西尼罗病毒的RT-PCR检测与鉴定

建立西尼罗病毒敏感、特异、快速的RT-PCR检测方法用于实验室诊断和流行病学监测。采用一步RT-PCR和套式PCR法对西尼罗病毒感染的乳鼠脑和细胞培养上清进行扩增,并对扩增产物进行序列测定。两种方法均可分别从两种组织中扩增出与预期大小相一致的片段,套式PCR法比一步RT-PCR法更为敏感,该扩增片段与西尼罗病毒埃及Eg101株相应序列的同源性为99％。     

新城疫液相芯片快速检测方法的建立

目的：建立可检测新城疫病毒（Newcastle disease virus,NDV）的液相芯片快速检测技术。方法：用DNAStar软件对GEN-BANK中NDV的NP基因进行序列分析设计NDV特异性探针并标记生物素,利用该探针与荧光编码微球偶联后与抽提的NDV病毒RNA的RT-PCR产物杂交反应,用液相芯片检测仪（Liquichip 200）检测荧光信号建立了NDV快速液相芯片检测方法。结果：检测结果显示,该法具有较好的特异性,不与H5AIV和H9AIV反应;检测灵敏度达到150个EID50;该法与鸡胚病毒分离法检出NDV的符合率达到97.1%。结论：初步建立了检测NDV的液相芯片技术,为进一步搭建NDV全新快速高通量检测平台奠定了基础,也为其他同类病毒的快速高通量检测提供了借鉴和经验。     

双重荧光定量一步RT-PCR法同时检测GⅠ、GⅡ型诺如病毒

建立一种可同时检测诺如病毒GⅠ和GⅡ型的双重荧光定量一步法RT-PCR方法。应用针对GⅠ型和GⅡ型诺如病毒的特异性引物以及Taqman探针,优化反应体系及条件,建立双重荧光定量一步法RT-PCR方法。对该方法的灵敏度、特异性、重复性进行评估,并对粪便标本进行检测,以传统RT-PCR方法作为参考评价此方法。结果表明,该方法特异性强,与肠道腺病毒、轮状病毒、星状病毒均无交叉反应,对GⅠ和GⅡ型诺如病毒核酸的最低检出限分别可达103拷贝/μL,具有很好的重复性。对100份粪便标本进行检测,诺如病毒的阳性率为31%,其中GⅠ型为3%,GⅡ型为28%,而传统RT-PCR法的检出率为22%。本文建立的双重荧光定量一步RT-PCR法能同时对GI和GII型诺如病毒进行快速检测,其灵敏度高、特异性好,可应用于胃肠炎病人中检测诺如病毒。     

小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测方法的建立

为了研制小反刍兽疫病毒(PPRV)与蓝舌病病毒(BTV)双重荧光RT-PCR快速检测试剂盒,根据GenBank公布的小反刍兽疫病毒、蓝舌病病毒的基因序列,设计两套特异性的引物和探针,建立基于Taqman探针的双重荧光RT-PCR快速检测小反刍兽疫病毒与蓝舌病病毒的方法。实验结果表明,该方法特异性好、灵敏度高,检测最低浓度为10拷贝/μL数量级阳性标准品。通过对临床样品的检测,证实本研究建立的检测方法具有较好的临床应用价值。     

烟草环斑病毒的定量检测技术研究

目的:建立特异、灵敏、快速的TaqMam实时荧光定量PCR方法,用于烟草环斑病毒(TRSV)的定量检测。方法:用纳米磁珠法提取病毒RNA,构建包含烟草环斑病毒全CP序列的质粒标准品。根据CP保守序列设计特异性的引物和TaqMam荧光探针,构建标准曲线,建立TRSV的实时荧光绝对定量PCR方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:建立的方法特异性好,与南芥菜花叶病毒、马铃薯X病毒和马铃薯Y病毒均无交叉反应;至少能检测到767个病毒拷贝,灵敏度比普通PCR高100倍;同一样品试验内及试验间重复性实验的变异系数均小于3%,重复性好;检测结果准确可靠,构建的标准曲线有较好的线性关系(R2=0.997)。结论:建立的TRSV TaqMan实时荧光定量PCR检测方法可满足口岸高通量、快速、准确的检验检疫要求。     

