Q 型烟粉虱扬州种群 cyp6cm1基因内含子抗性相关多态性检测及其5′侧翼序列克隆

【目的】烟粉虱 Bemisia tabaci（Gennadius）已对包括有机磷类、拟除虫菊酯类、新烟碱类和昆虫生长调节剂等多种杀虫剂产生了不同程度的抗药性,其中尤以对新烟碱类杀虫剂的抗性问题最为突出。本研究旨在克隆 Q 型烟粉虱扬州种群细胞色素 P450基因 cyp6cm1片段序列及其5′侧翼序列。【方法】分别应用 PCR 和基因组步移技术克隆 cyp6cm1基因片段序列及其5′侧翼序列。【结果】 cyp6cm1基因片段序列包括63 bp 的外显子片段和826~829 bp 的内含子片段。多重序列比对发现,在内含子第195、230和242等3个碱基处存在与新烟碱类杀虫剂抗性相关的单核苷酸多态性（SNPs）。进一步利用基因组步移技术获得了长度为962 bp 的 cyp6cm1基因5′侧翼序列,利用 NNPP 在线分析软件预测转录起始位点为位于起始密码子上游57 bp 处的碱基 A;ConSite 软件分析发现,cyp6cm1基因5′侧翼序列具有 XRE-AhR、CREB、Oct-1和 Broad-complex-4等多种转录因子结合位点。     

江苏Q型烟粉虱抗性监测及其靶标基因克隆

应用成虫浸叶生测法研究了江苏省扬州、无锡和东台3个地区Q型烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)田间种群对5种杀虫剂的抗药性。结果表明,与相对敏感种群相比,Q型烟粉虱田间种群已对氯氰菊酯和吡虫啉产生了低到中等水平抗性,对阿维菌素仍然表现敏感。进一步通过RCR扩增获得了长度分别为287bp和184bp的烟粉虱乙酰胆碱酯酶ace1和para-同源钠离子通道基因片断。序列分析表明,江苏Q型烟粉虱存在与有机磷抗性相关的乙酰胆碱酯酶F331W突变和与拟除虫菊酯抗性相关的钠离子通道L925I和T929V突变。     

棉铃虫中肠P450CYP6B6基因5'上游序列的克隆及序列分析

已证实2-十三烷酮等植物次生物质的胁迫会诱导棉铃虫(Helicoverpa armigera)CYP6B6基因的过量表达[1].为探明棉铃虫P450 CYP6B6基因的表达调控机制,根据棉铃虫中肠P450 CYP6B6基因cDNA序列(GenBank登录号:AY950636),运用基因组步移的方法获得其5'上游区的序列,用启动子区的分析软件进行比对分析,结果得到棉铃虫P450CYP6B6基因5'上游区域1 333 bp的基因片段.分别运用NNPPv.2.2和TRANSFAC v.6.0预测转录起始位点及分析了转录因子结合位点,结果显示,该序列不仅包括TATA盒等这一类核心结构序列,还含有多个转录因子的结合位点,如GATA-1、Dfd、C/EBP、HSF、cytR和AhR(芳香烃受体化合物应答元件)等.该结果为深入研究棉铃虫P450 CYP6B6的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的研究奠定分子基础.     

棉铃虫细胞色素P450 CYP9A12基因5′-上游区的克隆及序列分析

细胞色素P450基因CYP9A12的过量表达已被证实与棉铃虫Helicoverpa armigera对拟除虫菊酯的抗性相关。为探明棉铃虫CYP9A12基因的表达调控机理,根据棉铃虫CYP9A12基因cDNA全长的5′-末端核苷酸序列,采用基因组步移方法,获得CYP9A12的5′-上游区序列（总长为3 575 bp）。与cDNA序列进行比对,表明在起始密码子上游3 bp处有一长为2 124 bp的内含子。利用NNPP分析软件预测出转录起始位点,与根据CYP9A12全长cDNA序列推测的结果是一致的。TFSEARCH 1.3软件分析转录因子结合位点的结果显示,该序列不仅包含启动子的核心结构序列——TATA-box和CAAT-box,亦包含多个转录因子结合位点,如GATA-1,CdxA,Dfd等。本研究结果为深入研究棉铃虫CYP9A12的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的分子机理奠定了一定基础。     

