冬虫夏草菌无性阶段的分离和鉴定

分离工作在四川康定及北京进行。方法是将康定收集的14批新鲜冬虫夏草,经整体灭菌后,分别割取子座、柄和虫体三部,然后将各部再切割成绿豆大小样的接种体,置于含1％胨的PDA上,在20℃温箱中让其生长;也少量地进行了子囊孢子分离,结果获得90％以上是同一种分生孢子阶段真菌的培养物。而且对该培养物的鉴定表明,是被毛孢属(Hirsutella)一新种——中国被毛孢(Hirsutella sinensis sp.nov.)。并根据这些多批次且大数量接种体(1000个以上)、多途径且重复持续分离,连同子囊孢子分离以及1988年康定点上再次分离的相互验证,皆得到同一种真菌——中国被毛孢这一事实,我们初步结论:中国被毛孢是冬虫夏草菌[Cordyceps sinensis(Berk.)Sacc.]的无性阶段。     

西藏冬虫夏草无性型的分子生物学研究

从西藏采集的冬虫夏草子实体中分离出 3个菌株C3、C4、C5,通过培养特征的研究以及采用分子生物学方法 ,以rDNAITS区为分子指标 ,与冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk .)Sacc.) ]的有性世代及中国被毛孢 (HirsutellasinensisLiu ,Guo,Yu&Zeng)进行比较分析 ,发现C4的培养特征与C3、C5 完全不同 ,其序列与冬虫夏草的相似率为 93 %,与中国被毛孢的相似率为 94%,而C3、C5 与冬虫夏草的相似率很低 (分别为 5 5 %和 6 9%) ,从而证明C4是西藏冬虫夏草的无性型 ,为中国被毛孢。     

冬虫夏草寄主昆虫选育及生殖退化研究

选育发育速度快、繁殖能力强、中国被毛孢侵染率和冬虫夏草产出率高的寄主昆虫品系是冬虫夏草培植的基础,同时明确冬虫夏草的寄主昆虫蝙蝠蛾退化机制是保证冬虫夏草培植的条件。本文从冬虫夏草产区采集蝙蝠蛾种群种质资源,分别针对蝙蝠蛾发育速度、繁殖能力、中国被毛孢侵染率、冬虫夏草产出率4个方面通过杂交及四代选育,获得新种群（A1）,该种群对冬虫夏草繁育环境的适应力强,发育整齐度高,繁育一代的种群扩繁倍数从8.2倍提高至26.3倍;对中国被毛孢的敏感性较好,侵染率高,冬虫夏草产出率从原始种群的11.2%提高至18.5%。同时,仿照高原生态环境长期饲养冬虫夏草的寄主昆虫蝙蝠蛾,其子代出现雌雄比失调、发育历期分化、生殖力降低等退化现象。经过研究分析得知卵孵化率下降的主要原因是雄性的生殖力下降。组织切片观察蝙蝠蛾雄性生殖系统,在幼虫后期、蛹、成虫期会出现生精囊减少及畸形等异常情况,推测此为雄性生殖力降低、卵孵化率下降的生理原因。研究结果为高效、稳定地饲养蝙蝠蛾保证冬虫夏草培植具有重要意义。     

自然干燥对冬虫夏草寄主蝠蛾卵孵化的影响

研究在室内自然空气湿度下放置的时间长短对冬虫夏草(Cordyceps)寄主昆虫贡嘎蝠蛾Hepialus gonggaensis Fu et Huang卵孵化率的影响。卵早期的研究结果为:第1批、第2批和第3批卵于室内自然空气湿度下保存的时间达26,11和16h后再保湿都可以正常孵化并且孵化率与对照无显著性差异,所孵化幼虫在饲养初期的成活率分别达62.0%,41.4%和43.4%,与对照无显著性差异。卵中期干燥放置36h的孵化率为66.7%,所孵化幼虫在饲养初期的成活率为50.0%,孵化率和成活率都与对照无显著性差异。卵晚期干燥放置24h的孵化率为70.0%,所孵化幼虫在饲养初期的成活率为49.0%,孵化率和成活率都与对照无显著性差异。以上结果表明,经历一定时间的干燥不会对卵的正常孵化有影响。     

确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据：Ⅰ.中国被毛孢与冬虫夏草之间 …

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢「Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．」,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛孢相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据I.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．］,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛抱相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

