白皮黄瓜鲨烯合酶基因cDNA克隆及生物信息学分析

为认识葫芦科植物中葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因结构特征,克隆白皮黄瓜鲨烯合酶(squalene synthase,SS)基因c DNA并进行生物信息学分析。根据葫芦科植物绞股蓝、罗汉果、红花栝楼等的鲨烯合酶基因cDNA序列,设计白皮黄瓜鲨烯合酶引物,分别采用3'RACE和5'RACE技术扩增鲨烯合酶基因3'端和5'端。获得白皮黄瓜鲨烯合酶基因的两个cDNA克隆,命名为CsSS1和CsSS2,其cDNA序列全长分别为1 627 bp和1 534 bp,都编码417个氨基酸残基,分子质量为47.6 k D。成功克隆得到白皮黄瓜鲨烯合酶基因全长cDNA序列并对其进行序列分析,后续可用于葫芦素生物合成途径所需鲨烯合酶基因正选择位点功能分析。     

青蒿鲨烯合酶基因的克隆、结构分析与大肠杆菌表达

用RT-PCR方法从青蒿(Artemisia annua L.)中克隆了一个1 539 bp全长鲨烯合酶cDNA.青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70%、77%、44%和39%.青蒿鲨烯合酶基因组DNA结构很复杂,包括14个外显子和13个内含子.全长的或C末端截短的鲨烯合酶cDNA被克隆进原核表达载体pET30a并在大肠杆菌(Escherichia coli) BL21(DE3)中诱导表达.但在含有全长的鲨烯合酶cDNA的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达,而C末端截短疏水区30个氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达.     

青蒿鲨烯合酶基因的克隆、结构分析与大肠杆菌表达

用RT-PCR方法从青蒿(Artemisia annua L.)中克隆了一个1539bp全长鲨烯合酶cDNA。青蒿鲨烯合酶氨基酸序列与拟南芥、烟草、人类、酵母鲨烯合酶的一致性分别为70％、77％、44％和39％。青蒿鲨烯合酶基因组DNA结构很复杂,包括14个外显子和13个内含子。全长的或C末端截短的鲨烯合酶cDNA被克隆进原核表达载体pET30a并在大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)中诱导表达。但在含有全长的鲨烯合酶cDNA的大肠杆菌中并没有观察到预期大小的鲨烯合酶表达,而C末端截短疏水区30个氨基酸的鲨烯合酶可在大肠杆菌中过量表达。     

青皮苦瓜鲨烯合酶基因ORF序列的克隆和正选择分析

为研究葫芦科植物中三萜皂苷生物合成通路中的关键酶鲨烯合酶的分子进化,克隆青皮苦瓜鲨烯合酶基因的c DNA序列,并进行正选择分析。根据葫芦科植物之间的同源性设计青皮苦瓜鲨烯合酶引物。采用3'RACE和5'RACE快速扩增技术分两步进行巢式PCR扩增鲨烯合酶ORF序列。根据克隆出来的青皮苦瓜编码框序列以及在Gen Bank数据库中完整的陆生植物鲨烯合酶编码框序列信息,用贝叶斯方法和PAML4软件进行鲨烯合酶的正选择分析。青皮苦瓜鲨烯合酶基因c DNA的克隆,命名为Mc SS,其c DNA序列全长为1 548 bp,ORF 1 251 bp,编码417个氨基酸残基。通过正选择运算,检测到33个正选择位点,其正选择位点主要集中在第二跨膜区及其两侧。本研究成功克隆得到青皮苦瓜鲨烯合酶基因全长c DNA序列并对其正选择分析,在三萜合成通路上为鲨烯合酶的定点突变提供重要参考。     

陆生植物鲨烯合酶适应性进化正选择位点分析

鲨烯合酶是三萜类皂苷生物合成途径中的关键酶,其活性的高低决定了三萜皂苷、植物甾醇等后续次生代谢物的含量．对鲨烯合酶进行正选择位点分析,可为识 别重要的功能位点提供有意义的信息．本研究在克隆获得五加科三七、葫芦科绞股蓝鲨烯合酶cDNA的基础上,结合GenBank中所登载的植物鲨烯合酶cDNA序列信息,利用位点模型检测并分析了38种陆生植物鲨烯合酶的适应性进化．结果显示,进化上相对保守的鲨烯合酶受到正选择作用,检测到的21个正选择位点大部分集中于第2跨膜区及其两侧,其中189S、194S、196S、265I、389P、390T、408A、410R和414N等9 个位点很可能与鲨烯合酶的活性有关．本研究从分子进化角度为调控三萜类化合物的生物合成提供了一个新的思路．     

