梓醇对Aβ损伤SH-SY5Y细胞BDNF表达的影响及机制研究

摘要 目的：探讨梓醇对β-淀粉样肽（β-amyloid, Aβ）损伤SH-SY5Y细胞脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor, BDNF）表达的影响及调节BDNF表达的机制。方法：以全反式维甲酸诱导分化的神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y为研究对象，研究梓醇对Aβ 损伤细胞的作用。采用MTT实验测定细胞存活率，ELISA测定BDNF的含量，Western blot检测转录因子cAMP反应元件结合蛋白（cAMP response element binding protein, CREB）及其活化形式磷酸化CREB（pCREB）表达量，RT-PCR测定BDNF mRNA及转录子的表达水平；用RNA干扰的方法阻断CREB表达后，用RT-PCR测定BDNF mRNA表达量的变化。结果：梓醇预保护提高Aβ损伤SH-SY5Y细胞的存活率，显著增加细胞培养上清中BDNF含量和胞内BDNF mRNA水平，促进BDNF转录子IV及其关键调节转录因子pCREB的表达，干扰CREB表达后，梓醇上调BDNF mRNA表达的作用部分消失。结论：梓醇可能通过上调CREB磷酸化促进BDNF的表达，从而发挥神经保护作用。     

阻断NMDA受体可增强皮质酮对海马脑源性神经营养因子表达的抑制:cAMP反应元件结合蛋白的作用

高浓度的皮质酮可引起海马形态与功能的损伤,其中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor,BDNF) 表达的改变在海马形态与功能损伤中扮演重要角色。本实验的目的是观察单次皮下注射皮质酮后海马内BDNF-mRNA、前 体蛋白及成熟型蛋白表达的改变,并观察N-甲基-D-天冬氨酸(N-methyl-D-aspartate NMDA)受体阻滞剂MK801对皮质酮 作用的影响。实验结果显示,单次皮下注射皮质酮2 mg／kg,3 h后海马内BDNF mRNA、前体蛋白及成熟型蛋白的表达 均降低;MK801(0．1 mg／kg)对皮质酮的这一作用有增强效果。单独给予皮质酮或注射MK801 30 min后再给予皮质酮, 均能明显降低海马中cAMP反应元件结合蛋白(cAMP response element binding protein,CREB)的磷酸化水平,MK801与 皮质酮联用时CREB的磷酸化水平降低更为显著(与单独给予皮质酮相比,P<0．05)。实验结果提示,CREB磷酸化水平降 低可能是皮质酮引起海马BDNF表达减少的重要中间环节,阻断NMDA受体可加强皮质酮降低BDNF表达的效应。     

BDNF RNA干扰在多巴胺能PC12细胞凋亡中的作用研究

目的：探讨脑源性神经营养因子（brain derived neurotrophic factor,BDNF）在PC12细胞凋亡中的作用。方法：设计并合成针对BDNF mRNA序列的小片段干扰RNA（siRNA）,利用lipofectamine 2000将siRNA转染入PC12细胞中或给与6-OHDA损伤,给与/不给予BDNF蛋白保护,采用定量PCR和免疫荧光法检测BDNF mRNA和蛋白表达水平;采用上清液乳酸脱氢酶（LDH）释放量测定和流式细胞仪法检测siRNA对细胞凋亡的影响。结果：转染siRNA的细胞的BDNF mRNA的表达量比正常组细胞减少73%,而转染作为对照的scrambled siRNA的细胞的BDNF mRNA的表达没有明显变化。BDNF RNA干扰与6-OHDA神经毒性一样可诱导PC12细胞的LDH释放和细胞凋亡。给予BDNF蛋白保护后细胞毒性减轻。结论：BDNF基因下调可以导致PC12细胞的凋亡,BDNF蛋白对PC12细胞有保护作用,为进一步进行动物体内研究奠定了基础。     

盐酸美金刚联合银杏叶提取物对阿尔茨海默病患者血清BDNF、NGF、DA水平和认知功能的影响

目的:探讨盐酸美金刚联合银杏叶提取物对阿尔茨海默病患者血清脑源性神经营养因子(BDNF)、神经营养因子(NGF)浓度、多巴胺(DA)水平和认知功能的影响。方法:将我院2017年6月至2018年7月收治的92例阿尔茨海默病患者按随机数字表法分为对照组49例和研究组43例,对照组采用盐酸美金刚治疗,研究组在对照组基础上联合银杏叶提取物治疗。比较两组临床疗效,治疗前后血清BDNF、NGF、DA水平、认知功能、简易精神状态检查量表(MMSE)、日常生活能力(ADL)评分的变化和不良反应的发生情况。结果:治疗后,研究组总有效率为90.70%,显著高于对照组(69.39%,P0.05)。治疗前,两组血清BDNF、NGF、DA水平、MMSE和ADL评分比较差异无统计学意义(P0.05);治疗后,两组以上指标均较治疗前显著上升,且研究组以上指标明显高于对照组(P0.05)。两组不良反应总发生率比较差异无统计学意义(P0.05)。结论:盐酸美金刚联合银杏叶提取物可提高阿尔茨海默病的疗效,改善患者认知功能,可能与增加BDNF、NGF、DA的表达有关。     

