3T3细胞饲养层培养人表皮细胞最适密度研究

本文分别以五种不同浓度的表皮细胞和四种密度的3T3细胞饲养层做了混合培养观察。接种前3T3细胞先行~(60)Co,60Gy放射。培养的表皮膜片均做了大体染色,组织切片和电镜观察。不同培养时间的表皮细胞还分别进行了DNA合成。~3H-TdR掺入标记测定。结果证实表皮细胞与3T3细胞最佳混合接种比例为1:1。最适细胞接种量为5×10~4/cm~2。在此条件下表皮细胞生长最快,15天形成膜片。而且饲养层培养表皮细胞接种量少,表皮面积扩大倍数大。为此我们认为饲养层培养是表皮细胞培养的最好方法之一。     

大鼠表皮细胞的体外培养及纯化方法

根据表皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶敏感性、贴壁时间及要求不同的,采用胰蛋白酶消化法和反复贴壁法相结合,能有效清除成纤维细胞的混合生长,获得纯化的表皮细胞。本方法经济、简便、实用。     

外周血树突状细胞的体外培养

本文用塑料贴壁的外周血单个核细胞(PBMNCs)在含自体血浆、rhGM-CSF、rhIL-4和TNFα的RPMI1640培养基,37℃,5%CO2湿化空气培养树突状细胞(DCs).经10天培养,可获得大量具DCs形态学特征的细胞,其有很强的刺激同种淋巴细胞增殖功能,约30%的细胞表达HLA-DR和CD1a.健康志愿者每1×107PBMNCs可收获细胞约5×105.本文培养方法产率高,培养体系简单,用自体血浆代替小牛血清,培养过程简便,这些均适应临床治疗要求.     

人表皮细胞分离培养的研究

目的探索来源于人的表皮细胞的分离培养方法,为其进一步作为皮肤组织工程中的种子细胞或临床应用奠定前期研究基础。方法取3~9岁健康儿童包皮环切术后包皮,经分离酶处理分离真表皮,再将表皮以胰蛋白酶消化为细胞悬液,分别接种于有血清培养基DMEM和无血清培养基K-SFM中进行细胞培养,观察表皮细胞生长融合情况及克隆形成率。结果表皮细胞在DMEM和K-SFM培养液中均能融合成片,但在K-SFM中的融合成片时间明显短于在DMEM中所需时间;在K-SFM中2周时克隆形成率显著高于在DMEM中的克隆形成率。结论两步酶法分离表皮细胞接种于K-SFM中培养,是一种简便有效的表皮细胞分离培养方法。     

体外培养细胞的加力实验装置

机械力对细胞生物学行为的影响是目前细胞生物学和细胞力学研究的一个重要课题。体外分离细胞和加载培养技术是细胞力学的基础之一和目前细胞力学研究的重要方法。大致可分为离心力加载、流体加载、单细胞加载、压力传导加载和基底形变加载技术。     

CIK细胞的体外培养与细胞毒作用

CIK（cytokine-induced killer）细胞在体外可以快速扩增,具有高效的非MHC限制性杀瘤活性,被认为是抗肿瘤过继细胞免疫治疗的新希望。随着细胞操作及基因修饰技术的日益精进,人们正逐渐改进CIK细胞的体外培养和处理方法,以便进一步提高CIK细胞的增殖率及特异杀伤力,使其更好地应用于临床。     

丙型肝炎病毒感染的体外培养细胞的抗原表达

建立丙型肝炎病毒（HCV）体外感染细胞模型,观察其感染细胞的HCV抗原表达,用抗HCV抗体和HCVRNA阳性及阴性血清感染MOLT-4细胞,制备细胞片进行免疫酶染色。结果显示HCV感染MOLT-4细胞4天和阴性对照HCV抗原均为阴性;感染后7天胞浆内可见HCV抗原阳性免疫反应产物;15天阳性细胞达到高峰,43天仍可见少量阳性细胞。结果表明HCV体外感染MOLT-4细胞胞浆内观察到HCV抗原表达。     

介绍一种新的表皮细胞传代方法

我们设计了一种新的传代方法,在传代之前,先用 DispaseⅡ酶,将培养的表皮细胞片整个消化下来,再用0.25—0.3%胰酶冷消化将表皮细胞驱散,进行1:2传代获得成功,传代59次成功率为71.2%。若在培养后7—16天传代,成功率可达80%。本文讨论了此种传代方法比单纯用胰蛋白酶或用胰蛋白酶和EDTA 混合传代方法优越。     

