低温变性下复合PCR技术及其应用

低温变性下复合PCR(co-amplification at lower denaturation temperature-polymerase chain reaction, COLD- PCR)是一种在高丰度野生型序列背景下选择性变性和扩增低丰度突变型序列的方法,可将突变型序列富集10~100倍。基于突变片段Tm值的改变和异源双链DNA分子的形成,COLD-PCR可富集扩增片段中所有类型和位置的突变,也可富集未知突变,具有敏感、特异、精确、廉价和易操作等优点。COLD-PCR及其衍生方法被应用于肿瘤、微生物、产前筛查和动植物等领域,对疾病的早期诊断、病程和治疗监控、药物选择、预后判断和植物育种等均有积极的作用。本文就COLD-PCR的原理、关键技术、衍生方法及其应用进行综述。     

四引物扩增受阻突变体系PCR技术及其在动植物遗传育种研究中的应用

四引物扩增受阻突变体系PCR(Tetra-primer amplification refractory mutation system PCR,Tetra-primer ARMS PCR)技术是一种在普通PCR基础上发展起来的单核苷酸多态性(SNP)分型技术。该项技术综合了扩增受阻突变体系(Amplification refractory mutation system,ARMS)和四引物PCR(tetra-primer PCR)技术的优点,是对等位基因特异性PCR法的改良。它具有操作简便、分型快速、费用低廉等特点,在国内外生命科学领域尤其是遗传育种领域的应用越来越广泛。本文介绍了四引物扩增受阻突变体系PCR的技术原理及优势、结果检测手段和反应体系改进方法,并在此基础上对该技术在遗传育种研究中的应用进行综述。     

线粒体DNA的异质性与检测方法

线粒体DNA的异质性在生物学、医学、法医、生物技术等领域有重要的应用。本文从自然发生(包括体细胞突变、父系渗入和杂交)和人工产生(包括转基因、细胞融合、核移植和转线粒体)两大方面系统地介绍了线粒体DNA异质性的产生机制及其遗传。并介绍了线粒体DNA异质性的检测方法,已知突变位点mtDNA异质性的检测方法有原位PCR技术、PCR-RFLP和实时荧光定量PCR技术,未知突变位点mtDNA异质性的检测方法有长PCR技术、时相温度梯度凝胶电泳(TTGE)和变性高效液相色谱(DHPLC)等。最后对克隆生物中线粒体异质性检测的应用实例作了介绍。     

Real-time PCR技术的应用研究进展

Real-time PCR(RT-PCR)是基于PCR,利用不同的荧光检测定量核酸的技术,广泛应用于基因分型,单核苷酸多态性,等位基因突变检测等方面.综述了RT-PCR作为一种检测技术,在医学、食品、环境微生物等不同领域的应用进展.     

一种SNP检测新方法:四引物扩增受阻突变体系PCR技术

详细介绍四引物扩增受阻突变体系PCR技术的原理和分析方法,并简单介绍其在检测单核苷酸多态性中的应用,为该技术在医学和分子生物学等领域中的推广应用提供理论基础.     

应用创造酶切位点法检测单碱基突变

应用引物错配技术结合单碱基突变位点而配合成一个酶切位点,使之成为可用PCR-RFLP方法分析的突变位点,是对单碱基突变位点进行基因型鉴定的有效而简捷的手段。本文以鸡胞外脂肪酸结合蛋白(Extracelluar fatty acid binding protein,EX-FABP)基因单碱基突变的基因型检测为例,探讨了应用创造酶切位点PCR（Created Restriction Site PCR,CRS-PCR）检测单碱基突变基因型的思路、方法和策略。 Abstract:Created Restriction Site PCR (CRS-PCR) is a simple and efficient method to identify SNP genotypes.One or more mismatch bases are used in a primer to create a restriction site by combining SNP site after PCR.The CRS-PCR products can be genotyped with a way the same as PCR-RFLP.In the study,Extracelluar fatty acid binding protein (EX-FABP)　gene was served as an example for establishing the CRS-PCR method.Strategy of CRS-PCR was also discussed.     