PTD-BDNF融合基因克隆、表达和纯化

构建含蛋白转导结构域(PTD)与脑源性神经营养因子(BDNF)融合基因的质粒,并在大肠肝菌中表达。用PCR扩增PTD-BDNF融合基因,经DNA测序无误后插入表达质粒pJW2构建质粒pJPB,转化大肠杆菌并进行PTD-BDNF蛋白的诱导表达和纯化。结果DNA序列分析表明构建含有PTD-BDTF融合基因的质粒与设计相同,PTD-BDNF融合蛋白在大肠杆菌中获得表达并进一步纯化。     

ALS转基因小鼠脊髓中miRNA-132表达减少BDNF表达增加

目的研究miRNA-132和脑源性神经营养因子(brain derived neurotrophic factor,BDNF)在肌萎缩侧索硬化症(amyotrophic lateral sclerosis,ALS)转基因小鼠脊髓中的表达变化,探讨miRNA-132、BDNF在ALS发病中的作用。方法取SOD1-G93A ALS转基因鼠发病早期(95d)、中期(108d)和晚期(122d)脊髓组织,应用qRT-PCR及原位杂交(hybridization in situ, ISH)技术检测miRNA-132的表达及定位,应用qRT-PCR及Western blot技术检测BDNF在mRNA及蛋白水平变化,免疫荧光技术检测BDNF在脊髓中的表达及分布,以同窝野生型鼠作为对照。结果与野生型鼠比较,miRNA-132在ALS转基因鼠脊髓组织表达下降,miRNA-132阳性信号主要定位脊髓前角细胞胞体;在ALS转基因鼠脊髓组织BDNF mRNA及蛋白水平均增高,BDNF免疫阳性细胞主要表达于脊髓前角神经元,表达信号明显增强。结论 miRNA-132、BDNF可能在ALS发病过程中发挥了重要作用。     

慢性脑低灌注大鼠海马BDNF的表达与认知功能损害

目的　观察慢性脑低灌注大鼠认知功能损害与海马脑源性神经营养因子 (Brain derivedneurotrophicfactor,BDNF)表达的关系。方法　通过结扎大鼠双侧颈总动脉 ,制成慢性脑低灌注模型 ,分缺血 6周组和 4月组及相应假手术组 ,在相应时间点用三等份MG 2Y型迷宫法测定大鼠学习记忆能力。用免疫组化S P法检测 4组大鼠海马中BDNF的表达 ,在光镜下测其平均光密度。结果　显示手术组与假手术组相比学习记忆能力明显下降 ,慢性脑低灌注大鼠缺血 4月组与缺血 6周组相比学习记忆能力也下降 (P <0 0 5 )。缺血 4月组大鼠海马BDNF表达的平均光密度值与Y型迷宫实验正确次数间存在正相关 (r=0 782 5 ,P <0 0 5 )。结论　表明在慢性脑低灌注状态下 ,大鼠学习记忆能力随海马BDNF表达的下降而下降 ,内源性BDNF可能通过对突触传递和认知功能有内在保护作用。     

腺病毒介导BDNF基因对无血清培养SH-SY5Y细胞的生物学作用研究

目的 :为了有效的将腺病毒介导的脑源性神经营养因子 (BDNF)用于神经损伤的保护治疗。方法 :在体外用BDNF重组腺病毒 (Ad BDNF)对SH SY5Y细胞进行感染 ,在无血清培养条件下对细胞的生长分化进行了形态学的观察 ,利用MTT法检测不同浓度的Ad BDNF对SH SY5Y细胞的促存活作用 ,并对细胞凋亡作用进行了检测。结果和结论 :腺病毒介导的BDNF可有效的促进感染后的SH SY5Y细胞的存活 ,生长和分化 ,并可有效的抑制无血清状态下细胞凋亡的发生     