烟粉虱传毒相关蛋白基因的克隆及其表达量分析

【目的】烟粉虱Bemisia tabaci(Gennadius)是一种世界性的入侵性害虫,其传播的番茄黄化曲叶病毒(Tomato yellow leaf curl virus,TYLCV)给我国番茄生产造成巨大经济损失。为了阐明烟粉虱传播双生病毒的机理,本文拟研究明确B和Q烟粉虱体内传毒相关蛋白Gro EL基因及其表达量。【方法】采用特异性引物克隆了B和Q烟粉虱内共生菌编码的传毒相关蛋白Gro EL基因,并进行序列分析;并利用荧光定量PCR技术检测两种生物型及其获取双生病毒前后该基因的相对表达量。【结果】烟粉虱内共生菌Hamiltonella编码的Gro EL基因全长为1 668 bp,编码555个氨基酸;B、Q烟粉虱该基因的核苷酸序列相似性为99.94%,氨基酸同源性为99.82%;带毒烟粉虱中Gro EL基因的表达量显著高于未带毒的对应生物型烟粉虱;无论带毒与否,Q烟粉虱该基因的表达量均显著高于B(P<0.05)。【结论】烟粉虱携带TYLCV后可诱导Gro EL的表达量升高,B和Q烟粉虱中Gro EL基因及其表达量均存在差异,这可能是B和Q烟粉虱传毒效率存在显著差异的原因之一。     

与拟除虫菊酯抗性相关的烟粉虱钠通道基因突变及其检测

通过RT-PCR克隆了烟粉虱Bemisia tabaci (Gennadius) 南京种群(B-生物型)的钠离子通道结构域ⅡS4-6 cDNA片段,证实了与拟除虫菊酯抗性相关的是位于第925位亮氨酸到异亮氨酸的突变(L925I),并建立了L925I突变的PASA检测技术。与SUD-S敏感品系相比,2002年采自南京棉花上的烟粉虱种群对氯氰菊酯具有77倍的抗性,用氯氰菊酯对该种群进行多次筛选后,该种群对氯氰菊酯的抗药性提高到227倍。PASA检测结果表明筛选后的南京种群中100%个体都具有L925I突变(61.1%的个体为L925I突变纯合子,38.9%的个体为杂合子),而未筛选的南京种群只有75%个体具有L925I突变(35%个体为L925I突变纯合子,40%的个体为杂合子,25%的个体为野生型)。该结果表明了烟粉虱钠离子通道L925I突变与对拟除虫菊酯抗性密切相关。还讨论了烟粉虱对拟除虫菊酯抗性的代谢机理。     

