无致病力青枯雷尔氏菌对烟草根系土壤微生物脂肪酸生态学特性的影响

为了探讨无致病力青枯雷尔氏菌对烟草根系土壤微生物群落结构的影响,测定了接种无致病力青枯雷尔氏菌RS-1403和清水对照的烟草根系土壤的磷脂脂肪酸(Phospholipid Fatty Acids,PLFAs),比较分析两种处理下的烟草根系土壤微生物PLFAs组成、含量、微生物群落结构及多样性的差异,以期从微生物群落水平解析RS-1403菌株胁迫对烟草青枯病的免疫抗病机制。结果表明,与对照相比,RS-1403菌株胁迫下烟草根系土壤微生物PLFAs的组成及含量发生了变化,分为5种变化类型,分别为下降型、无变化型、增加50%以下类型、增加50%—100%类型,增加100%以上类型,其中指示放线菌的10Me16∶0含量降低,为下降型,增加100%以上类型的PLFAs均指示革兰氏阴性菌。进一步分析表明,接种RS-1403菌株能改变烟草根系土壤微生物群落结构,促进细菌和真菌的生长,抑制放线菌的生长。接种RS-1403菌株能提高烟草根系土壤的群落优势度Simpson指数、群落丰富度Shannon指数和均匀度Pielou指数,增加土壤的微生物群落多样性。对RS-1403菌株胁迫下烟草根系土壤微生物亚群落分化的比较分析,显示RS-1403菌株处理组与对照组亚群落分化不同,当兰氏距离为2.56时,可将处理组和对照组均分为4个亚群落,但它们的各亚群落组成及特征不同。聚类分析表明,基本上可将取样期内的RS-1403菌株胁迫处理和清水对照的烟草根系土壤分别聚在两个不同的类群中,说明RS-1403菌株能明显改变烟草根系土壤微生物群落结构。     

培养条件对青枯雷尔氏菌脂肪酸组成的影响

应用气相色谱技术测定不同温度、培养时间、pH值等培养条件下青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)脂肪酸的结果表明: 青枯雷尔氏菌强致病力菌株Rs-J.1.4-010704-01v的脂肪酸种类有14~34种, 主要特征脂肪酸为C16:1ω7c/C15:0 ISO 2OH(10.644 min), C16:0(10.950 min), C18:1ω7c(14.177 min), 所占总百分比含量为总脂肪酸的55.66%~75.69%; 该菌脂肪酸的种类与含量随着培养条件的改变而发生变化,     

青枯雷尔氏菌拮抗菌黑曲霉xj的ARTP诱变选育

[目的]为了提高黑曲霉(Aspergillus niger xj)对青枯雷尔氏菌的拮抗活性.[方法]首先采用常压室温等离子体诱变技术对黑曲霉xj菌株进行诱变处理,然后以青枯雷尔氏菌作为指示菌,通过琼脂柱法和滤纸片法筛选正突变株,并对正突变株遗传稳定性进行研究,最后通过二倍稀释法测定其最小抑菌浓度.[结果] ARTP诱变...     

青枯雷尔氏菌胞外多糖合成缺失突变株构建及其生物学特性

【目的】由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的植物青枯病是一种毁灭性土传病害。胞外多糖(extracellular polysaccharides,EPS)是青枯雷尔氏菌关键的致病因子之一。通过构建胞外多糖缺失突变株,研究胞外多糖在青枯病致病中的作用。【方法】从青枯雷尔氏菌FJAT-91的基因组中克隆出胞外多糖合成结构基因epsD同源臂,克隆至自杀性质粒p K18mobsacB,再将庆大霉素抗性基因(Gm)插入同源臂中间,获得重组质粒p K18-epsD。将重组质粒转化至青枯雷尔氏菌FJAT-91感受态细胞中,通过同源重组敲除epsD基因,获得EPS合成缺失的突变株FJAT-91Δeps 。研究突变株与野生菌株在菌落形态、胞外多糖合成、运动能力、定殖能力的差异性。【结果】突变菌株FJAT-91ΔepsD与出发菌株FJAT-91相比:胞外多糖产量显著减少,生长较慢;泳动能力(swimming motility)和群集运动能力(swarming motility)显著降低;在番茄苗根部和茎部的定殖能力显著降低;弱化指数(AI)为0.905,鉴定为无致病力菌株。【结论】胞外多糖在青枯雷尔氏菌的致病中起着关键的作用,本课题研究成果为开发植物疫苗提供了优良的材料与研究基础。     