PCR介导的定点诱变

定点诱变（site-directedmutagenesis,SDM）就是指在基因的特定位点引入突变,已广泛应用于基因表达调控、基因结构与功能以及蛋白质性质等诸多研究领域。产生SDM的方法很多,传统的方法一般要求制备单链环状DNA和复杂的亚克隆步骤。然而,运用PCR技术在克隆化基因中导入序列突变则更为方便,已有多种基于PCR的SDM技术,较常采用的主要有四引物和三引物介导的两次PCR方法。一、四引物PCR介导的SDM较早应用于SDM的是四引物PCR,常见的有两种方式[1,2]。最初的方法要求两个侧翼的通用引物和两个反向部分重叠的突变引物[1]。首…     

用改进的重叠延伸PCR技术构建三位点突变载体

目的:改进传统重叠延伸PCR方法,实现引入3个不同DNA突变位点的简便的多位点定点突变。方法:根据前期构建的包含人线粒体12S rRNA(NC 01290)3个热点突变位点的野生型质粒序列,利用Muta Primer 2.0软件设计针对3个热点突变位点的3对互补的定点突变引物,以野生型质粒为模板,结合重叠延伸PCR反应和冷冻析出法,产生同时包含3个突变位点的突变目的片段,酶切后克隆到载体中,测序确证是否突变成功。结果:DNA测序证实3个不同突变位点同时成功引入,定点突变载体构建成功。结论:用改进的重叠延伸PCR技术能简便、高效地获得多位点定点突变载体,在分子生物学领域有较高的使用价值。     

扩增基础上的已知点突变检测进展

在众多导致人类疾病的基因有义突变、病原体亚型以及耐药基因的有义突变中,单碱基突变占了相当大的比例,其检测方法的探索一直是基因诊断研究中的重要课题。本文着重介绍了几种近年发展起来的新技术：反向限制性位点突变分析（iRSM)、荧光PCR（SYBR Green I结合熔解曲线分析技术、荧光共振能量转移（FRET）结合探针熔解曲线分析技术）、基因芯片、等位基因特异性扩增技术（ASPCR）。     

基于专利分析的肿瘤基因PCR诊断技术研究

肿瘤目前成为人类健康和生命的重要危胁,肿瘤基因诊断是对肿瘤的各种原癌基因、抑癌基因进行检测,聚合酶链反应(polymerase chain reaction,PCR)技术是目前临床基因诊断应用最广泛的诊断技术,具有普及率高、特异性好、简便快捷等特点。肿瘤基因PCR诊断技术可以用于已知基因突变的检测,快速了解突变状态,有效制定治疗方案,为肿瘤患者带来福音。本研究主要基于专利数据,对肿瘤基因PCR诊断技术进行分析,探讨了全球与中国在肿瘤基因PCR诊断技术领域的发展现状与趋势。在Innography数据库共检索到PCR技术相关专利16,939件,专利家族6,285件。在肿瘤基因PCR诊断技术领域中,荧光定量PCR技术占比较大,约占肿瘤基因PCR诊断技术总量的三分之一。从技术技术生命周期来看,肿瘤基因PCR诊断技术目前仍处在高速发展阶段。美国是肿瘤基因PCR诊断技术的发展领先国家。该技术的主要来源国为美国,全球42.09%的专利来自美国,同时美国也是同族专利的主要分布地区。在肿瘤基因PCR诊断技术领域,排名前15位的顶尖机构中,来自美国的机构有7所。中国在肿瘤基因PCR诊断技术领域起步较晚,但发展迅速,在该技术领域申请的专利数量仅次于美国。中国申请的肿瘤基因PCR诊断技术的专利绝大多数都只在中国进行专利保护,并没有布局全球市场的意愿。