HIV-1融合蛋白MA4-CA在大肠杆菌中的高效表达

将HIV-1MA4-CA融合基因克隆到高效表达载体pBV220中,将该重组表达载体转化大肠杆菌BL21,进行诱导表达。收集细菌,菌体裂解后进行SDS—PAGE检测。结果表明,成功地构建了含MA4-CA融合基因的表达载体pBV220-MA4-CA,该载体能在大肠杆菌中表达相对分子质量为16000并以包涵体形式存在的融合蛋白,此蛋白经洗涤后能够溶于8mol／L的尿素中。利用硫酸铵沉淀法进行初步纯化后即可得到纯度比较高的MA4-CA融合蛋白,为今后进一步的功能和应用研究打下了良好的基础。     

IL-1ra-Fce融合基因的克隆、表达及鉴定

白细胞介素-1与免疫球蛋白E在过敏性哮喘发病中发挥着重要作用。本试验克隆了白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)及IgE分子恒定区cDNA片段, 构建了融合基因原核表达载体IL-1ra-Fce/pBV220。将其转化大肠杆菌BL21(DE3), 实现了融合蛋白的高效表达, Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白, 主要以包涵体形式存在; 利用分子筛和阳离子交换层析对表达产物经进行了纯化, 纯化的包涵体复性后经体外功能试验表明, 融合蛋白的活性与IL-1ra没有显著性差异; 初步药代动力学分析显示IL-1ra-Fce半衰期比IL-1ra延长了4.78倍。     

高效原核表达载体pBV220的改造与应用

以高效原核表达载体 pBV220为骨架载体,应用单链寡核苷酸引物插入法在pBV220多克隆位点的下游插入了六聚组氨酸融合标签编码序列(6×His-Tag)、羟胺和凝血酶蛋白切割位点, 并增加了Xho I和Kpn I酶切位点和强终止密码子TAA, 将此新质粒命名为 pBV223。以此载体表达的目的蛋白在羧基端(C端)带有六聚组氨酸尾以利于通过固定化金属亲和层析快速纯化目的蛋白, 酶切及核苷酸序列分析验证了我们的设计。将终止密码缺失突变的nm23-H1 cDNA克隆入pBV223载体中, 在大肠杆菌DH5a中成功地表达了Nm23-H1蛋白, 通过镍(Ni)亲和层析一步即简单、快速地得到了纯化蛋白。我们所应用的单链寡核苷酸引物插入直接进行定向克隆的方法是目前为止最简便的方法。     

人血清Q型对氧磷酶在大肠杆菌中的表达

目的:应用大肠杆菌原核表达系统高效表达人血清Q型对氧磷酶(PON1)。方法:从pBlueScript-PON1重组质粒中通过PCR扩增得到了人PON1基因,将其亚克隆至原核表达载体pBV220中,构建了重组表达质粒pBV220-PON1,转化大肠杆菌,获得表达菌株。结果:rhPON1重组蛋白以不溶形式存在于包涵体中。凝胶扫描分析表明,重组蛋白表达量约占菌体总蛋白的18%。包涵体经分离、变性、复性等步骤处理后,产物未显示酶活性。结论:原核表达的rhPON1以包涵体形式存在,实现了人PON1在大肠杆菌中的高效表达。     

ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS, 经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6 mol/L的盐酸胍溶解包涵体后, 通过Ni2+-NTA柱纯化, 获得纯化的目标融合蛋白, 电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度可达90%以上。Western blotting检测显示, 表达产物有较强的免疫学活性。经肠激酶作用后得到proNGF非融合蛋白, 分子量为27 kD, 100 mL表达菌液可获得13.1 mg proNGF蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白重折叠, 复性率为18%, 在重折叠过程中前导肽发挥了一定的积极作用。用PC12细胞进行生物活性鉴定, 结果显示复性后的proNGF蛋白具有良好的生物活性。     