一株烟草青枯雷尔氏菌烈性噬菌体RS-PⅡ-1的分离及全基因组分析

分离鉴定一株侵染烟草青枯雷尔氏菌的烈性噬菌体,观察其形态特征,并进行全基因组测序与分析,为采用噬菌体疗法防治烟草青枯病提供技术储备。以烟草青枯菌TB15-15为宿主菌,从土壤中筛选分离得到噬菌体;分离得到的噬菌体经纯化浓缩,采用透射电子显微镜观察其形态特征;提取噬菌体DNA,进行全基因组高通量测序,分析其全基因组的结构特征,比较基因组分析明确其进化关系。以TB15-15为宿主菌,从长期种植烟田土壤中分离得到一株青枯雷尔氏菌烈性噬菌体。电镜观察显示,该噬菌体属于有尾噬菌体目、短尾噬菌体科。基因组全长42 042bp,GC含量为63.2%,含有46个开放阅读框,比较基因组分析确定该噬菌体为一株新的青枯雷尔氏菌烈性噬菌体,命名为RS-PⅡ-1。以烟草青枯菌为宿主菌,分离到一株新的青枯雷尔氏菌烈性噬菌体RS-PⅡ-1,明确了其形态和基因组特征,为防治青枯病的噬菌体疗法奠定基础。     

烟草青枯雷尔氏菌噬菌体资源的发掘

由青枯雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)引起的烟草青枯病是烟草种植过程中一种重要的细菌性病害。为了开展利用噬菌体防控烟草青枯病的研究,本研究以烟田产区的7株烟草青枯菌为宿主,从烟田土壤中分离到了14个对烟草青枯菌具有侵染性的烈性噬菌体,说明烟田土壤中普遍存在烟草青枯菌噬菌体。选取噬菌体?PB2和?PB34,电镜观察确定其具有十二面体的头部和粗短的尾部,属于肌尾噬菌体科。噬菌体的宿主谱分析显示,筛选到的噬菌体对分别从烟草、西红柿和花生分离的青枯菌株系的侵染性有所差异。本研究分离发掘的14个对烟草青枯菌侵染的噬菌体,为利用噬菌体防控烟草青枯病的生防策略研究提供了噬菌体资源。     

茄科雷尔氏菌的蛋白分泌系统及其特征

茄科雷尔氏菌利用自身的分泌系统能向胞外分泌上百种蛋白, 其中Ⅱ型和Ⅲ型分泌系统通过不同机制将分泌蛋白靶定到胞外或宿主细胞, 是决定茄科雷尔氏菌对宿主产生致病性的主要因素。其中Ⅲ型分泌系统不依赖Sec信号转导系统但必须依赖于宿主细胞的识别激活, 并在病原菌对宿主细胞的特异性识别和细菌在宿主细胞的生长增殖中发挥功能。到目前为止, 已经从茄科雷尔氏菌的GMI1000株系中鉴定出两类在宿主细胞中存在靶标, 并由Ⅲ型分泌系统分泌的效应蛋白Pop2和Gala蛋白家族。主要就茄科雷尔氏菌Ⅲ型分泌系统的基本特征以及效应蛋白及其宿主靶标的相互作用进行综述。     