确证冬虫夏草无性型的分子生物学证据* I.中国被毛孢与冬虫夏草之间的关系

从青海的冬虫夏草子实体上分离出中国被毛孢［Ｃｏｒｄｙｃｅｐｓ　ｓｉｎｅｎｓｉｓ（Ｂｅｒｋ．）Ｓａｃｃ．］,并利用ＲＡＰＤ－ＰＣＲ技术,筛选出８种引物,获得了冬虫夏草和中国被毛抱相应的基因组ＤＮＡ指纹图谱,两者相似率高达９６％,从而表明冬虫夏草的无性型为中国被毛孢。     

冬虫夏草无性型—中国被毛孢固态发酵条件的初步研究

采用以麦角甾醇含量为指标间接测定固态发酵产物生物量的方法,对冬虫夏草无性型—中国被毛孢的固态发酵条件进行了研究。正交试验结果表明固态发酵最佳培养基组成为：大米5g,玉米粉2g,蚕蛹粉1g,麸皮2g;单因素试验结果表明：当培养温度20℃、料水比1：1.5、料层厚度2cm、无光照时对菌体生长较为有利。发酵条件优化后,菌丝体中麦角甾醇的含量可达0.5911mg/g,比优化前提高了38.6%。     

冬虫夏草菌丝状菌源增殖培养的研究

冬虫夏草菌是珍稀濒危名贵中药材冬虫夏草的无性型菌种,是侵染蝠蛾幼虫的唯一菌种,其侵染后形成名贵中药材冬虫夏草。冬虫夏草菌在不同营养及条件下生长形态不同,主要有丝状体和菌球体两种生长形态。冬虫夏草菌丝状菌体能够侵染蝠蛾幼虫,有可能作为一种新的接种体被广泛应用;但丝状菌体对营养要求苛刻、生长缓慢、菌丝体得率低的特点,阻碍了冬虫夏草菌丝状菌体作为侵染蝠蛾幼虫的接种体的开发及应用,从而阻碍了冬虫夏草人工培殖产业化的进程。为了提高冬虫夏草菌丝状菌体的生物表达量,本文对营养及培养条件进行了优化研究,得出了最佳条件为:葡萄糖质量浓度40 g/L、酵母粉质量浓度65 g/L、培养温度17℃、MgSO_4质量浓度3 g/L、KH_2PO_4质量浓度1.5 g/L、培养时间12 d,按最优培养条件,冬虫夏草菌丝状菌体干重得率15.67 g/L,为下一步新的接种体的制备提供菌源保障。     

西藏冬虫夏草无性型的分子生物学研究*

从西藏采集的冬虫夏草子实体中分离出 3个菌株C₃、C₄、C₅,通过培养特征的研究以及采用分子生物学方法 ,以rDNAITS区为分子指标 ,与冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk .)Sacc.) ]的有性世代及中国被毛孢 (HirsutellasinensisLiu ,Guo,Yu&Zeng)进行比较分析 ,发现C4的培养特征与C₃、C₅ 完全不同 ,其序列与冬虫夏草的相似率为     

正交优化冬虫夏草菌种油混悬制剂

利用油混悬剂独有的剂型特性可提高人工培育冬虫夏草中的接种侵染率, 因而研制高活力冬虫夏草菌种油混悬剂可推动其产业化的发展。根据油混悬剂的特殊性, 对MTT法进行改进及优化, 结果为: 反应时间120 min、反应温度37°C、以甲苯为萃取剂, 活细胞量与琥珀酸脱氢酶活力线性相关。依据该方法筛选制剂中助剂的种类及浓度, 并通过正交试验进一步优化, 获得冬虫夏草菌种油混悬剂高活力配方为: 菌种量0.15 g/mL、硬脂酸铝60 mg/mL、司班-80 50 μL/mL。稳定性试验结果表明, 该制剂在4°C下保     

冬虫夏草成熟过程中中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉DNA共存及竞争增殖力、化学成分变化

