高羊茅FaCONSTANS基因的表达及功能分析

植物由营养生长向生殖生长转变过程中光周期调控起着重要的作用。CONSTANS (CO) 是光周期途径中的特有基因,为探讨高羊茅FaCONSTANS (FaCO) 基因响应日照长短从而启动植物开花的机理,利用实时荧光定量qRT-PCR技术分析在长日照、短日照、持续光照、持续黑暗条件下FaCO基因的表达水平。构建过表达载体p1300-FaCO,利用农杆菌介导法遗传转化拟南芥,构建沉默载体p1300-FaCO-RNAi遗传转化高羊茅。结果表明,FaCO基因的表达受光周期调控,与生物钟控制的昼夜节律相关。在长日照条件下FaCO基因促进拟南芥开花,且恢复拟南芥突变体开花表型。RNAi沉默FaCO基因的高羊茅转基因植株晚花或者一直处于营养生长阶段。本研究初步探究高羊茅FaCO基因对开花过程的调控,这将有助于更进一步了解该基因的生物学功能。     

高羊茅春化基因FeVRN2的克隆及其在非生物胁迫下的表达

VRN2基因是受春化作用负调控的开花抑制子。为揭示非生物胁迫下高羊茅(Festuca elata)春化基因VRN2的分子调控机制,本研究以高羊茅为实验材料,采用c DNA末端快速扩增技术,克隆得到VRN2基因全长c DNA序列,命名为Fe VRN2。Fe VRN2基因c DNA全长为1 219 bp,具有一个完整的长度为657 bp的开放阅读框,编码蛋白质产物长度为218个氨基酸,并包含一个CCT保守结构域。同源性分析表明Fe VRN2与禾本科植物圆锥小麦(Triticum turgidum)、节节麦(Aegilops tauschii)、山羊草(Aegilops speltoides)、二穗短柄草(Brachypodium distachyon)、大麦(Hordeum vulgare subsp.vulgare)的亲缘关系非常近。荧光定量PCR结果显示:Fe VRN2基因在高羊茅叶片中的表达受高温、干旱与高盐胁迫特异诱导,说明该基因参与了高羊茅对高温、干旱与高盐胁迫的适应性调控。     

Dnd1的蛋白亚细胞定位及其对HeLa细胞增殖的抑制作用

小鼠睾丸生殖细胞瘤易感基因Dnd1编码的蛋白是一个在进化中保守的RNA结合蛋白.为探讨小鼠Dnd1的蛋白亚细胞定位和对细胞增殖的影响及其机制, 利用生物信息学技术, 采用组合的亚细胞定位分析软件对Dnd1进行真核生物亚细胞定位预测; 利用融合绿色荧光蛋白(green fluorescent protein, GFP)定位的方法, 通过构建pEGFP-Dnd1重组质粒, 将重组质粒pEGFP-Dnd1转染HeLa细胞和GC-1细胞, 在荧光显微镜下观察Dnd1的蛋白亚细胞定位; 用MTT法和流式细胞技术测定Dnd1过表达对HeLa细胞的增殖能力的影响和细胞周期的改变; 在HeLa细胞系中检测Dnd1对AP-1转录活性的影响. 结果表明: ① 生物信息学预测Dnd1主要在细胞核表达, 在细胞质中也有少量表达; 荧光显微镜下观察发现,Dnd1蛋白主要定位在细胞核, 在细胞质中也有少量分布; ② Dnd1基因在HeLa细胞系中的过表达抑制细胞增殖和诱导细胞周期G1期阻滞;③ Dnd1抑制AP-1的转录活性,从而抑制AP-1介导的转录是Dnd1抑制细胞增殖的可能机制.本研究初步明确了Dnd1的蛋白亚细胞定位及其对HeLa细胞的生长抑制作用, 这为进一步研究Dnd1基因的功能建立基础.     

植物非编码RNA调控春化作用的表观遗传

在自然界中许多高等植物需要通过冬季的低温阶段实现从营养生长到生殖生长的时期转化,这一生物学过程称作春化作用。小麦(Triticum aestivum L.)和油菜(Brassica napus L.)等作物以种子为产品器官,生产上往往通过茬口安排和栽培措施使植株尽早通过春化作用,以促进花芽形成和花器官发育,而大白菜(B rapa ssp.pekinenesis)和甘蓝(B.oleracea)等作物以叶球等营养器官作为产品器官,生产上则设法避免低温引起的春化作用,以保证产品器官的充分生长。FLOWERING LOCUS C(FLC)作为一种重要的开花抑制蛋白负调控春化作用,参与植株从营养生长向生殖生长的转化过程。文章综述了春化中FLC表达受抑制主要通过低温诱导表达FLC基因区域的非编码RNA以及VRN1、VRN2、VIN3等蛋白参与介导组蛋白甲基化,从而在表观遗传上控制春化作用的进程和产品器官的正常发育。     

pEGFP-HPV16E7重组融合蛋白质粒的构建及其表达

应用基因重组技术,构建增强绿色荧光蛋白(EGFP)与人乳头瘤病毒16型E7(HPV16E7)的重组融合表达质粒,经限制性内切酶酶切鉴定和PCR分析后,用基因转染技术将其导入小鼠肝癌细胞,荧光显微镜下观察融合蛋白的表达.酶切鉴定和PCR分析证实重组质粒中插入目的基因片段的大小、方向和插入位点均正确,在转染的小鼠肝癌细胞中观察到绿色荧光蛋白的表达.构建的pEGFP-HPV16E7融合表达质粒能直观地反映转染细胞中EGFP-HPV16E7融合蛋白的表达.由于转化率与表达率融为一体,故有利于对转染细胞的筛选,缩短转染细胞在体外的筛选的时间适用于对HPV16E7分子生物学特性、致瘤机理及APC提呈等的研究.为建立表达HPV16E7的实体瘤动物模型奠定了基础.     