青枯菌Rsc1285参与III型分泌系统及致病力的调控

摘要:【目的】研究青枯菌Rsc1285参与调控其III型分泌系统(Type III secretion system,T3SS)及致病力的途径。【方法】通过基因敲除、基因互补等研究Rsc1285对T3SS基因表达和致病力的影响。【结果】青枯菌rsc1285基因缺失突变体对寄主西红柿植株的致病力明显减弱,其hrpB、T3SS等基因表达水平较野生型明显降低,但hrpG、prhG的表达不受影响。【结论】青枯菌通过一个全新的途径利用Rsc1285调控hrpB及T3SS的转录表达并决定其致病力。     

茄科雷尔氏菌脂酰-CoA合成酶的功能鉴定

【目的】茄科雷尔氏菌是一种常见的农作物致病菌,引起植物青枯病。研究其脂肪酸代谢途径将有助于寻找新的抗菌药物靶点,为防治青枯病害提供新的思路。【方法】利用大肠杆菌FadD序列,进行同源比对发现茄科雷尔氏菌GMI1000中RSc2857(RsFadD)具有较高的相似性,推测其具有脂酰-CoA合成酶活性。采用PCR扩增方法获得RsfadD基因,连入表达载体pBAD24M后互补大肠杆菌fadD突变株,并检测转化子的生长情况。RsfadD与pET-28b连接后,在大肠杆菌BL(DE3)中表达,并利用Ni-NTA纯化获得带有组氨酸标签的RsFadD,体外测定RsFadD的活性。利用同源重组方法,获得RsfadD敲除突变株,分析突变株的生长性状。【结果】RsfadD异体互补大肠杆菌fadD突变株,恢复突变株在以脂肪酸为碳源的基础培养基上生长。体外活性测定RsFadD具有脂酰-CoA合成酶活性,对不同链长的脂肪酸都具有活性,但活性低于大肠杆菌FadD。RsfadD突变株在添加不同链长脂肪酸的基础培养上仅能微弱生长,而在丰富培养基上生长无差异。【结论】茄科雷尔氏菌中RsfadD编码脂酰-CoA合成酶,在脂肪酸利用过程中发挥重要作用。但RsfadD突变株在基础培养基上微弱生长,说明茄科雷尔氏菌基因组中还有其他的脂酰-CoA合成酶基因。以上研究结果为进一步研究茄科雷尔氏菌中脂酰-CoA合成酶以及脂肪酸利用机制奠定了基础。     

番茄青枯病拮抗菌的定向筛选及其抗病促生机制研究

[目的] 从抑病型番茄根际土壤中筛选青枯病的高效拮抗促生菌,阐明其防病促生机制。[方法] 以番茄青枯雷尔氏菌（Ralstonia solanacearum）为靶病原菌,采用平板抑菌圈法,筛选拮抗菌;通过BOX-PCR指纹图谱鉴定菌株多样性,以平板透明圈法评价其产酶活性,并针对抑菌能力强、产酶种类多的拮抗菌开展16S rRNA基因系统发育分析;通过温室试验评价拮抗菌的防病促生能力,并在此基础上通过实时荧光定量PCR研究生防细菌对番茄青枯病的防病促生机制。[结果] 从番茄根际土壤分离获得29株细菌,其中15株对青枯菌具有拮抗功能,进一步通过BOX-PCR指纹图谱、酶活分析获得4株具有潜在防治番茄青枯病、促进生长的功能菌（B2、B5、B20、B23）,通过16S rRNA系统发育分析鉴定B2拮抗菌为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）,B5和B20拮抗菌为枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）,B23拮抗菌为贝莱斯芽孢杆菌（Bacillus velezensis）;温室试验表明,B2、B5、B20、B23拮抗菌的抑病效果分别为35.59%、8.47%、32.20%、96.61%,并且均能显著增加番茄生物量和生理性状,如地上部鲜重、总叶绿素含量、地下部根尖数等。B2、B5、B23拮抗菌显著促进番茄株高和根长,B2、B20、B23拮抗菌显著增加茎粗;而B23拮抗菌显著增加根系分叉数;实时荧光定量分析表明,B2、B20、B23拮抗菌株可促进抗病相关功能基因PR1α、POD1的表达量,B2、B5、B23拮抗菌促进吲哚乙酸（IAA）信号通路应答关键基因ctd1的表达量,B2、B5、B20、B23拮抗菌均降低乙烯（ETH）信号通路应答关键基因ERF2的表达量。[结论] 本研究分离筛选获得4株对番茄青枯病具有显著防治效果以及促进番茄生长的PGPR菌株,可为定向筛选植物促生防病菌提供理论依据。     