褐飞虱细胞色素P450单加氧酶基因CYP4CE1的克隆及表达谱

为了解P450基因在褐飞虱Nilaparvata lugens适应水稻品种过程中的重要作用,利用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）,快速扩增cDNA末端（RACE）和长距离聚合酶链式反应（LD-PCR）技术,克隆了褐飞虱4龄若虫的CYP4家族的一个P450单加氧酶基因,被命名为CYP4CE1。该基因的全长cDNA序列（2 160 bp）含有一个1 626 bp的开放阅读框（ORF）,编码541个氨基酸残基的蛋白质。通过GenBank数据库中的blastx搜索引擎进行同源性分析,结果表明CYP4CE1编码的蛋白与岸蟹 Carcinus maenas的CYP4C39（GenBank登录号：JC8026）的相似性最高,两者的氨基酸序列同源性达43％;其次与热带蟑螂 Blaberus discoidalis的CYP4C1（AAA27819）及黑腹果蝇Drosophila melanogaster的CYP4C3（NP_524598）的相似性也较高,氨基酸序列同源性分别达42％。氨基酸序列比对表明该蛋白含有CYP4家族成员的所有保守特征序列,如螺旋K（E--R--P）,氧结合结构域即螺旋I（AG--T）,血红素结合区（PF--G---C-G--F）以及CYP4成员的特有特征序列（EVDTFMFEGHDTT）等。使用Northern杂交检测CYP4CE1随时间的表达变化,结果表明：与饲养于感虫水稻台中1号（Taichung Native 1,TN1）上的若虫相比,在取食中度抗性水稻Minghui 63（MH63）秧苗12,24,48,72 h的各时间段的褐飞虱体内,该基因有2.1倍的过量表达且表达水平保持稳定。进一步通过Northern杂交检测该基因的组织表达特异性,结果显示：该基因在取食TN1秧苗的若虫脂肪体中表达量最高,在肠道组织及体壁中的表达水平较低;褐飞虱取食MH63秧苗24 h后,该基因在体壁及脂肪体中的表达量略有上升（各约1.2倍）,而在肠道组织中的表达量则大幅升高（约12倍）。肠道整体原位杂交表明,CYP4CE1在取食TN1秧苗的若虫的肠道组织及马氏管中均有本底水平的表达;若虫取食MH63秧苗后,该基因在上述肠道各区段表达水平明显增强。结果提示,在褐飞虱与水稻互作过程中CYP4CE1的重要功能之一可能是参与水稻有毒次生物质的代谢。     

Q型烟粉虱UDP-糖基转移酶UGT354A1基因克隆及其在噻虫嗪抗性中的作用

【目的】UDP-糖基转移酶（UGTs）是昆虫主要的Ⅱ期解毒酶,可能参与昆虫抗药性的形成。本研究旨在探究Q型烟粉虱中UGT基因是否参与其对噻虫嗪的抗药性。【方法】依据烟粉虱基因组数据库设计引物,克隆其UGT354A1基因的全长序列;采用qRT-PCR技术检测UGT354A1基因在烟粉虱不同发育阶段、不同组织部位以及抗敏品系中的表达量;通过RNA干扰试验,验证UGT354A1基因在烟粉虱噻虫嗪抗性中的作用。【结果】序列生物信息学分析发现,UGT354A1基因属于典型的昆虫UGTs,包括两个糖基供体（DBR1和DBR2）和一个保守特征性基序。qRT-PCR结果显示,UGT354A1基因在噻虫嗪抗性品系（THQR）中的表达量为敏感品系（THQS）的2.60倍,且噻虫嗪可显著诱导该基因的表达。在不同发育阶段和组织部位中,发现UGT354A1基因在烟粉虱若虫和成虫阶段及头部和胸部表达丰富。RNAi后,沉默UGT354A1基因能够显著增加噻虫嗪对Q型烟粉虱的毒杀作用。【结论】UGT354A1基因在Q型烟粉虱中对噻虫嗪具有重要的解毒作用,可能参与了抗性的形成。     