ProNGF在大肠杆菌中的表达、纯化和复性

将含有前导肽的人神经生长因子基因(proNGF)克隆在原核表达载体pET15b中, 转化大肠杆菌BL21(DE3)pLysS, 经IPTG诱导实现了目标融合蛋白的高效表达。SDS-PAGE分析表明表达蛋白占全菌总蛋白的20%左右, 表达蛋白主要以包涵体的形式存在。用6 mol/L的盐酸胍溶解包涵体后, 通过Ni2+-NTA柱纯化, 获得纯化的目标融合蛋白, 电泳谱带扫描分析表明蛋白纯度可达90%以上。Western blotting检测显示, 表达产物有较强的免疫学活性。经肠激酶作用后得到proNGF非融合蛋白, 分子量为27 kD, 100 mL表达菌液可获得13.1 mg proNGF蛋白。用透析复性的方法将目的蛋白重折叠, 复性率为18%, 在重折叠过程中前导肽发挥了一定的积极作用。用PC12细胞进行生物活性鉴定, 结果显示复性后的proNGF蛋白具有良好的生物活性。     

胸腺素a1／干扰素a-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛m1基因,与含,IFNa-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建％1／IFNar-2b融合基因重组质粒pUCl8-Ta1／IFN,经序列分析证实,融合基因m1和,INFa-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100％和98．5％,仅IFNa-2b有两处碱基发生无义突变．再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Ta1／IFN,转化到EcoliM15经IPTG诱导,实现了Ta1-1FNa-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24．5％,为包涵体形式．这为研制Ta1—IFNa-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础．     

鹅细小病毒vp2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备

根据鹅细小病毒(Gooseparvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖。筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用NcoI酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp25’端969bp片段的原核表达载体。经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体。薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%。包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体。Westernblot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性。     

精氨酸脱亚氨酶的表达、纯化和活性研究

目的：建立精氨酸脱亚氨酶的高效表达菌种和纯化工艺路线。方法：人工合成编码支原体精氨酸脱亚氨酶（arginine deiminase, ADI）的基因,构建pBV220-ADI原核表达载体,转染大肠杆菌DH5α中并诱导表达目的蛋白,离子交换层析和分子筛层析法纯化目标蛋白。采用体外精氨酸降解试验测定纯化产物活性。结果：成功构建了原核表达载体pBV220-ADI,基因侧序正确。转化大肠杆菌DH5α后筛选到高水平表达目的蛋白的菌株,目标蛋白以包含体形式存在于胞浆内,表达水平超过全菌体蛋白的35%。采用盐酸胍溶解包含体、低温条件下稀释和透析的方法进行复性。顺次采用阳离子交换和凝胶过滤层析对复性液进行纯化,最终获得纯度达到95%的活性产物。活性测定表明,纯化的ADI比活性为80IU/mg。结论：成功构建了ADI的高效表达菌种,建立了目标物质的分离纯化方法。     

鹅细小病毒vp2基因片段在原核系统中的表达及多克隆抗体的制备

根据鹅细小病毒(Goose parvovirus,GPV)中国分离株HG5/82基因序列,设计引物,利用PCR技术扩增出HG5/82株vp2基因,将其克隆到pMD18-T载体后,转化入感受态细胞TG1中增殖.筛选阳性质粒,将其与原核表达载体pPROEXTMHTb分别用Nco Ⅰ酶切后回收目的片断,进行定向连接,产物转化入感受态DH5α,重组质粒经酶切和测序证实目的基因正确克隆到表达载体的预期位点且插入方向正确,构建了含有HG5/82主要结构基因vp2 5'端969bp片段的原核表达载体.经IPTG诱导后表达出与预期大小相符的约36kDa的融合蛋白,表达形式为包涵体.薄层扫描结果表明表达产物约占菌体总蛋白的21.4%.包涵体通过6mol/L盐酸胍裂解后,利用镍离子亲和树脂进行纯化,用纯化的分子量为36kDa的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备兔抗鹅细小病毒部分结构蛋白多克隆抗体.Western blot分析表明该多克隆抗体与HG5/82毒株具有反应性,说明该融合蛋白具有抗原性.     