茄科劳尔氏菌单克隆抗体的制备及其特性鉴定

茄科劳尔氏菌(Ralstonia solanacearum,RS)是番茄、茄子、辣椒、马铃薯等茄科蔬菜青枯病害的致病菌。为实现对RS的快速高效检测,以茄科劳尔氏菌株1.76免疫BALB/c小鼠,经细胞融合后利用间接酶联免疫吸附分析(Enzyme-linked Immunosorbent Assay,ELISA)筛选出3株能稳定分泌抗茄科劳尔氏菌株1.76的单克隆杂交瘤细胞株1C1、1B3和9D7。然后利用小鼠体内诱生腹水,1C1、1B3和9D7效价分别为1:1 024 000、1:64 000、1:256 000。采用饱和硫酸铵沉淀及Protein-G亲和层析法纯化腹水,经SDS-PAGE鉴定显示纯化后的单克隆抗体(Monoclonal Antibodies,mAb)纯度较高。纯化后单克隆抗体(2 mg/mL)效价分别为1:17 529、1:35 819、1:50 000,抗体亚型均为IgG1。对3株抗体进行特异性检测结果显示,1C1和9D7均不能与RS-5结合,1B3不能结合1.74和RS-5。此外,检测结果还表明3株单克隆抗体与桑肠杆菌JX-6、苏云金芽胞杆菌SYJ及实验室现有11株燕麦嗜酸菌卡特莱兰亚种、燕麦嗜酸菌西瓜亚种、玉米细菌性条斑菌、嗜酸菌魔芋亚种,梨火疫病菌QB0809、 XL-4,玉米细菌性枯萎病菌QB0241、QB0242,水稻细菌性谷枯病菌QB0017、QB0753、QB0755均无交叉情况。此次茄科劳尔氏菌抗体的制备,为后期青枯病菌的快速检测提供参考。     

短枝木麻黄家系对青枯病的抗性评价与选择

为探讨短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)对青枯病(Ralstonia solanacearum)侵染后的生理生化响应,利用其生理生化响应指标与抗病性特征的相关性开展短枝木麻黄家系的抗病评价和选择。结果表明,26个短枝木麻黄家系褐梗小枝接种青枯病后,病情指数(DI)和相对病害强度(RDI)均存在极显著差异(P<0.01)。在接种青枯病后,家系间的超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶(CAT)、苯丙氨酸解氨酶(PAL)、多酚氧化酶(PPO)、总酚(TP)和类黄酮(Flav)差异均达显著或极显著水平,说明参试家系对青枯病抗性的变异丰富,具有较大的选择潜力。短枝木麻黄家系的病情症状与6个生理生化指标间均呈显著或极显著的负相关关系,说明青枯病侵染后防御酶活性或次生代谢物含量越高,木麻黄的病害程度越低。利用2个病情特征性状和6个生理生化指标对短枝木麻黄不同家系进行综合评价和选择,按照30%的入选率初步选出201、206、198、207、202、213、208和195号等8个抗病家系。这些抗病家系的RDI和DI比总体均值分别低25.94%和28.93%,SOD、CAT...     