麻疯树鲨烯合酶基因SQS的克隆及生物信息学分析

以麻疯树(Jatropha curcas L.)总RNA为模板,根据已报道的鲨烯合酶基因序列设计简并引物,用RACE方法克隆得到麻疯树鲨烯合酶基因全长cDNA,命名为JcSQS。JcSQS全长1609 bp,包含1个1242 bp的开放阅读框,预测麻疯树鲨烯合酶基因编码的蛋白含有413个氨基酸。JcSQS具有鲨烯合酶类的保守结构域,JcSQS 蛋白与蓖麻、柿、木榄等植物中SQS基因编码的氨基酸序列具有高度同源性。这为研究麻疯树萜烯类物质的生物合成和调控机制奠定了基础。     

SEFA-PCR法克隆灵芝鲨烯合酶基因启动子及其序列分析

鲨烯合酶是灵芝三萜生物合成的关键酶,灵芝鲨烯合酶基因的表达和活性的高低决定了灵芝中三萜含量的高低。根据已经获得的灵芝鲨烯合酶全长cDNA序列设计一对专一引物,通过PCR扩增得到了灵芝鲨烯合酶基因的基因组全长,序列长1984bp,含有3个内含子。根据其基因组序列设计引物,采用SEFA-PCR的方法,以总DNA为模板,克隆了灵芝鲨烯合酶基因的启动子序列,长1042bp。序列分析发现灵芝鲨烯合酶基因启动子中没有明显的TATA和CAAT框,但是含有CCAAT-bindingfactor、GATA-1、GC-box、TFⅡD等重要的转录因子的结合位点,以及在人和酿酒酵母鲨烯合酶基因启动子中发现的甾醇调节相关的顺式调控元件。     

盾叶薯蓣环阿屯醇合酶基因克隆与表达

利用巢式PCR和RACE技术从盾叶薯蓣中克隆了阿屯醇合酶的cDNA(定名为DZCAS).结果表明,该cDNA的开放读码框为2 280 bp,编码759个氨基酸的多肽,分子量为86 924 Da,等电点为6.39.氨基酸序列比对表明盾叶薯蓣阿屯醇合酶与其他植物阿屯醇合酶的相似性超过70%,含有环阿屯醇合酶共有的保守序列.利用氧化鲨烯环化酶基因缺陷型酵母表达DZCAS,并用高效液相色谱和液质联用仪检测酵母细胞中环阿屯醇合成情况,证明DZCAS编码环阿屯醇合酶.RT-PCR分析表明,DZCAS在盾叶薯蓣幼叶中表达量最高,其次是在地下幼嫩块茎中,而地上幼茎表达量最低.     

油茶种仁鲨烯合酶基因的分子特性与表达分析

角鲨烯含量是高品质植物食用油评判标准的重要指标之一。鲨烯合酶是角鲨烯合成直接相关的上游调控关键酶。本研究在已构建的油茶种仁转录组数据库基础上,设计特异引物,采用RACE技术获得油茶鲨烯合酶基因的全长cDNA序列,命名为CoSQS(Gen Bank登录号为JX914592)。生物信息学分析结果表明:该序列全长1554 bp,其中含全长的开放阅读框为1245 bp,编码415个氨基酸残基,CoSQS蛋白为弱碱性非分泌型蛋白,具有2个明显的跨膜区和2个角鲨烯和番茄红素合成酶的特异信号区。与柿Dk SQS同源蛋白亲缘关系最近,属于疏水性蛋白。亚细胞定位试验结果显示该基因定位于叶绿体。实时荧光定量PCR分析表明,5-10月间,油茶种仁中CoSQS基因表达量呈现先上升后下降的趋势,转录最高峰在9月下旬。通过关联分析表明CoSQS基因表达量与角鲨烯含量密切相关。     

刺五加鲨烯合酶基因cDNA的克隆与序列分析

采用改良的异硫氰酸胍法提取刺五加总RNA,逆转录为cDNA,根据已报道的人参鲨烯合酶基因(squalene synthase gene,SS) cDNA序列设计引物,利用RT-PCR法克隆刺五加SS基因的cDNA序列.克隆得到长度为1258 bp的刺五加SS基因cDNA序列,开放阅读框全长1248 bp,编码415个氨基酸残基,GenBank登录号为HQ456918,与人参的SS1、SS2和SS3氨基酸序列一致性分别为91.73％、97.59％和96.63％.首次分离并报道了刺五加SS基因cDNA序列,为刺五加苷生物合成中关键酶的表达分析及调控机理研究提供参考.     