木糖葡萄球菌实时荧光定量PCR检测方法的建立及其应用

目的 本研究拟建立一种灵敏快速的实时荧光定量PCR(real-time quantitative PCR, qPCR)方法,用于检测大、小鼠木糖葡萄球菌(Staphylococcus xylosus,S.xylosus)。方法 本研究选择特异性gehM基因片段作为靶标合成了一套引物,建立了木糖葡萄球菌检测的qPCR方法。对木糖葡萄球菌标准菌株和其他非目标菌进行特异性分析。将木糖葡萄球菌的DNA进行10倍稀释测定其灵敏度。用送检的样本进行了临床应用并测序验证,同时与培养法进行比较。结果 仅木糖葡萄球菌出现特异性扩增曲线,而其他非目标菌未出现,表明设计的引物对木糖葡萄球菌具有特异性,灵敏度为100 fg/μL,组内和组间重复性均小于3%。共检测60份临床样品,有5份样品扩增曲线为典型的S曲线,将该qPCR产物克隆测序并进行同源性比对,该序列与木糖葡萄球菌的同源性为99.63%,表明该样本木糖葡萄球菌核酸阳性,所检测样本阳性率为8.3%,而培养法的阳性率为6.7%,qPCR方法阳性检出率比培养法略高。结论 建立的木糖葡萄球菌qPCR方法,具有快速、灵敏度高、特异性强和重复性好的优点,可用于实...     

李痘病毒实时荧光定量RT-PCR检测方法的建立

目的:建立李痘病毒(PPV)特异、灵敏、快速的实时荧光定量RT-PCR检测方法,用于核果类种苗的健康评测及李痘病毒疫情监测。方法:根据PPV-D株系和PPV-M株系的外被蛋白(CP)基因保守序列,设计特异性引物和TaqMan探针,扩增全长CP基因片段,并将其克隆到pMD18-T载体上,构建质粒标准品,建立PPV的实时荧光定量RT-PCR检测方法,并对该方法的特异性、灵敏度和重复性进行评估。结果:此荧光定量RT-PCR方法对PPV检测呈现高灵敏度和高特异性,与马铃薯Y病毒和马铃薯X病毒无交叉反应,最低检出限可达1.6×102拷贝/μL,标准曲线的相关系数为0.999 18。结论:建立了李痘病毒的荧光定量RT-PCR检测方法,可望应用于检验检疫部门对李痘病毒的快速检测。     

牛病毒性腹泻病毒RT-LAMP检测方法的建立

目的:建立牛病毒性腹泻病毒(BVDv)的环介导体外等温扩增(LAMP)快速检测方法。方法:根据BVDv的5'端非编码区序列,在保守区的8个位点设计LAMP特异性引物(2对特异性引物和1对环引物),对反应条件和试剂浓度进行优化,建立恒温(63.5℃)、快速(65min)的检测方法。结果:建立的方法特异性好,检测其他对照病毒均为阴性;灵敏度高,最低可检测到1个拷贝的阳性质粒,可通过观察浑浊度或加入染料后直接判定扩增结果。结论:建立了用于检测BVDv的LAMP方法,该方法简便、快速、特异性好、灵敏度高,适合基层和现场检测。     