Screening rhizobacteria for biological control of Ralstonia solanacearum in Ethiopia

Bacterial wilt caused by Ralstonia solanacearum (Smith) has become a severe problem mainly on potato and tomato in Ethiopia and no effective control measure is available yet. To explore possibilities for the development of biological control for the disease, 118 rhizobacteria, most of them collected from Ethiopia, were screened against an Ethiopian R. solanacearum strain. On the basis of in vitro screening, six strains (RP87, B2G, APF1, APF2, APF3, and APF4) with good inhibitory effect were selected for in planta testing in a greenhouse. In the greenhouse, soil and tomato seedlings were treated with the antagonists and their effects studied. The study showed that APF1 and B2G strains significantly reduced disease incidence and increased weight of tomato plants. Area under disease progress curves (AUDPC) was reduced by 60% and 56% in plants inoculated with APF1 and B2G strains, respectively. Plant dry weight increase in plants inoculated with APF1 and B2G strains was 96% and 75%, respectively. APF1 was found to be the most beneficial strain in disease suppression and also growth promotion resulting in 63% dry weight increase compared to untreated control. The study revealed that APF1 and B2G strains are promising strains whose effectiveness under field conditions and their mode of action should be investigated.     

丛枝菌根真菌响应桉树茄科雷尔氏菌侵染进程基因的筛选与鉴定

【背景】桉树(Eucalyptus)青枯病危害严重,丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)与桉树共生影响桉树对青枯病的抗性,而AMF响应桉树青枯菌侵染的机制仍不清楚。【目的】探索AMF响应桉树茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的侵染机制。【方法】以非菌根化和异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)菌根化巨桉(Eucalyptus grandis)分别受茄科雷尔氏菌侵染0、24、48和96 h接种后(hour post-inoculated, hpi)的根系组织为研究对象,基于转录组测序筛选和鉴定菌根化巨桉根系中异形根孢囊霉响应茄科雷尔氏菌侵染的基因信息。【结果】与对应非菌根化桉树受茄科雷尔氏菌侵染的时间点相比,菌根化桉树中异形根孢囊霉响应青枯菌侵染显著差异表达基因为3 382–5 989个,随青枯侵染时间进程的增加,异形根孢囊霉特异性响应茄科雷尔氏菌侵染差异表达基因数量逐渐增多。茄科雷尔氏菌侵染24 hpi时,异形根孢囊霉显著富集共生体生长、孢子形成和凋亡信号通路、铁载体等相关基因;茄科雷尔氏菌侵...     

茄科作物青枯菌NADH脱氢酶F亚基在细胞运动和致病性中的功能研究

[目的]劳尔氏菌（Ralstonia solanacearum）在茄科作物上引起严重的细菌性青枯病,本研究旨在发掘青枯劳尔氏菌与致病相关的基因。[方法]利用Tn5转座子构建随机插入突变体,分析生物膜形成、细胞运动和致病性;对有表型变化的突变体,运用TAIL-PCR方法鉴定Tn5插入位点,确定所突变的基因。[结果]以模式菌株GMI000为出发菌,总共获得了400个突变体,其中2个突变体不能形成生物膜,在软琼脂平板上的运动能力下降;接种感病番茄植物,这2个突变体都不能引起萎焉症状。TAIL-PCR结果显示,2个突变体的Tn5插入位点都在NADH脱氢酶F亚基（nuoF）中,距离翻译起始位点分别为103-bp和225-bp。ripAY基因启动子推动的nuoF基因互补载体,完全恢复了2个突变体的表型。[结论]NADH脱氢酶复合物是微生物呼吸电子传递链中的第一步催化酶。我们的结果表明,NADH脱氢酶复合物对R.solanacearum生物膜形成、细胞运动和致病性也有重要作用。     