文献报道从冬虫夏草中分离得到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢,本研究检测了蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌及其DNA在冬虫夏草中的共存,同时检测了2个真菌在冬虫夏草成熟过程中的竞争增殖力。应用色谱法和质谱法检测了冬虫夏草及中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱。在冬虫夏草中检测到蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢活菌,在虫体和子座中检测到这两个真菌的DNA。从子座露出地表后,冬虫夏草的成熟伴有蛋白质和小分子有机化合物指纹谱的动态变化,中国被毛孢竞争增殖力下降(P<0.001)。中国被毛孢和蝙蝠蛾拟青霉菌丝体的化学成分指纹谱均不能与冬虫夏草的成分完全重叠,与中国被毛孢相比,蝙蝠蛾拟青霉菌丝体与冬虫夏草的指纹谱更相似。结论:中药冬虫夏草的成熟伴有蝙蝠蛾拟青霉和中国被毛孢真菌共存于它的虫体和子座,也伴有冬虫夏草化学成分的变化和中国被毛孢竞争增殖力的下降。     

冬虫夏草研究进展

综述了近几年来我国对冬虫夏草 [Cordycepssinensis(Berk)Sacc .]的无性型鉴定、人工培养、深层发酵、化学成分分析、药理及临床应用等方面的研究进展。     

Advances in research of the artificial cultivation of Ophiocordyceps sinensis in China

Abstract

Ophiocordyceps sinensis (syn. Cordyceps sinensis), a traditional Chinese medicine called DongChongXiaCao (DCXC) in Chinese, is well known and has been used in Asia countries since the fifteenth century, and it contains some valuable medicinal component defined by modern pharmacological science. DCXC only appears at high altitudes on the Qinghai-Tibetan Plateau. Consequently, it is difficult to find and harvest. Because of its rarity and medicinal value, DCXC has always been one of the most expensive medicines known. As the price of DCXC has risen in recent years, thousands of migrants have entered into the various grasslands to search for them in season, which makes ecological environments of the grassland more fragile. In order to relieve the environmental pressures and protect this valuable resource, the artificial cultivation of DCXC involving two aspects of the genus Hepialus and the fungi of the host larvae should be employed and applied at the first available time point. In this article, the reproduction of moth larvae of the genus Hepialus is first described, which includes their ecological characteristics and the methods of artificial feeding. Second, the generation and isolation method of the fungi from DCXC are subsequently summarized, and then the mechanism of fungal spores to attack the moth larvae are restated. Finally, the basic model of artificial cultivation of DCXC is introduced; meanwhile, the potential application of modern biotechnology to the artificial cultivation is analyzed in prospect. This review article will not only expand people’s knowledge regarding the artificial cultivation of DCXC, but also hopefully provide an informative reference for the development of this valuable resource and the environmental protection of alpine meadows.     

人工培殖冬虫夏草D-甘露醇的含量测定

采用水提回流离心的方法,提取分离人工培殖冬虫夏草中D-甘露醇,用高碘酸钠与甘露醇反应产生黄色的3,5-二乙酰-1,4-脱氢二甲基吡啶,在波长412 nm处测定其最大吸收.甘露醇浓度在10～50 mg/L之间时,与吸光值(OD412)有良好线性关系,线性方程为C=79.172x-0.0713,相关系数r=0.9999.人工培殖冬虫夏草中D-甘露醇的含量分别为89.64 mg/g(2005年)、91.86 mg/g(2006年)、94.71 mg/g(2007年)、98.98 mg/g(2008年)、97.50 mg/g(2009年)、94.71 mg/g(野生)和96.84 mg/g(野生).人工培殖冬虫夏草与野生冬虫夏草D-甘露醇的含量基本相同.     

冬虫夏草的研究进展

冬虫夏草是著名的传统中药,具有多种药用功效。综述了近几年国内外冬虫夏草在无性型的确证、液体发酵、活性成分分离分析、药理学等方面的研究进展。     

冬虫夏草及人工虫草菌丝体的氨基酸营养

本文研究了天然虫草菌与人工虫草菌的氨基酸含量。结果表明,天然虫草菌、人工虫草菌的总氨基酸含量稍有差异,但中性、酸性、碱性氨基酸和必需氨基酸在总氨基酸中所占百分比的高低基本一致。     

冬虫夏草活性成分研究进展

本文系统综述了冬虫夏草Cordyceps sinensis的主要化学组成和药理学作用研究进展,重点对冬虫夏草多糖、核苷、肽类和甾醇的研究成果进行了总结,同时也针对有关冬虫夏草的一些问题进行了客观评述,为深入研究其有效成分与虫草相关新药物研发提供了依据和思路.