烟粉虱MEAM1隐种漆酶-1基因全长cDNA克隆、序列分析与组织表达

多酚氧化酶是多种刺吸式昆虫唾液中的关键酶类,可以通过干扰寄主植物正常的氧化还原反应来调控食物来源使其更有利于昆虫本身。昆虫体内的漆酶-1属于多酚氧化酶家族,被认为参与昆虫取食过程中的金属离子代谢、降解植物次生有毒物质以及免疫防御等生理活动。为研究漆酶-1基因在烟粉虱MEAM1隐种Bemisia tabaci Middle East-Asia Minor 1组织中的功能,利用RACE技术首次获得了烟粉虱MEAMI隐种漆酶-1（laccase-1,lac-1）基因的cDNA全长序列,命名为Btlac-1 ( GenBank 登录号： JQ966215）。结果表明,该基因含有一个2 733 bp的开放阅读框,编码910个氨基酸,其编码产物含有3个Cu-oxidase功能域, 属于蓝多铜氧化酶家族成员。同源性比较分析表明,Btlac-1与黑尾叶蝉Nephotettix cincticeps和豌豆蚜Acyrthosiphon pisum的lac-1编码的氨基酸序列一致性达58%。Btlac-1在不同组织和发育时期的转录表达分析表明, Btlac-1在烟粉虱MEAM1隐种中肠中的转录水平最高,显著高于头胸部和腹部组织中,且在各个发育时期均有表达,在成虫期的表达水平较高。该结果为进一步明确lac-1在烟粉虱取食过程的生理作用奠定基础,也为探讨刺吸式昆虫与植物相互作用机制提供理论依据。     

烟粉虱Q与B隐种mtCOI基因的遗传变异及其对利用CAPS标记进行隐种鉴别的影响

【目的】为了评估VspI,StyI和StuI为基础的线粒体细胞色素氧化酶I基因（mtCOI）酶切扩增多态性序列（cleaved amplified polymorphic sequence, CAPS)标记方法鉴别烟粉虱Q与B隐种的有效性。【方法】本研究对国内外烟粉虱种群的mtCOI基因进行了测序并鉴定了其隐种;在对464个Q隐种、98个B隐种mtCOI序列分析的基础上,利用VspI,StyI和StuI对Q与B隐种分别进行了CAPS标记验证。检索并比对了GenBank中烟粉虱Q与B隐种mtCOI序列中VspI,StyI和Stu I酶切位点分布情况。【结果】对国内外烟粉虱种群研究发现,以Vsp I为基础的CAPS标记方法能够有效鉴别实验中的Q与B隐种;利用StuI或StyI的CAPS标记方法无法有效鉴别Q与B隐种。对GenBank中烟粉虱Q与B隐种mtCOI序列比对发现,利用VspI,StyI和StuI为基础的CAPS标记方法不能有效鉴别Q与B隐种。【结论】以VspI,StyI和StuI为基础的CAPS标记方法鉴别Q与B隐种方面均有一定的局限性。     

褐飞虱细胞色素P450基因CYP4C62的原核表达及多克隆抗体的制备

【目的】细胞色素P450单加氧酶在昆虫生长发育和适应环境过程中发挥着重要功能。【方法】本研究克隆了褐飞虱Nilaparvata lugens细胞色素P450基因CYP4C62的开放阅读框（不含信号肽编码序列部分）,在大肠杆菌Escherichia coli中实现了高效表达,经Ni-NTA琼脂糖凝胶亲和层析柱纯化得到了重组的CYP4C62蛋白。将该蛋白免疫日本大耳白兔Oryctolagus cuniculus雄兔,制备了兔抗CYP4C62血清抗体。采用间接ELISA方法检测了血清抗体的效价;并通过Western印迹杂交检测了该抗体的免疫学特异性。【结果】结果表明,通过大肠杆菌表达出的CYP4C62蛋白相对分子量为56 kD。间接ELISA法检测表明,制备的兔抗CYP4C62抗体的效价达到1∶100 000。Western印迹杂交证实,该抗体既可与异源表达的CYP4C62蛋白特异性结合,也可以与褐飞虱总蛋白中内源的CYP4C62特异性结合,表明具有较好的免疫反应特异性。【结论】CYP4C62多克隆抗体的成功制备,为后续分析CYP4C62在褐飞虱各组织中的时空表达水平,并通过免疫组织化学法定位分析该蛋白的组织、细胞及亚细胞分布规律,及最终解析CYP4C62的生物学功能奠定了基础。     

