结核分枝杆菌核酸疫苗的构建及其小鼠免疫效果观察

将结核杆菌ＥＳＡＴ－６和ＭＰＴ－６４的编码基因分别插入真核表达载体ＪＷ４３０３构建重组质粒,用重组擀凿对４周龄的ＢＡＬＢ／Ｃ和Ｆ１代小鼠进行肌肉和皮内地末次免疫后１０天采血交分离血清,进行ＥＬＩＳＡ检测。结果表明,小鼠能产生较强的体液免疫,特异性ＩｇＧ平均水平分别为参考血清的２．２０倍３．１９倍,且对两种品系小鼠进行的相同途径的免疫,其抗体水平差异不显著,而不同途径的重组质粒免疫,抗体水平略有差异     

结核分枝杆菌组合DNA疫苗的免疫效果

以编码结核分枝杆菌分泌蛋白Ag85B、ESAT 6和MPT6 3的基因为插入片段 ,构建核酸疫苗联合免疫小鼠。以原核表达纯化的抗原为检测物 ,检测了抗原特异性的抗体和γ 干扰素的形成。研究表明 ,组合核酸疫苗第 3次免疫后 2 1天 ,实验小鼠血清中Ag85B抗体滴度达到 10 5以上 ,Ag85B抗原刺激产生的特异性γ 干扰素达到 (17.0± 7.0 )u/ml。组合疫苗虽然没有提高小鼠血清中ESAT 6及MPT6 3蛋白的特异性抗体滴度 ,但仍显著刺激产生了两种特异性的 γ 干扰素。攻毒实验表明 ,经组合疫苗免疫后小鼠肺部结核杆菌数量显著下降。肺部切片显示 ,免疫小鼠病理状况较对照组有明显改善。因此 ,研究提示Ag85B等组合核酸疫苗具有较好的结核病预防效果。     

结核分枝杆菌四价 DNA 疫苗免疫原性 和保护效率研究

对结核杆菌四价 DNA 疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价. 用编码结核分枝杆菌 Ag85B、 MPT64、 MPT70 和 PstS-3 等 4 种抗原蛋白的基因分别构建的单价 DNA 疫苗混合成四价苗免疫小鼠. 3 次免疫后 21 天,四种抗原特异性抗体滴度分别达到 1∶6 400、 1∶51 200、 1∶6 400、 1∶ 6 400. 四种蛋白质均能诱导脾脏细胞产生较高水平的抗原特异性 IFN-γ,浓度分别为 10 582.14 ng/L、 13 635.97 ng/L、 14 213.15 ng/L 和 9 657.35 ng/L. 三次免疫后经静脉强毒攻击,四价苗组小鼠肺脏和脾脏的载菌数分别减少到阴性组的 1/650 和 1/130. 对肺组织的病理形态特征观察表明,空载体免疫的小鼠肺部严重损伤,肺实质干酪样坏死,坏死结节占肺实质的 70%~80%,而四价苗免疫的小鼠,肺组织结构正常,肺泡轮廓清晰. 研究首次证实, Ag85B、 MPT64、 MPT70 和 PstS-3 4 种结核杆菌抗原蛋白编码基因组成的四价 DNA 疫苗,具有很高的免疫应答水平和保护效率.     

抗结核分枝杆菌疫苗的研究进展

结核病是由结核分枝杆菌感染引起的传染病,细胞免疫中的CD4+T细胞、CD8+T细胞、Th17细胞在对抗结核分枝杆菌感染中发挥重要作用,新近研究显示抗体特定的糖链修饰有助于清除病原体,提示体液免疫也可能参与免疫保护。目前使用的疫苗——卡介苗对婴幼儿重症结核病具有良好的保护力,但是对成人肺结核保护力欠佳,所以需要研发新的疫苗。目前已有数个新型疫苗进入临床试验。本文就结核分枝杆菌的免疫保护机制作一简要介绍,主要阐述现用疫苗——卡介苗及新型疫苗的研究现状,让读者对上述知识的进展有所了解。     

结核分枝杆菌免疫优势抗原研究进展

结核病是当今影响人类健康、流行性最广、病死率最高的感染性疾病之一。结核病的诊断和疫苗的构建成为当前的研究热点,筛选出结核分枝杆菌免疫优势抗原是快速准确的诊断结核病及研制安全有效的疫苗的关键。拟对近年来国内外学者发现的结核分枝杆菌免疫优势抗原的分子生物学特性研究进展进行综述。     