香蕉钙调蛋白基因MaCAM在非生物胁迫下的表达分析

为研究香蕉钙调蛋白基因MaCAM的功能,对香蕉幼苗进行盐、低温和干旱胁迫处理,利用荧光定量PCR技术分析香蕉根中钙调蛋白基因MaCAM在上述不同非生物胁迫条件下的表达特性.盐胁迫处理后MaCAM表达随时间延长为先增加后降低趋势,在处理4 h时表达量最高;低温胁迫处理后,MaCAM的表达量随温度降低呈梯度增加,在温度降至5℃时表达量在处理范围内达最大值;干旱胁迫处理后,MaCAM的表达量随胁迫程度增加也是呈梯度增加,重度干旱胁迫时在处理范围内表达量最高.说明香蕉中的钙调蛋白基因具有响应非生物胁迫的能力,可能在香蕉适应盐、低温和干旱等胁迫逆境中发挥重要作用,参与了香蕉幼苗抗逆性调控.     

蝴蝶兰PhTSJT1基因的克隆及在低温胁迫下的表达分析

本研究从蝴蝶兰叶片中克隆了茎部特异基因Ph TSJT1的全长序列(GenBank登录号为MF797883),并分析了其在不同组织及低温胁迫下的表达特性。结果表明,Ph TSJT1基因全长994 bp,编码239个氨基酸,属于Class-Ⅱ谷氨酰胺酰胺基转移酶超家族成员;同源性分析表明,该蛋白与多种植物的茎部特异蛋白和铝诱导蛋白有较高的同源性,进化上与小兰屿蝴蝶兰的茎部特异蛋白亲缘关系最近;该基因在营养器官中表达水平较高,在花器官中表达水平较低;13℃/8℃(昼/夜)的低温胁迫抑制PhTSJT1基因的转录表达,并随着低温胁迫时间的延长,Ph TSJT1基因的表达水平逐渐降低,在温度恢复正常时其表达水平升高;4℃冷胁迫低温条件下,PhTSJT1基因在处理1 h时,表达水平升高,处理8 h时表达水平最高,16 h后表达水平逐渐降低。由此推测,PhTSJT1参与4℃冷胁迫的分子调控。本研究不但有助于理解热带亚热带植物的耐冷机制,也为蝴蝶兰新品种的遗传改良提供帮助。     

渗透胁迫下脱水蛋白DHN1在猕猴桃细胞中表达及亚细胞分布的动态变化

以绿色荧光蛋白(GFP)为报告分子, 通过构建DHN1-mGFP4融合蛋白表达载体, 研究了渗透胁迫条件下脱水蛋白DHN1的表达及其亚细胞分布的动态变化. 采用PCR方法在脱水蛋白基因dhn1两端引入XbaⅠ和BamHⅠ限制性内切酶位点, 克隆到质粒pBIN-35S mGFP4, 构建DHN1-mGFP4融合蛋白表达载体, 并采用基因枪转化猕猴桃(A. delicisoa)悬浮细胞. 培养10 h后观察到高效表达的GFP绿色荧光, 绿色荧光只出现在细胞核内. 提高培养介质渗透势后, 可以诱导脱水蛋白向细胞质分布(主要集中在质膜周围), 并且增加介质渗透势可以明显缩短细胞质出现绿色荧光的时间. 蛋白合成抑制剂环己亚胺能够抑制细胞质绿色荧光的出现, 暗示细胞质出现的脱水蛋白是诱导产生的结果. ABA可以明显促进细胞质绿色荧光的出现, 并且随着介质渗透势的升高迅速缩短细胞质绿色荧光的出现时间.     

拟南芥等植物的春化分子机理研究进展

春化作用(verna lization)是某些高等植物具备成花能力所必需的,即通过适当长度和强度的冷处理诱导开花抑制蛋白基因沉默,从而使植物具备开花能力.近年来的研究已经表明春化过程中特定抑制蛋白表达沉默的原因部分是由于染色体上特定位点的组氨酸的共价修饰.本文主要介绍春化过程中拟南芥中的FLC基因表达被抑制的分子机理及相关内容.     

aFGF荧光分子探针基因的合成及其表达

通过PCR技术和体外DNA重组技术将绿色荧光蛋白cDNA和酸性成纤维细胞生长因子cDNA构建成融合基因,克隆到表达载体pET3c中,构建成表达菌株BL21(DE3)/pET3c-GAF。经IPTG诱导表达,融合蛋白的表达量占菌体总蛋白的25%;DNA测序结果表明设计合成的融合基因与预期相符。Westernblot结果表明重组蛋白具有aFGF的免疫原性。经IPTG诱导后的菌体及蛋白粗提液在荧光显微镜下可观察到强烈的绿色荧光。融合基因在大肠杆菌中实现了表达,用MTT法测得纯化融合蛋白与野生型aFGF促Blab/c3T3细胞增殖活性相当,为利用绿色荧光分子探针研究aFGF的在活体内的作用机制建立了新的方法。