重组人载脂蛋白AI米兰变体在大肠杆菌中的高效表达

通过大肠杆菌表达系统来生产重组人载脂蛋白AIM(proapolipoprote in AIM,proapoAIM)。整个proapo AIM基因被分成两个片断,通过RT-PCR的方法合成。在对该基因的上游部分进行改造后,插入到表达载体pBV220中进行表达。蛋白的表达量达到45%左右,蛋白的表达形式为包涵体。包涵体通过疏水柱进行柱上复性,复性后的蛋白具有良好的生物活性。     

人干扰素和脑啡肽融合蛋白的表达和生物学活性

以INFα-m基因为模版,采用overlapping PCR技术构建甲硫氨酸脑啡肽干扰素表达质粒pBV220/Enk-/Met-INFα-m,转化大肠杆菌DH5α表达,产物以包涵体形式存在.包涵体经分离、变性、复性,然后经CM-Sepharose-FF、DEAE-Sepharose-FF离子交换层析和Sephacryal-HR100分子筛纯化,获得较纯的Enk-IFNα-m融合蛋白.生物活性检测表明,融合蛋白不仅具有干扰素的抗病毒、抗增殖、增强NK细胞功能的活性,而且具有脑啡肽的脑内镇痛作用.     

HIV-1Gag蛋白在大肠杆菌和重组杆状病毒系统中的高效表达及通用型温控原核表达载体的构建

将中国株HIV－1B亚型的gag全基因序列,克隆到杆状病毒表达载体pfastbacI中,构建了重组质粒pfastGag,利用细菌／杆状病毒表达系统筛选重组杆状病毒,在昆虫细胞中高效表达了HIV－1Gag蛋白。通过改造原核表达载体pBV220和pET28,构建了一种新的通用型温控原核表达载体质粒pVV5,该载体携带PrPl串联温控启功子及His—Tag纯化标签,利于目的蛋白表达与纯化。将HIV－1gag基因的1148一1857编码序列,分别插入到pVV5b、pET28b的相应位点,构建了重组表达质粒pEG1b、pEG7b,二者在不同受体菌中,表达重组蛋白的量分别占全菌体蛋白总量的42％和28％。利用IMAC金属螯合层析柱,对包涵体中的重组p24蛋白进行纯化,纯度超过80％;纯化后的重组蛋白可与HIV－1型标准阳性血清发生较强的免疫学反应。     

胸腺素α1/干扰素α-2b融合基因表达载体的构建与表达

通过PCR人工合成模板的方法获得牛Tα1基因,与含IFNα-2b基因的pAG-IFN重组质粒,构建Tα1/IFNα-2b融合基因重组质粒pUC18-Tα1/IFN,经序列分析证实,融合基因Tα1和IFNα-2b与GenBank登录基因的序列一致性分别为100%和98.5%,仅IFNα-2b有两处碱基发生无义突变.再将融合基因亚克隆入pBV220,构建融合表达载体pBV220-Tα1/IFN,转化到E.coli M15经IPTG诱导,实现了Tα1-IFNα-2b融合蛋白的高表达,约占菌体总蛋白的24.5%,为包涵体形式.这为研制Tα1-IFNα-2b双重活性的融合蛋白奠定了基础.     

重组人融合基因Nm23-H1/HbFGF的构建及其在大肠杆菌中表达的研究

根据Nm23-H1与HbFGF cDNA序列,人工合成一段中间核酸序列,将它分别与Nm23-H1 cDNA的上游引物及HbFGF cDNA的下游引物组成两对引物,通过PCR(聚合酶链式反应)构建出融合基因Nm23-H1/HbFGF,将其定向克隆于质粒载体pBV220上,经诱导,SDS-PAGE分析,表达产物分子量为34kD,表达量占菌体总蛋白的14%,表达产物以包涵体形式存在,ELISA和Western印迹表明包涵体具有Nm23-H1和HbFGF抗原性,然后对包涵体进行变性、复性及纯化处理,取纯化产物进行定性和生物活性分析,结果证明纯化产物具有Nm23-H1和HbFGF的抗原性及生物活性。以上实验为今后进一步研究融合基因Nm23-H1/HbFGF在真核细胞中的抑癌、致癌性质打下了基础。     