丹参环阿屯醇合酶基因克隆及表达分析

以丹参cDNA为模板,克隆了丹参环阿屯醇合酶(cycloartenol synthase,CAS)基因的cDNA序列(SmCAS),对其序列进行生物信息学分析,并采用实时荧光定量PCR方法研究了该基因在丹参不同器官及不同胁迫处理下的表达模式。结果显示:该基因全长2 346bp,包含2 271bp开放阅读框,编码756个氨基酸。预测其编码蛋白分子量为86.16kD,具有氧化鲨烯环化酶超家族典型的DCTAE结构域和QW结构域。该基因推测的氨基酸序列与人参、田七、积雪草、甘草、拟南芥的相似性分别为83%、84%、83%、81%和80%。SmCAS基因在丹参根、茎、叶、花中均有表达,在花中表达量最高;而且SmCAS基因能够响应ABA、低温和干旱的诱导。     

广藿香八氢番茄红素合成酶PcPSY1基因克隆和序列分析

根据已获得的广藿香转录组数据中的PSY转录本序列,利用Primer 3在线设计基因全长扩增引物,采用RT-PCR方法获得广藿香的八氢番茄红素合成酶(phytoene synthase,PSY)基因。并利用在线分析平台和生物软件对该其因进行生物信息学分析。获得的广藿香PSY1基因长1 550 bp,编码439个氨基酸,命名为PcPSY1,GenBank登录号为KC862310; 预测了PcPSY1 编码蛋白的结构与功能,且基于PSY基因利用NJ法构建了与21个不同物种间的进化树,进化树表明广藿香PcPSY1基因与桂花的PSY序列亲缘关系最近。成功克隆并分析广藿香PcPSY1基因的全长序列,为进一步阐明广藿香萜类代谢途径奠定基础。     

巴西橡胶树两个蔗糖合成酶基因的克隆和表达分析

为了解蔗糖合成酶在巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)生长和发育过程中的功能,利用RACE技术从巴西橡胶树中克隆了蔗糖合成酶基因,并对基因的表达特征进行了分析。结果表明,从巴西橡胶树中克隆了两个蔗糖合成酶基因(HbSS1和HbSS2),HbSS1全长2864 bp,编码806个氨基酸;HbSS2全长2815 bp,编码811个氨基酸。两个基因编码的蛋白具有典型的植物蔗糖合成酶结构特征,包含1个磷酸化位点和两个保守的功能域。半定量RT-PCR分析表明,HbSS1和HbSS2在各组织器官中均有表达,其中HbSS1在叶中的表达量最高,HbSS2在树皮中的表达量最高,这说明HbSS1和HbSS2可能参与了各组织的生长和代谢过程,且功能有所分化。     

小桐子低温诱导查耳酮合酶基因的克隆及其表达分析

为了解查耳酮合酶在小桐子(Jatropha curcas)抗冷性形成中的作用, 基于小桐子低温锻炼转录组和数字基因表达谱数据, 克隆了低温新诱导表达的小桐子查耳酮合酶基因(JcCHS), 并分析了该基因的表达特性和功能。结果表明, JcCHS 基因的cDNA全长为1386 bp, 包含完整开放阅读框(ORF) 1170 bp, 编码389个氨基酸, JcCHS的理论分子量为42.2 kDa、等电点为6.53, 与蓖麻CHS 蛋白序列的相似性高达93.6%, 具有III 型聚酮合酶家族保守的查耳酮合酶/ 对苯乙烯合酶结构域。半定量RTPCR分析表明, JcCHS 在小桐子各组织中都有表达, 其中根的表达量较高。JcCHS 基因的表达能在一定程度上提高重组酵母菌的低温抵抗能力, 这说明JcCHS 基因可能参与了小桐子的抗低温响应。     

Cloning and expression analysis of hsp70 gene from freshwater planarian Dugesia japonica

Heat shock protein 70 (HSP70) is an important member of the heat shock protein family. It plays a key role in the process of protecting cells by facilitating the folding of nascent peptides as well as the cellular stress response. We isolated and sequenced a full-length HSP70 cDNA from planarian Dugesia japonica (designated Djhsp70) using rapid amplification of cDNA ends (RACE). Djhsp70 cDNA is highly homologous to other reported hsp70 family genes, and the deduced amino acid sequence shares several eukaryotic HSP70 family motifs. The length of the Djhsp70 ORF from planarian genomic DNA and cDNA was identical, which indicated the absence of introns in the Djhsp70 gene. Semi-quantitative RT-PCR was employed to detect the expression levels of Djhsp70 in response to stressors. Our results indicated that Djhsp70 was an inducible gene, expressed in response to temperature changes, amputation and starvation. Interestingly, the phylogenetic analysis of DjHSP70 supports the idea that planarians belong to a new phylogenetic position — Lophotrochozoans. This is the first molecular analysis of a heat shock protein gene in planarians.     