结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗与疫苗诱导的T细胞免疫记忆研究进展

牛分枝杆菌减毒活疫苗--卡介苗(bacillus Calmette-Guérin,BCG)对预防严重的儿童结核病有效,但其免疫保护效率随儿童年龄增长而降低。BCG不能提供终身免疫保护可能与其诱导的记忆性T细胞主要是寿命较短的效应记忆性T细胞有关。新型结核分枝杆菌蛋白亚单位疫苗将有效的抗原有机组合起来,在适宜的疫苗佐剂辅助下诱导Th1型免疫应答。动物实验表明,增加抗原谱可有效提高亚单位疫苗的保护效率。更重要的是,亚单位疫苗在体内持续时间较短,可诱导寿命较长的中央记忆性T细胞,提供比BCG更持久的免疫保护力。记忆性T细胞的分化受抗原特性与剂量、细胞因子、转录因子及雷帕霉素等的调控。对亚单位疫苗及其诱导的免疫记忆进行研究将对新型结核分枝杆菌疫苗的设计与评价产生积极影响。     

后基因组时代的生物信息学

随着人类基因组计划的完成,不断积累的巨量的生物学数据和快速发展的信息学技术,给后基因组时代的生物信息学研究带来了新的挑战。该文对后基因组时代的生物信息学研究内容进行了比较全面的描述,分别就其研究对象和研究方向作了区别讨论,分析了生物信息学研究的现状和趋势,比较了国内外的研究发展情况和差距。针对我国在研究中所存在的主要问题,提出了建议并做了展望。     

结核分枝杆菌四联核酸疫苗免疫原性和保护效率

对结核杆菌四联DNA疫苗的免疫应答和保护效果进行了评价. 用结核分枝杆菌Ag85B, MPT-64, MPT-63和ESAT-6等4个分泌蛋白基因的表达载体首次免疫小鼠21 d后, Ag85B抗体滴度达到1︰200, 二次免疫后为1︰102400, 三次免疫后为1︰12800. MPT-64和MPT-63的抗体滴度在首次免疫21 d后即高达1︰25600, 二、三次免疫后呈下降趋势. 三次免疫21 d后均未检测到ESAT-6的特异性抗体. 用该DNA四联苗免疫小鼠后, 4种蛋白都诱导脾脏细胞产生较高水平的细胞应答(产生了特异性g-干扰素). 三次免疫后经静脉强毒攻击, 四联苗免疫组小鼠肺脏的细菌数比对照空载体组减少了99.8%, 保护水平显著高于BCG疫苗组. 对肺组织的病理形态特征观察表明, 空载体pJW4303 的对照小鼠, 肺部严重损伤, 肺实质干酪样坏死, 坏死结节占肺实质的50%~70%, 而四联苗免疫的小鼠, 肺组织结构正常, 实质无肉芽肿, 肺泡轮廓清晰. 研究证实, Ag85B, MPT-64, MPT-63和ESAT-6四种分泌蛋白编码基因组成的四联DNA疫苗具有很高的免疫应答水平和保护效率.     

结核分枝杆菌Rv0081基因编码蛋白的生物信息学分析

运用生物信息学分析软件预测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）Rv0081蛋白的生物学特征及筛选潜在的优势抗原表位。 从NCBI数据库获取Mtb Rv0081蛋白的氨基酸序列，利用生物信息学分析软件ProtParam、ProtScale及TMPRED分析Rv0081蛋白的理化性质及亲疏水性；TMHMM、SignalP-5.0 Server预测蛋白的跨膜区及信号肽；NetNGlyc-1.0 Server、NetPhos 3.1 Server分别预测蛋白的糖基化位点及磷酸化位点；STRING预测能与Rv0081相互作用的蛋白；分别运用SOPMA、SWISS-MODEL预测蛋白的二、三级结构；综合运用softberry、WoLF PSORT预测蛋白的亚细胞定位；运用DNAStar预测蛋白的B细胞抗原表位；综合运用SYFPEITHI、NetCTL 1.2 Server、Net MHC pan 4.1 server预测蛋白的CTL细胞抗原表位；综合运用SYFPEITHI、Net MHCII pan 4.0 server预测蛋白的Th细胞抗原表位。 结果表明，Rv0081蛋白由114个氨基酸组成，相对分子质量为12 356.32，亚细胞定位于细胞质中，为稳定的疏水性蛋白，无跨膜区和信号肽，含有1个糖基化位点及9个磷酸化位点；二级结构主要由α-螺旋和无规则卷曲构成，结构较松散；与hycE、hycP、Rv0088、Rv0083、hycD、hycQ、Rv0082、devR、Rv0080及Rv0079蛋白存在相互作用关系；综合分析各软件预测结果筛选出6个优势B细胞抗原表位、6个优势CTL细胞抗原表位及7个优势Th细胞抗原表位。Mtb Rv0081蛋白具有较多潜在的候选B、T细胞抗原表位，可作为研发新型结核疫苗的候选抗原。     