天蚕素A-蜂毒素杂合肽用pBV220载体的表达、纯化和活性测定

为提高抗菌肽的表达,在抗菌肽的N端融合了1段酸性小肽以中和表达产物对宿主的毒性;并将融合肽基因同向串连成多拷贝,在大肠杆菌中获得了较高的表达。用化学合成法分别合成了编码天蚕素A(1-8)-蜂毒素(1-10)杂合肽和酸性小肽的DNA片段,首先将其拼接成融合肽的完整基因,然后通过前后接头将融合肽基因连接成两侧具有EcoRI和SalI酶切位点的同向串连的多拷贝基因。将5份拷贝的基因克隆至pBV220表达载体,转化E.coliDH5α,温度诱导得到表达量为35%的融合蛋白。表达产物主要以包涵体形式存在,将包涵体溶解,经Ni²⁺-NTA琼脂糖亲和层析获得纯化的融合蛋白。融合蛋白再经CNBr切割和阳离子交换层析,得到纯化的抗菌肽,经蛋白质N端测序确认序列正确。琼脂糖扩散法和液相测定法证明了纯化的抗菌肽具有抗菌活性。     

人Artemin cDNA扩增及表达

以人胎脑RNA为模板, 采用RT-PCR技术扩增人Artemin cDNA。序列分析表明, 扩增的人Artemin cDNA核苷酸序列与已发表序列(GenBank登录号：AF115765)同源性为99.7%, 氨基酸序列同源性为100%。将经过序列分析确定的Artemin cDNA插入原核表达载体pGEX-6p-1中, 构建重组表达载体pGEX-6p-1-hART。通过SDS-PAGE分析重组人Artemin融合蛋白在大肠杆菌中的表达情况。结果表明, 重组人Artemin融合蛋白表达量约占宿主菌总蛋白的18.32%, 主要以包涵体形式存在。对表达的重组人Artemin融合蛋白包涵体进行溶解和复性, 并进行Western blotting分析。说明体外成功扩增人Artemin cDNA, 并在原核表达系统中高效表达了重组人Artemin融合蛋白。     

SARS病毒核衣壳蛋白、膜蛋白在大肠杆菌中的高效表达和纯化

通过反转录PCR获得了SARS冠状病毒核衣壳蛋白(N)和膜蛋白(M)基因,其序列分析结果与加拿大多伦多株完全一致。将M基因和N基因克隆到大肠杆菌表达载体pET22b和pBV222上,并在大肠杆菌中以包涵体及可溶形式获得高效表达。通过离子交换、金属螯合层析纯化获得电泳纯制品。所获得的核衣壳蛋白具有良好的抗原性,可用于抗SARS抗体检测及亚单位疫苗研究。     

IL-Ira-Fcε融合基因的克隆、表达及鉴定

白细胞介素-1与免疫球蛋白E在过敏性哮喘发病中发挥着重要作用.本试验克隆了白细胞介素-1受体拮抗剂(IL-1ra)及IgE分子恒定区cDNA片段,构建了融合基因原核表达载体IL-1ra-Fcg/pV220.将其转化大肠杆菌BL21(DE3),实现了融合蛋白的高效表达,Western blotting结果表明表达蛋白为目的融合蛋白,主要以包涵体形式存在;利用分子筛和阳离子交换层析对表达产物经进行了纯化,纯化的包涵体复性后经体外功能试验表明,融合蛋白的活性与IL-1ra没有显著性差异;初步药代动力学分析显示IL-1ra-FeE半衰期比IL-1ra延长了4.78倍.     

犬α干扰素基因的高效表达及其活性测定

以伴刀豆球蛋白A(ConA)诱导的犬外周血淋巴细胞中提取的总RNA为模板,通过RT-PCR的方法克隆扩增出犬α干扰素基因,将所扩增基因克隆于原核表达载体pBV220并进行测序,结果显示该基因与GenBank上所公布的犬α干扰素基因同源性为100%.将重组表达载体转入宿主菌进行温敏诱导表达,表达产物经SDS-PAGE分析,证明目的蛋白以包涵体的形式存在,大小约为19kDa.将表达产物变性、复性、透析、纯化处理后加入犬肾细胞上,用水泡性口炎病毒攻毒,测出重组的CaIFN-α具有较高的抗病毒作用,生物活性达到5.11×10 6∪/㎎,重组蛋白质的含量约为13㎎/L.