无芒隐子草CsPEAMT基因克隆及表达特性分析

以无芒隐子草(Cleistogenes songorica)干旱胁迫下的cDNA文库中磷酸乙醇胺N-甲基转移酶(phosphoethanolamine N-methyltransferase,PEAMT)基因的EST序列为基础,采用RACE方法克隆该基因编码区序列,该序列全长为2 104bp,开放读码框1 506bp,编码501个氨基酸。无芒隐子草PEAMT蛋白编码的氨基酸序列与多种植物的PEAMT氨基酸序列有较高相似性,其中与高粱SbPEAMT、玉米ZmPEAMT的蛋白序列相似性最高(93%),说明PEAMT基因在植物进化中非常保守。采用实时定量RT-PCR分析无芒隐子草幼苗在干旱过程中CsPEAMT基因的表达结果显示,干旱胁迫诱导CsPEAMT基因在根和叶中大量表达,且在干旱第8天时CsPEAMT基因在叶和根中表达量分别是未干旱对照的43.35倍和13.25倍,复水后CsPEAMT基因的表达量开始下调。研究表明CsPEAMT基因可能是无芒隐子草抗旱性相关的基因。     

巴西橡胶树HbWRKY1基因的克隆及转化烟草的初步研究

利用RACE结合RT-PCR技术,从巴西橡胶树(Hevea brasiliensis)总RNA中扩增得到长度为1234 bp的WRKY基因cDNA全长编码序列。通过氨基酸同源性比对,该序列推导的氨基酸序列与蓖麻、白杨的WRKY同源性分别为79%和73%,表明分离的cDNA序列为橡胶树WRKY基因,命名为HbWRKY1。通过构建pCAMBIA1304-HbWRKY1植物表达载体,经农杆菌GV3101介导,将HbWRKY1基因导入烟草(Nicotiana tabacum)中,对所获得的潮霉素抗性烟草株系进行PCR鉴定。结果表明,HbWRKY1基因已整合到65株转基因植株中。干旱胁迫试验表明,HbWRKY1的过量表达可以明显提高转基因烟草对干旱胁迫的耐受能力。这说明WRKY基因与橡胶树抗旱能力之间存在一定的关系。     

毛白杨蔗糖合酶基因PtSS2克隆与表达分析

为了解毛白杨蔗糖合酶(sucrose synthase,SS)基因功能和表达模式,以毛白杨茎段来源的cDNA为模板,根据毛果杨PtrSS2CDS序列信息设计特异引物,采用RT-PCR技术分离克隆了PtSS2基因。测序分析表明,PtSS2基因序列全长为2 412bp,编码803个氨基酸,蛋白大小为92.14kD,理论等电点6.00,属于酸性蛋白;氨基酸序列同源性分析表明,PtSS2与毛果杨PtrSS2和PtrSS1一致性分别高达100%和98.63%;结构域分析表明,PtSS2含有2个高度保守的功能域,即蔗糖合酶(5~552)和糖基化转移酶(554~744)功能域。qRT-PCR检测表明,PtSS2在毛白杨根、茎、叶、营养芽、雄雌花芽等各个组织中均有表达,但在营养芽和花芽中表达量较高,根部相对较低,总体呈组成型表达模式;在干旱胁迫下,PtSS2表达水平提升。研究结果推测,蔗糖合酶基因PtSS2在毛白杨各组织器官发育过程及干旱胁迫响应过程中具有重要功能。     

毛尖紫萼藓抗旱相关基因Gp-LEA的克隆与表达分析

以毛尖紫萼藓干旱cDNA文库中获得的一段与LEA基因同源性较高的EST序列为基础,采用RACE技术分离该基因cDNA全长序列,命名为Gp-LEA。Gp-LEA基因的cDNA全长814bp,开放阅读框456bp,编码含151个氨基酸蛋白质。生物信息学分析结果显示,Gp-LEA蛋白为稳定蛋白,分子质量为16.612kD,理论等电点（pI）为5.06,含有LEA₂功能结构域,不属于跨膜蛋白且不存在信号肽。系统发生分析表明,Gp-LEA基因编码蛋白与花旗松LEA蛋白亲缘关系最近。荧光定量PCR分析显示,Gp-LEA基因在复水和快速干旱模式下均能表达。推测Gp-LEA基因在毛尖紫萼藓的复水和干旱过程中起着重要作用。