不同抗性短枝木麻黄种源苗木接种青枯病菌后酚类物质含量的变化

为了解短枝木麻黄(Casuarina equisetifolia)抗青枯病的机理,对接种青枯病菌(Ralstonia solanacearum)后短枝木麻黄的单宁和黄酮含量变化进行了分析。结果表明,不同抗性短枝木麻黄种源小枝的总酚和单宁含量呈现不同的变化趋势,高抗、中抗种源均呈现先升高后降低的变化趋势,峰值均约为126 mg g–1,但中抗种源的峰值出现时间较晚,而易感种源则呈逐渐升高趋势。抗、感种源木麻黄接种青枯菌后,小枝中缩合单宁含量均呈现逐渐升高的趋势,但高抗种源的缩合单宁含量均显著高于易感种源,增加70.33%。抗性种源黄酮含量呈S型上升趋势,易感种源则持续缓慢升高。这表明接种青枯病菌后,抗、感短枝木麻黄种源表现出不同的防御特征,次生物质含量增幅越大,抑菌抗氧化能力越强,短枝木麻黄表现出的抗性越强。     

致病性与无致病性茄科罗尔斯通氏菌转录组测序与分析

为了挖掘茄科罗尔斯通氏菌（Ralstonia solanacearum）致病相关基因,分别提取致病性（RS+）和无致病性（RS-）茄科罗尔斯通氏菌的总RNA进行转录组测序。两组测序数据经组装后得到5 111条Contigs,RS-和RS+对比发现779条差异表达基因（DEGs）,其中上调表达376条,下调表达403条。功能注释显示,这些DEGs主要集中在氨基酸代谢、膜转运、细胞运动和翻译等途径。信号通路富集显示,茄科罗尔斯通氏菌对寄主的响应由众多信号通路共同参与,其作用方式可能包括增强细菌趋化性、强化鞭毛组装能力、提高细菌分泌系统、上调双组分信号转导系统、调整MAPK信号通路和增强氨基酸代谢等。转录组测序还发现许多毒力基因,其中茄科罗尔斯通氏菌Ⅲ型分泌系统的hrp基因簇中的23个基因,有16个在无致病性茄科罗尔斯通氏菌中下调表达。随机挑选4个DEGs进行qPCR分析,荧光定量结果与测序数据基本一致,说明基于转录组分析DEGs的表达较为可靠。研究为进一步深入探究茄科罗尔斯通氏菌致病分子机理提供参考。     

马齿苋内生菌橘青霉和波兰青霉中抗青枯菌的活性物质

为了挖掘农作物病害生物防治新资源,以药用植物马齿苋(Portulaca oleracea)为材料,通过培养基种植法分离和纯化其根、茎、叶中的内生菌,以青枯菌(Ralstonia solanacearum)的抑菌试验评价其活性,采用菌落形态观察和ITS序列分析鉴定菌种。结果表明,从马齿苋筛选出2种具有抑制青枯菌的内生菌橘青霉(Penicillium citrinum)和波兰青霉(P. polonicum),采用液相与四极杆飞行时间串联质谱(UPLC-QTOF-MS)鉴定2种内生菌的主要活性物质为橘霉素,其对青枯菌的抑制效果比链霉素更好。因此,这为植物青枯病的生物防治提供科学依据。     

薯瘟菌对甘薯叶片光合特性及叶绿体结构的影响

为探讨甘薯(Dioscorea esculenta)被薯瘟菌(Ralstonia solanacearum)侵染后的响应,以抗病品种‘湘薯75-55’和感病品种‘胜利百号’为材料,对甘薯叶片的光合特性和叶绿体结构进行了研究。结果表明,薯瘟菌侵染后,‘胜利百号’叶片的细胞膜透性(MP)明显增大,叶绿素(Chl)含量下降,净光合速率(Pn)、蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)下降,胞间二氧化碳浓度(Ci)和内源ABA含量急剧升高,且细胞膜完整性被破坏,叶绿体数目减少、膨胀模糊、基粒片层松散解体以及淀粉粒变小;而‘湘薯75-55’的各个指标变化不大,细胞膜结构完整,叶绿体基粒片层排列整齐。因此,薯瘟菌侵染后不同抗病品种甘薯叶片在光合特性和叶绿体结构上表现出显著的差异。