牧草盲蝽CYP6A13和钠离子通道LPVSSC基因的克隆及参与高效氯氟氰菊酯的抗性分析

昆虫对拟除虫菊酯类杀虫剂产生抗性主要是解毒酶活性的增强和钠离子通道的敏感度降低所致。本研究采用RT-PCR和RACE技术克隆获得了牧草盲蝽Lygus pratensis P450 CYP6A13基因(GenBank登录号：MN782520)及钠离子通道LPVSSC基因cDNA全长序列(GenBank登录号：MW821485)。其中CYP6A13基因全长2 003 bp,开放阅读框1 503 bp,编码500个氨基酸,预测蛋白分子质量为57.2 kDa,主要位于细胞内质网,等电点为5.77,无跨膜区和信号肽,存在血红素结合保守功能区。同源比对与系统进化分析表明,牧草盲蝽的CYP6A13与分类学关系上较为接近的昆虫同源蛋白间高度相似。钠离子通道序列LPVSSC开放阅读框6 072 bp,编码2 024个氨基酸,预测蛋白分子质量为228.94 kDa,等电点为4.99,无信号肽,有多个跨膜区域,4个同源结构域(I～IV),每个结构域有6个跨膜片段(S1～S6),存在MFM基序。基因表达谱结果表明：CYP6A13在牧草盲蝽成虫头部的表达量高于胸、腹部;室内筛选的高效氯氟氰菊酯抗性R_1...     

烟粉虱MEAM1隐种卵黄原蛋白受体基因cDNA的克隆、 序列分析及在不同发育时期的表达

卵黄原蛋白受体（vitellogenin receptor, VgR）是卵黄原蛋白被卵母细胞摄取的关键因子, 在卵黄发生和卵母细胞发育等生理过程中发挥着重要作用。为探讨烟粉虱Bemisia tabaci VgR的功能, 我们采用RT-PCR和RACE等技术扩增了烟粉虱MEAM1隐种B. tabaci Middle East-Asia Minor 1 (MAEM1) 的VgR基因cDNA 全长序列。生物信息学分析表明, 烟粉虱MEAM1隐种的VgR基因cDNA全长5 774 bp, 编码1 919个氨基酸, 推测分子量约201 kDa, N-端前31个氨基酸为信号肽。烟粉虱MEAM1隐种的VgR属于低密度脂蛋白受体（low density lipoprotein receptor, LDLR）家族, 蛋白质三维结构预测分析表明, 该受体具有LDLR家族基因典型的保守功能结构域。通过实时荧光定量PCR技术研究了烟粉虱MEAM1隐种VgR基因不同发育时期的表达, 结果表明VgR基因在伪蛹期开始表达, 并在羽化后1 d达到高峰, 此后逐渐降低, 3 d后又逐渐升高, 直至羽化后7 d达到峰值。研究结果丰富了卵黄原蛋白受体家族基因的数据库, 为今后深入研究并揭示烟粉虱卵黄发生的调控机制奠定了基础。     

棉铃虫细胞色素P450 CYP9A12基因5'-上游区的克隆及序列分析

细胞色素P450基因CYP9A12的过量表达已被证实与棉铃虫Heliocverpa armigera 对拟除虫菊酯的抗性相关.为探明棉铃虫CYP9A12基因的表达调控机理,根据棉铃虫CYP9A12基因cDNA全长的5'-末端核苷酸序列,采用基因组步移方法,获得CYP9A12的5'-上游区序列(总长为3 575 bp).与cDNA序列进行比对,表明在起始密码子上游3 bp处有一长为2 124 bp的内含子.利用NNPP分析软件预测出转录起始位点,与根据CYP9A12全长cDNA序列推测的结果是一致的.TFSEARCH 1.3软件分析转录因子结合位点的结果显示,该序列不仅包含启动子的核心结构序列--TATA-box和CAAT-box,亦包含多个转录因子结合位点,如GATA-1,CdxA,Dfd等.本研究结果为深入研究棉铃虫CYP9A12的表达调控机制及其参与杀虫剂抗性的分子机理奠定了一定基础.