蜜蜂克什米尔病毒实时荧光RT-PCR检测方法的建立和评价

蜜蜂克什米尔病毒(Kashmir bee virus,KBV)是一种高毒力的急性蜜蜂病毒,可以引起蜜蜂的死亡和蜂群崩溃.本研究旨在建立一种灵敏、快速检测KBV的TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法.参照GenBank中polymerase polyprotein有关基因序列,设计一组特异性引物和探针,并通过体外转录法制备RNA标准品作为阳性模板.在对反应体系进行优化的基础上,建立了 KBV的实时荧光RT-PCR检测方法并进行了特异性试验、敏感性试验、重复性试验和临床样本验证.结果显示:该方法能有效扩增8×100拷贝/μL～8×107拷贝/μL 的KBV标准品,建立的标准曲线呈现良好的线性关系.该方法的检测灵敏度为8拷贝/μL,对其他蜜蜂病毒不发生交叉反应,具有很好的特异性;重复性试验结果显示组内和组间的变异系数分别低于1％和2％,重复性良好.应用本研究建立方法与常规RT-PCR方法对样品进行检测,TaqMan实时荧光RT-PCR检测方法的特异性优于常规RT-PCR.本研究建立的实时荧光RT-PCR检测具有良好的敏感性、特异性和重复性,为KBV的检测和流行病学调查提供技术支持.     

埃可病毒9型荧光RT-PCR快速检测方法的建立及应用

为了建立特异、灵敏、快速的荧光定量RT-PCR方法用于检测埃可病毒9型病毒核酸,并初步应用于埃可病毒9型的临床标本检测。根据GenBank登录的埃可病毒9型毒株VP1基因序列,应用生物学软件进行序列比对,在保守区设计特异性引物和TaqMan探针。对反应条件进行优化,验证方法的特异性、灵敏度和重复性,同时对疑似埃可病毒9型病例标本进行检测。该方法对埃可病毒9型的检出有高度特异性,与EV71、CA16、CA24v、CA6、CA10、埃可病毒30型等均无交叉反应,检测灵敏度均达0.1TCID50/mL,可从疑似埃可病例粪便标本中直接检测病毒核酸,检测仅需3~4h。本研究建立的埃可病毒9型TaqMan荧光定量RT-PCR检测方法特异、灵敏,适用于临床早期诊断。     

SARS冠状病毒实时荧光RT-PCR定量检测

为建立一种快速、准确、特异的SARS病毒RNA定量检测方法,根据复合探针荧光定量分析原理,对SARS病毒核酸进行实时荧光定量RT-PCR检测.借助计算机辅助,对SARS病毒基因靶序列以及检测引物和探针进行了优化筛选;利用体外转录SARS病毒RNA靶序列,对RT-PCR反应的镁离子浓度参数进行了优化;比较Trizol法、磁珠法、Qiagen法、煮沸法等4种方法提取RNA的检测效果,建立了样本处理方法;通过对构建的体外转录靶序列模型的检测,对本方法的灵敏度、特异性、定量线性关系、精确度等进行了评价,并通过对42例临床标本的检测对本方法的检测效果进行了评估. 通过克隆SARS病毒核酸靶序列并进行体外转录,获得了长度约1.2 kb的体外转录RNA靶序列;经优化,荧光RT-PCR反应液中的Mg²⁺浓度以4.0 mmol/L为最好;RNA提取方法采用磁珠法效果较好;本方法的检测灵敏度最低可达5个拷贝的体外转录RNA分子,特异性100%,C_t值的CV值小于5%.对临床确诊的42份SARS病人血清和漱口水标本的检测结果表明,该方法的检出率为79%,与荧光抗体检测法的符合率为70%.上述结果表明,该方法建立的荧光定量RT-PCR技术能够快速准确、特异、敏感地对SARS病毒核酸进行定量分析,为临床SARS冠状病毒RNA的检测提供了新的,更为有效的检测方法.     