体外培养的绒毛细胞中普通脆点的研究

体外培养绒毛细胞,用缺叶酸培养基或在培养基中加入大量鸟苷或胸苷,造成脱氧核苷酸库的不平衡,导致染色体断裂和普通脆点的表达。大量鸟苷对普通脆点的诱导作用较强,而大量胸苷的作用则稍缓和。大量鸟苷与缺叶酸培养基合并使用时,诱导作用减弱,其可能原因是:缺乏叶酸使鸟苷生成受阻,脱氧核苷酸库的不平衡状态减轻。     

人皮肤表皮干细胞体外培养与应用研究进展

人皮肤表皮干细胞是具有无限增殖潜能以及多向分化能力的专能干细胞,广泛存在于表皮基底层以及毛囊隆突部位。目前,表皮干细胞在分离、纯化、培养等领域都取得了一定进展。表皮干细胞的应用主要在皮肤创面的修复、组织工程皮肤的构建以及基因治疗等领域。本文从干细胞的来源、分离、纯化鉴定、培养与应用等方面进行综述。     

小鼠胚胎干细胞的培养

ＥＳ细胞的培养应满足促进细胞增殖和抑制细胞分化而保持其高度未分化潜能。我们用胚胎成纤维细胞作为饲养层,培养基ＤＭＥＭ中加白血病抑制因子的方法来培养ＥＳ细胞。培养的ＥＳ细胞呈集落状生长,细胞排列紧密,呈未分化状态。胚胎成纤维细胞作为饲养层是分离培养ＥＳ细胞最普遍使用而且有效的方法。本文还围绕ＥＳ细胞培养中的促进增殖和抑制分化这两个方面的影响因素进行了讨论。     

EGF体外诱导骨髓基质干细胞增殖分化为成纤维细胞的实验研究

目的:研究表皮生长因子(EGF)在体外诱导兔骨髓基质干细胞(BMSCs)向成纤维细胞增殖分化,为韧带组织工程种子细胞提供可能的来源。方法:以EGF对体外培养的BMsCs进行诱导分化培养,相差显微镜观察细胞生长,MTT检测细胞的增殖,免疫组化半定量细胞的分化。结果:诱导后7d、14d时,诱导组呈现更均一的纤维细胞样的带有长突起的纺锤形细胞,呈束状排列,并且具有更高的细胞密度;诱导组在7d、14d细胞增殖均比对照组快;第10d时,诱导组、对照组胶原Ⅰ、Ⅲ染色均为阳性,但诱导组有更高的染色密度;诱导组、对照组胶原Ⅱ染色阴性。结论:BMSCs经。EGF。诱导后细胞增殖,并且能刺激细胞外基质的表达,基本符合肌腱和韧带组织工程的要求。     

鸡胚胎原始生殖细胞体外培养

以14-15期鸡胚血液为材料,采用Ficoll密度梯度离心方法,提取鸡胚胎原始生殖细胞(primordial germ cells,PGCs),在无基质细胞和基质细胞上分别进行体外培养。从实验结果可以看出：在含有胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)、鸡血清(chicken serum,CS)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、人胰岛素样生长因子(hIGF-1)、小鼠白血病抑制因子(mLIF)和青,链霉素双抗的M199培养液中培养时,鸡PGCs最多能够存活4天：当采用细胞因子和5天鸡胚胎性腺基质细胞共培养时能存活23代且每代细胞增殖可达近10倍。提纯后的PGCs细胞冻存复苏后,经台盼蓝染色鉴定存活率可达80％左右。     

小鼠胚胎体外培养条件的研究

为了探讨小鼠胚胎在体外发育过程中的最佳方案,我们将从超排昆明小鼠取出的５４３枚受精卵经过不同的培养液（Ｍ１６、Ｍ１６＋ＯＥＣ、Ｇｌｕ－ＦｒｅｅＭ１６和Ｇｌｕ－ＦｒｅｅＭ１６＋ＯＥＣ）及不同的培养微环境处理后,观察胚胎体外发育的过程。结果表明,葡萄糖在胚胎发育早期（２细胞期）有比较明显的发育阻断作用,同种输卵管上皮（ＯＥＣ）共同培养能够有效地抑制这种阻断作用;葡萄糖对胚胎８－１６细胞期及以后阶段的发育具有十分重要的作用,而此时ＯＥＣ的作用则不明显;除了葡萄糖外,在早期可能还有其它一些象磷酸盐、重金属离子的物质也能起胚胎发育阻断作用。同时还发现培养微环境的稳定也是胚胎发育的重要保证条件,石蜡油的封盖能够保持某种特定微环境而支持胚胎的体外发育。     