黄连浸出液对脑缺血大鼠海马区BDNF mRNA表达的影响

为了探究黄连浸出液对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马区脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA表达的影响,本研究随机将50只雄性SD大鼠(240±20) g分为假手术组、模型组、黄连浸出液低剂量(2.5 g/kg)、中剂量(5.0 g/kg)和高剂量(10.0 g/kg)治疗组,采用线栓法建立大鼠局灶性脑缺血(MCAO)模型,假手术组不予线栓处理,术后对大鼠进行神经功能评分。对各治疗组给予灌胃治疗,按照人和大鼠等效剂量关系换算,每只大鼠1d灌胃两次,每次2.5 mL,连续灌胃3d。模型组、假手术组用等量生理盐水灌胃。应用RT-PCR测定了黄连浸出液对局灶性脑缺血再灌注大鼠海马区BDNF表达的影响。与假手术组(BDNF mRNA相对表达量为(0.386±0.011)比较),模型组大鼠海马区BDNF mRNA表达显著增加,相对表达量为(0.458±0.029),差异具有统计学意义(p0.05);与模型组比较,黄连中剂量和高剂量治疗组BDNF mRNA的表达均显著增加,相对表达量分别为(0.622±0.040)和(0.518±0.033),差异均有统计学意义(p0.05);与黄连高剂量组相比,中剂量治疗组差异更为显著(p0.05)。本研究表明,黄连浸出液可促进脑缺血再灌注损伤大鼠海马区BDNF mRNA的表达,改善脑缺血再灌注损伤大鼠的神经功能,保护神经元,黄连浸出液中剂量(5.0 g/kg)作用更为明显。     

GDNF及BDNF对受损运动神经元的长期修复

为了研究胶质细胞源神经营养因子（ＧＤＮＦ） 及脑源神经营养因子（ＢＤＮＦ） 对切断轴突的新生运动神经元的长期维持存活及促进神经再生的作用, 我们选用出生时单侧切断坐骨神经的雏鸡模型, 用裸ＤＮＡ 转染方法, 在损伤神经附近的肌肉中转染ＧＤＮＦ ｃＤＮＡ 和ＢＤＮＦ ｃＤＮＡ 的真核表达载体,观察在体表达的神经营养因子对损伤的修复作用。结果显示,在体表达的ＧＤＮＦ 在８ 周内能使切断坐骨神经的腰脊髓运动神经元近９０ ％ 维持存活。切断的坐骨神经从断端向远体端再生,最长再生达９ ．５ｍ ｍ 。表达两个因子比单独表达ＧＤＮＦ 对运动神经元的存活无显著性差异。而两个因子协同作用对坐骨神经的再生更为有效,坐骨神经再生最长的可达１５ ．４ｍ ｍ 。     

超声波强化提取罗布麻中总黄酮

本研究采用超声波强化提取罗布麻中总黄酮,选择乙醇浓度、超声功率、超声时间、料液比为因素进行正交实验优选出超声提取的最佳工艺条件：即60％浓度乙醇,料液比为1：15,在300W的超声波下超声提取10min,提取率达90％以上。采用超声波提取技术,具有提取效率高、提取时间短、提取温度低的优点。     

提取工艺和植物生长调节剂对罗布麻愈伤组织中黄酮含量的影响

以罗布麻愈伤组织粉末为材,在单因素实验的基础上,利用响应曲面法对罗布麻愈伤组织中黄酮的提取工艺进行优化。响应曲面分析结果表明,提取试剂和提取温度对提取的黄酮含量存在显著影响。通过响应曲面分析得到罗布麻愈伤组织中黄酮提取的最佳条件为:提取试剂为70%甲醇,物料比1∶40,提取时间为4 h,提取温度为70℃。培养并比较了30种不同植物生长调节剂浓度与配比诱导100 d生长的愈伤组织中黄酮的含量,结果得出MB+KT(1.0 mg/L)+NAA(0.2 mg/L)上培养约100 d的愈伤组织中黄酮含量最高,为73.90mg/g。测定愈伤组织培养30 d内黄酮的积累动态,探明从培养的愈伤组织提取黄酮的最佳时段。通过优化提取工艺和筛选最佳植物生长调节剂浓度与配比,运用组织培养技术提高了罗布麻愈伤组织中黄酮含量。     

罗布麻保健茶在境外的研究与利用

罗布麻保健茶在我国已为大众所接受。在日本、欧美国家也逐渐受到重视。现将近年来境外科技工作者对罗布麻茶的研究及罗布麻茶的应用推广情况作了综合性的介绍,供大家参考。以求对我国罗布麻茶的保健价值有进一步的认识。     