RT—PCR技术检测呼吸道合胞病毒RNA方法的建立

为了建立一种快速诊断呼吸道合胞病毒（RSV）感染的方法,根据RSVN基因的核苷酸序列,设计合成了一对引物,经RT-PCR扩增,可检出RSVRNA该引物不能检测流感病毒、副流感病毒RNA。应用该法可检出疑为RSV感染的婴幼儿鼻咽分泌物中的病毒RNA且比病毒分离法敏感,特异性与免疫荧光法一致。结果表明RT－PCR法具有快速、敏感、特异的优点,可用于RSV感染患儿的临床诊断。     

诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法的建立

旨在建立诺如病毒RT-PCR-反向斑点杂交检测方法。选取诺如病毒较为保守的RdRp基因作为扩增对象,经RT-PCR扩增后将目的片段克隆到pGEM-T载体中。以重组质粒为模版,选择合成寡核苷酸探针及生物素标记引物。生物素标记引物的扩增产物经热变性后与固定在硝酸纤维素膜上的探针进行杂交反应,经显色后判定结果。出现明显的蓝紫色斑点为诺如病毒阳性,如无斑点则为阴性。对5份临床样品进行检测,并以RT-PCR对比验证。结果显示,利用反向斑点杂交法对重组质粒的检测限为100拷贝/μL,在5例实际样品检测中有1例为阳性,与RT-PCR判定结果一致。建立了诺如病毒的RT-PCR-反向斑点杂交检测方法,该方法特异性好,灵敏度高,操作简便,具有重要的应用价值。     

荧光定量RT-PCR技术快速检测SARS病毒核酸

建立以特异性荧光探针为特点的TaqMan荧光定量RT-PCR方法用于检测严重急性呼吸道综合症病毒(severe acute respiratory syndrome -associate coronavirus,SARS-CoV)核酸.筛选针对SARS病毒基因保守区域设计的引物与TaqMan探针,并对荧光定量RT-PCR反应体系与反应条件进行优化,验证本方法的特异性、敏感度与重复性. 实验结果表明本方法对SARS病毒核酸的检测具有高度特异性,与甲1型、甲3型、乙型流感病毒、禽流感病毒H5N1、麻疹及其他呼吸道病毒均无交叉反应;检测灵敏度达0.1TCID50;从病毒核酸提取至检测完成仅需3h左右,且操作简便,重复性好.本研究建立的TaqMan荧光定量RT-PCR方法特异、敏感、快速,适合于临床实验室进行SARS病毒的早期快速检测.     

H5亚型禽流感病毒一步法RT-PCR检测方法的建立

针对家禽中流行较为广泛、危害相对大的H5亚型禽流感病毒的血凝素（HA）基因,通过分析流感数据库221个HA序列,在保守区内用Oligo6.0软件设计并合成了一对引物,建立了用于快速诊断H5亚型禽流感病毒的一步法RT-PCR方法,其扩增的目的片段大小为372bp。通过对H5亚型禽流感病毒尿囊液和棉拭子浸出液进行不同稀释倍数检测,结果表明病毒尿囊液最低检出量为10-4稀释;阳性棉拭子最低检出量为8倍稀释。用病毒分离和该方法同时检测不同脏器、口咽及泄殖腔棉拭子样品,结果表明该方法检测灵敏度比病毒分离低10～100倍。用该方法检测H1～H15亚型禽流感病毒和鸡新城疫病毒等其他14种禽病病原,仅有H5亚型禽流感病毒扩增出特异性目的条带。该方法具有方便快捷、特异性强、敏感性高等特点,为我国禽流感的快速诊断和分子流行病学调查提供了技术支撑。     