小鼠原核期受精卵体外培养系统的筛选

为了筛选出最佳的小鼠原核期受精卵的体外发育培养系统,分别进行了四个试验。试验I:在体外分别用自配的M16、mM16、KSOM、mKSOM、CZB进行体外发育培养,进而筛选出一种最佳的体外培养系统;试验Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ分别:探讨了血清、PVA、rhLIF对小鼠胚胎发育的影响。结果,试验I中胚胎发育到2-细胞的比率差异不明显,但是在mM16和mKSOM中,发育到4-细胞的比率94.7%,90.7%(91/96;78/86)和发育到桑椹胚/囊胚的比率分别为78.1%,67.4%(75/96;58/86)均明显高于其他三种培养液;试验II用10?S代替M16中BSA时,胚胎的发育率均下降,即使在mM16中桑椹胚/囊胚率仅为4.8%(12/35)与对照组M16(40.5%)差异显著(p<0.05);试验Ⅲ用PVA取代mM16和mKSOM中的BSA其体外发育率显著下降,胚胎均无一例发育到桑椹胚/囊胚;试验Ⅳ:rhLIF能提高胚胎在体外的发育率可使mM16培养的胚胎囊胚率、囊胚脱出率分别达到84%(47/56)、39.2%(22/56)。结论:在不添减其他成分前提下,只在M16中添加0.1mMolEDTA、0.5mMol牛磺酸、1000IU/mlrhLIF便可获得84%的囊胚率,同时证明在M16或mM16添加血清都会降低其体外发育率;PVA还不能有效的取代mM16、mKSOM中的血清。     

牛睾丸支持细胞分离、纯化及体外生长行为的研究

了解牛睾丸支持细胞体外培养的生物学特性,试验采用组合酶消化和选择贴壁法,将5月龄、6月龄牛胎儿及新生牛睾丸支持细胞分离纯化后进行体外培养。试验结果显示,这一阶段牛睾丸适宜支持细胞分离纯化用;采用0.25 %胰蛋白酶+0.02 %EDTA二次消化法是一种经济有效的牛胎儿睾丸支持细胞分离方案;试验发现,牛胎儿睾丸支持细胞体外研究时间应控制在3天～20天内,处于对数生长期的牛胎儿睾丸支持细胞,对牛体外受精卵体外发育有明显的促进作用。     

牛视网膜微血管内皮细胞体外分离与培养的实验研究

目的:探讨牛视网膜微血管内皮细胞(bovine retinal capillary endothelial cells,BREcs)体外分离、培养方法,为研究视网膜血管性疾病提供一定的实验基础。方法:无菌条件下取出视网膜并剪碎,经筛网过滤、胶原酶消化获取视网膜微血管内皮细胞,接种于明胶包被的培养瓶中,原代培养时用不同的培养基筛选细胞,并在传代时利用差速黏附法以获得较纯BRECs,通过形态学观察和免疫组化方法鉴定BRECs。结果:用此法原代培养BRECs纯度达98%,混有的血细胞及神经组织细胞碎片在换液和传代过程中逐渐被去除,成纤维细胞和周细胞的污染可分别用不同的培养基和差速黏附法纯化去除。结论:该方法简单有效,获得的BRECs纯度高,生长状态良好,为研究眼部血管性疾病提供良好平台。     

培养人皮下脂肪干细胞纵向分化的实验研究

目的:建立人脂肪干细胞(adipose-derived stem cells,ADSCs)分离、培养的方法,观察其生物学特性,探讨其纵向分化的能力.方法:自皮下脂肪组织获得梭形细胞,观察细胞生物学特征,免疫组化鉴定波形蛋白和CD44.以含有胰岛素、地塞米松、1.甲基-3-异丁基-黄嘌呤的无血清混合培养基诱导其向脂肪细胞纵向分化,以细胞形态学变化.油红O染色和测定甘油磷酸脱氢酶活性判定分化是否成功.结果:人皮下脂肪中能够分离培养出生长旺盛的脂肪干细胞,诱导培养7d后细胞由梭形逐渐变圆,胞质内出现脂滴后逐渐增多融合为脂泡,并与甘油磷酸脱氢酶活性变化相吻合.油红O染色显示约(78.6±2.2)%细胞转变为脂肪细胞.结论:人皮下脂肪中分离的脂肪干细胞在体外诱导条件下能纵向分化为脂肪细胞,可能成为修复软组织缺损及整形美容的又一干细胞来源.