下促乳素（ＰＲＬ）能刺激颗粒细胞（ＧＣ）中ＰＡＩ－Ｉ ｍＲＮＡ的合成,而ＦＳＨ无此作用。但ＦＳＨ可与ＰＲＬ协同增加     

纤溶酶原激活剂抑制物2型抑制细胞凋亡的研究进展

纤溶酶原激活剂抑制物２型（ＰＡＩ－２）是一种多功能蛋白质,除了能有效抑制尿激酶（ｕＰＡ）和双链组织型纤溶酶原激活物（ｔＰＡ）而调节纤溶活性外,还参与了很多其它的生理病理过程,例如组织重建、胚胎发育、感染、免疫系统发育、肿瘤浸润和迁移等。更有研究表明胞内型ＰＡＩ－２在抑制细胞凋亡方面也发挥着重要作用。本文就近年来ＰＡＩ－２抑制细胞凋亡的研究进展作一综述。     

几类天然产物对纤溶系统的作用

在初筛天然来源的小分子ＰＡＩ－１抑制剂过程中发现一些天然产物显示出活性苗头,进一步试验和选择性试验表明这些化合物都不同程度别对纤溶系统中存在的不同的酶具有抑制作用。化合物１（ｅｘｐｏｘｙｒｏｌｉｎ Ｂ）对纤溶酶有一定的抑制,化合物２（ｍｕｒｉｃａｔｉｎｃ）对ＰＡＩ－１具有一定的抑制作用且有较好的选择性。化合物４（ｃｈｅｒｉｍｏｌｉｎ－２）对纤溶酶较强的抑制。化合物５（ｍｏｒｉｎｄｏｎｅ）对凝血酶、     

2—型纤深酶原激活抑制剂研究进展

２－型纤溶酶原激活抑制剂（ＰＡＩ－２）是尿激酶型纤溶酶原激活剂的高效专一抑制剂。ＰＡＩ－２具有较高的稳定性,可以发生自我聚合。ＰＡＩ－２可与细胞内的细胞型纤溶酶原激活剂、纤连蛋白、谷氨酶胺转移酶等多种分子发生反应。ＰＡＩ－２与尿激酶型纤深酶原激活剂的反应遵循丝氨酸蛋白酶抑制剂的作用机制,其自我聚合的发生可能遵循环－片层机制。ＰＡＩ－２在肿瘤的侵润和扩散、皮肤组织受伤和治疗、炎症以及多种疾病的发生过     

糖基化、非糖基化、重组PAI－1功能和性质的比较

对从ＨｅｐＧ２细胞培养液中分离得到植基化和非糖基化ＰＡＩ－１（１型纤溶酶原激活物抑制剂）,以及从ｐＹＺＨＢＩ－６６表达菌中纯化的非糖基化重组ＰＡＩ－１的某些性质和功能进行比较,结果显示,糖基化ＰＡＩ－１对ｔＰＡ（组织型纤溶酶原激活物）有较强的抑制,能较显著地被蛋白质变性剂所激活,对热有较强的稳定性,糖基化与非糖基化ＰＡＩ－１在ｐＨ２．５－９．０的范围内都相当稳定。纤维蛋白原和肝素能明显提高两者对ｔＰＡ的抑制作用。