中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA快速检测方法的建立及应用

建立基于重组酶介导的中东呼吸综合征冠状病毒(MERS-CoV)核酸检测方法。本研究设计、合成特异性中东呼吸综合征冠状病毒基因的重组酶介导检测(RAA)引物及探针,制备MERS-CoV假病毒颗粒阳性对照品,通过一系列条件优化建立了MERS-CoV的快速、灵敏、特异的RT-RAA检测方法,分别与荧光定量RT-PCR检测方法做比较,并且采用首例中国MERS-CoV韩国地区输入病例的咽拭子样品、其它类似呼吸道病毒样本以及英国QCMD的MERS-CoV室间质评灭活样本做临床验证。结果显示:建立的RT-RAA方法检测中东呼吸综合征冠状病毒灵敏度为10拷贝,高于本实验室建立的荧光RT-PCR方法灵敏度(100拷贝),且检测时间(4.8～13.6min)大大低于荧光RT-PCR检测时间(90min);用该方法检测中东呼吸综合征冠状假病毒颗粒为阳性,而检测其他8种对照呼吸道病毒均呈阴性;检测临床阳性样本也与实际结果相符。本研究建立的中东呼吸综合征冠状病毒RT-RAA检测方法灵敏、特异、快速,可用于中东呼吸综合征冠状病毒感染的现场快速诊断和流行病学调查。     

TaqMan实时荧光定量RT-PCR检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的研究

目的：建立一种快速定量检测甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量的实时荧光定量RT-PCR方法。方法对Gen-Bank中登陆的甲型肝炎减毒活疫苗株（ L-A-1）和其他甲型肝炎病毒基因组全序列比较分析,根据其高度保守的5′端非编码区设计针对甲型肝炎减毒活疫苗株特异性引物与探针,对荧光定量RT-PCR反应条件进行优化,检测该方法的特异性和灵敏性,并对甲型肝炎减毒活疫苗病毒含量进行定量检测。结果该方法对甲型肝炎减毒活疫苗株高度特异,扩增片段为207 bp,不与其他肠道病毒发生非特异性反应。在104 CCID50/管～10-1 CCID50/管之间有良好的扩增曲线,检测的灵敏度可达0．1CCID50～0．01CCID50,比普通RT-PCR高100倍。结论该方法具有快速、灵敏、特异、重复性好等优点,可应用于甲型肝炎减毒活疫苗生产过程中病毒含量滴度测定及指导疫苗成品的配制。     

双重荧光RPA扩增方法快速鉴别两种血清型水泡性口炎病毒

本研究利用重组酶聚合酶扩增(RPA)技术,根据水泡性口炎病毒印第安纳型(VSV-IND)和新泽西型(VSVNJ)相对保守的L基因为靶序列设计并筛选出两套特异性的引物和探针,建立了快速鉴别检测水泡性口炎病毒两种血清型的双重荧光RT-RPA方法。试验结果表明,该方法特异性强,与猪水泡病病毒(SVDV)、口蹄疫病毒(FMDV)、蓝舌病病毒(BTV)、猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)、牛病毒性腹泻病毒(BVDV)、猪瘟病毒(CSFV)等灭活抗原核酸无交叉反应;灵敏度高,最低可检测核酸浓度为12.7fg/μL;简便快速,反应时间短(15min),且重复性好。利用所建立方法对124份临床样品进行检测,结果与双重荧光RT-PCR一致。本文为VSV-IND和VSV-NJ的快速鉴别检测提供一种新方法,尤其适合现场检疫或基层实验室的快速检测。     

Hendra病毒一步法Real-time RT-PCR检测方法的建立

目的 建立针对Hendra病毒N基因的一步法Real-time RT-PCR检测方法,用于Hendra病毒感染样本的快速检测和准确定量.方法 针对Hendra病毒的保守基因N设计引物和探针,构建体外转录的RNA片段作为标准品,建立一步法Real-time RT-PCR反应方法并分析敏感性和特异性.结果 所设计的引物经Blast检索可以用于检测所有已知的Hendra病毒株.本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法可以特异性检测出Hendra病毒,不与Nipah病毒产生交叉反应.检测灵敏度为2.6×100～2.6×101copies/μl.标准曲线的线性范围为2.6×101～2.6×107copies/μl.结论 本研究建立的一步法Real-time RT-PCR方法敏感性和特异性较高,且不易出现污染引起的假阳性结果,适合用于Hendra病毒感染样本的检测.