纤维植物罗布麻发根的诱导及植株再生

利用3种发根农杆菌(LBA9402.R601,和R1000)转化纤维植物罗布麻无菌种子苗的根茎叶不同外植体部位,首次诱导其生成发根并实现了直接由发根途径的植株再生.罗布麻发根诱导与所用的发根农杆菌菌株,外植体部位及光周期密切相关.发根农杆菌LBA9402感染罗布麻的根外植体,实现了最高转化率达100%.与LBA9402及R601相比,被发根农杆菌R1000感染的根外植体适合在黑暗环境下培养.其诱导生成的发根密度可达平均每个外植体22条.在不加激素的1/2 MS培养基上,LBA9402和R601诱导产生的发根可以诱导生成不定芽,不定芽诱导率达20%.不定芽切下后,在不加激素的1/2 MS培养基上2周内可以诱导生根.通过聚合酶链式反应(PCR)对发根及再生植株进行了鉴定,证明发根农杆菌的T-DNA插入了植物的基因组.为罗布麻的分子育种建立了稳定的转化及再生体系,为下一步通过转入外源基因改善其农艺性状奠定了基础.     

罗布麻愈伤组织诱导及植株再生

以罗布麻(Apocynum venetum L.)当年的成熟种子和5周龄的幼苗叶片为外植体,研究了不同激素组合、暗培养对愈伤组织及植株再生的影响.结果表明,幼苗作外植体诱导愈伤的最佳培养基为添加1.0 mg/L 6-BA 0.2 mg/L IBA的MS培养基;继代培养中1.0 mg/L 6-BA与0.2 mg/L IBA组合愈伤致密而生长迅速,长时间培养硬化的愈伤组织可用添加0.5 mg/L 6-BA和0.1 mg/L IBA培养基和初期暗培养获得大量质地疏松、增殖迅速的愈伤组织;再生苗诱导以0.5 mg/L 6-BA 0.2 mg/L IBA组合为佳;1/2MS附加NAA 0.6 mg/L为适宜的生根培养基,初步建立了罗布麻离体再生体系.     

资源植物罗布麻的愈伤组织诱导和植株再生研究

以罗布麻（Apocynum venetum L.）无菌苗的叶、茎和根作为外植体,在不同激素与浓度组合的MS培养基上进行愈伤组织诱导和植株再生研究。结果表明,在多个激素浓度配比的培养基中,罗布麻叶和茎的愈伤组织诱导率均可达到100%;但进一步将愈伤组织转接到含有不同激素组合的培养基进行不定芽分化时,叶和茎来源的愈伤组织的不定芽分化率有很大不同,茎来源的愈伤组织虽可在多个培养基中有不定芽分化,但最高诱导率仅达20%;而叶片来源的愈伤组织虽仅有4个激素组合培养基中有不定芽的分化,但最高分化率可达到35%。因此,构建罗布麻再生体系的最佳外植体应选择叶片。愈伤组织诱导与不定芽分化的最佳培养基均为：MS＋NAA0.1 mg/L＋6-BA 1.0 mg/L;不定芽在1/2MS＋NAA 0.2 mg/L生根培养基的生根效果最佳,不仅根群质量好,且生根率也高达100%;此再生苗的移栽成活率也最高,在适宜条件下可达75%。     

罗布红麻和罗布白麻生态地理特性探讨

根据文献资料和我们多年的研究,发现罗布红麻和罗布白麻的各地居群具有多样的生态地理特性。通过在陕西关中地区的引种栽培试验,证实了各地罗布红麻和罗布白麻居群生态地理特性的多样性。这对于其引种栽培和开发利用都有极为重要指导意义。     

罗布麻与大花罗布麻种了微结构特征

罗布麻（Ａｐｏｃｙｎｕｍ ｖｅｎｔｒｍ Ｌ．）和大花罗布麻（Ｐｏａｃｙｎｕｍ ｈｅｎｄｅｒｓｏｎｉｉ（Ｈｏｏｋ．ｆ．）Ｗｏｏｄｓｏｎ）分别属于夹竹桃科罗布麻属（Ａｐｏｃｙｎｕｍ Ｌ．）和白麻属（Ｐｏａｃｙｎｕｍ Ｂａｉｌｌ．）。其外部形态区分明显,但种子微结构特征却颇为相似。种子形状、颜色相同,大小相近;种子表面基本纹饰均为网穴状,次级纹饰均为颗粒状。     

山东罗布麻的分布及开发利用

罗布麻是一种野生高级纤维植物,经济价值很高.山东是罗布麻的天然产地,有丰富的罗布麻资源.然而大量的宝贵资源未被开发利用.罗布麻适宜生长在盐碱沙荒地,山东省有大面积的盐碱沙荒地,保护和开发利用罗布麻资源前景广阔.