结核分枝杆菌的免疫学研究进展

由结核分枝杆菌引起的结核病多年来依然是世界范围内严重的公共卫生问题。结核杆菌的致病特点是可在体内巨噬细胞中长期存活,形成潜伏感染。本文就结核杆菌感染过程中机体的免疫应答过程,尤其是潜伏感染形成机制等方面进行了综述,以期为结核病新型疫苗的研发提供参考。     

结核分枝杆菌功能基因组研究的方法学

DNA芯片、基因中断、基因互补法、差示荧光诱导法、生物信息学、蛋白质组、DNA库免疫、细菌人工染色体库是结核分枝杆菌研究的主要方法。综合利用上述技术可能是我们开展结核分枝杆菌功能基因组学研究的最佳切入点。     

结核分枝杆菌L型致病性的实验研究

以结核分枝杆菌稳定Ｌ型感染豚鼠,证明结核分枝杆菌变为Ｌ型后致病性减弱,发病时间延长,ＯＴ试验阴性,引起的病理变化主要表现为组织的间质性炎症,有干酪样坏死,而无典型结核结节形成。原因在于细菌变为Ｌ型后细胞壁缺损,磷脂减少,不足以刺激巨噬细胞转变为上皮样组胞与郎罕氏巨细胞,而形成结核结节。在诊断上容易造成误诊或漏诊。     

两种DNA探针杂交检测结核分支杆菌方法的研究

为改进结核杆菌DNA探针的特异性与实用性,研制了以生物素标记的两种对结核分支杆菌特异的DNA探针:一个5’端标记的20bp的寡核苷酸探针和一个采用PCR方法合成的188bp长链探针。两种探针分别与结核分支杆菌的全染色体DNA,以及基因组上IS6110序列的一段317bp的PCR扩增产物进行斑点杂交,以碱性磷酸酶(AP)催化的染色反应检测,测试了两个探针的敏感性和特异性。系统地比较研究了两种探针杂交检测条件:探针的浓度选择,杂交温度与洗膜温度的选择,以及杂交与洗膜温度对检测的敏感性与特异性的影响。寡核苷酸探针和188bp探针杂交检测纯化结核分支杆菌基因组DNA的敏感性分别为100ng与6ng,杂交检测PCR产物的敏感性分别是400pg与50pg。两探针的最佳杂交浓度均为40～160ng/ml,最佳杂交温度分别是42℃与68℃,最佳洗膜温度分别是60℃与60～68℃之间。两种探针均仅与结核分支杆菌及BCG有杂交信号,而与其它受试分支杆菌及非分支杆菌杂交结果都呈阴性。它们的特异性都很强,但188bp探针的敏感性约是寡核苷酸探针的7～16倍,而且188bp探针检测本底较低,是检测结核分支杆菌的较佳选择     

微菌落观察法快速检测和鉴别结核杆菌培养物的研究

将取自肺结核患者的219例痰标本接种匡氏琼脂平板,共分离到112例结核菌生长物。其中培养法104例(92.8％)阳性,微菌落观察法108例(96.4％)阳性,微菌落法阳性率稍高。培养法和微菌落法阳性标本首次检出时间分别为18.6d和11d,微菌落检出时间更短(P<0.01)。常规菌型鉴别方法与微菌落法对结核杆菌菌型鉴别的符合率为99％。     

新型含硅氨基甲酸酯衍生物的合成、杀虫活性及抗乙酰胆碱酯酶活性研究

合成了14个(1-甲硫基亚乙基)氨基甲基氨基甲酸酯(灭多威)1的新型含硅衍生物3。 测定了其杀虫活性和抗乙酰胆碱酯酶活性。结桌表明该类化合物具有很好的杀虫活性,在50μg/mL浓度下,对粘虫Mythimna separata Walker几乎全部具有100%杀灭效果。以美洲大蠊Periplaneta americana为试材,大部分化合物的抗乙酰胆碱酯酶活性与母体灭多威1相当     

结核分枝杆菌rpoB基因突变的检测(简报)

结核病主要是由结核分枝杆菌(Mycobacterium tuberculosis)引起的一种慢性传染性疾病。利福平是结核病化疗方案中一个关键性的药物,它在结核病的短程化疗中起着重要的作用。但是,在我国结核菌对利福平的耐药发生率呈上升局势,而通过传统的依赖生物生长的药敏试验方法进行结核菌对利福平耐药性检测所需时间较长(4-8周),不能满足临床早期开展有效化疗的需要,所以迫切需要建