抗CD20单克隆抗体研究进展

抗CD20单克隆抗体是一类治疗B细胞淋巴瘤的靶向药物。迄今,主要有三代抗CD20单克隆抗体药物:以利妥昔单抗为代表的第一代抗CD20单抗,ofatumumab、veltuzumab、ocrelizumab等第二代抗CD20单抗,以及obinutu-zumab、ocaratuzumab等第三代抗CD20单抗。我们就抗CD20治疗性单克隆抗体研究的新进展进行简要综述。     

CD20生物学功能的研究进展

B细胞抗原受体（BCR）信号传导起始于持续的钙离子向细胞内流动,这种钙离子的内流对于B细胞的生长、分化、活化是必需的。CD20是B细胞膜上特有的4次跨膜蛋白,参与了BCR活化的钙离子流入。最近的研究提供了直接的证据,证明CD20形成的同源寡聚体是四聚体。CD20单抗诱导的钙信号也得到研究,研究表明只有Ⅰ型CD20单抗能引起钙离子内流。CD20还通过钙池调控钙离子进入（SOCE）参与了细胞信号传导。我们就CD20形成同源寡聚体、与BCR的相互作用、参与调节B淋巴细胞钙离子的流动等进行简要综述。     

CD20 分子与靶向治疗

CD20是B淋巴细胞上的跨膜蛋白质,分子量范围为33-37kD,以非糖基化的磷酸化蛋白质形式存在。CD20是调节B淋巴细胞生命与分化信号转导的重要分子,其在B细胞中特有的表达方式、生物学作用和存在形式决定了其成为治疗B淋巴细胞瘤的主要靶位点。研究CD20的生理作用有利于阐明抗CD20抗体抗肿瘤机制。     

Combating non-Hodgkin lymphoma by targeting both CD20 and HLA-DR through CD20–243 CrossMab

Although rituximab has revolutionized the treatment of hematological malignancies, the acquired resistance is one of the prime obstacles for cancer treatment, and development of novel CD20-targeting antibodies with potent anti-tumor activities and specificities is urgently needed. Emerging evidence has indicated that lysosomes can be considered as an “Achilles heel” for cancer cells, and might serve as an effective way to kill resistant cancer cells. HLA-DR antibody L243 has been recently reported to elicit potent lysosome-mediated cell death in lymphoma and leukemia cells, suggesting that HLA-DR could be used as a potential target against lymphoma. In this study, we generated a bispecific immunoglobulin G-like antibody targeting both CD20 and HLA-DR (CD20–243 CrossMab) through CrossMab technology. We found that the CrossMab could induce remarkably high levels of complement-dependent cytotoxicity, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity and anti-proliferative activity. Notably, although HLA-DR is expressed on normal and malignant cells, the CrossMab exhibited highly anti-tumor specificity, showing efficient eradication of hematological malignancies both in vitro and in vivo. Our data indicated that combined targeting of CD20 and HLA-DR could be an effective approach against malignancies, suggesting that CD20–243 CrossMab would be a promising therapeutic agent against lymphoma.     

重组抗CD20单克隆抗体ELISA检测新方法的建立

目的:建立一种检测重组抗CD20单克隆抗体的新的ELISA方法,以便快捷、简便、灵敏地检测生物体液中的重组抗CD20单抗。方法:采用双抗夹心ELISA法对重组抗CD20单克隆抗体进行定量检测,包被抗体用猴血清吸附的羊抗人IgG,检测抗体用猴血清吸附的羊抗人IgG-HRP,最后加底物显色剂,终止后在酶标仪450 nm下读数。结果:按照新药临床前药代动力学中方法学确认的要求进行验证,获得了检测重组抗CD20单克隆抗体的高灵敏度和稳定的ELISA方法。结论:该ELISA方法简便、稳定、灵敏度高,可用于重组抗CD20单克隆抗体的检测。     

CD20抗体亲和力和免疫原性的改造及表达

[目的]构建较高亲和力较低免疫原性的CD20抗体。[方法]通过专利分析,进行高亲和力和人源化的设计改造,将抗体的轻链和重链分别克隆到pc DNA3.1/ZEO(+)、pc DNA3.1(+)真核表达载体中,共转染中国仓鼠卵巢细胞CHO-K1,通过RT-PCR检测mRNA的转录,夹心ELISA检测抗体表达量,流式细胞术检测细胞上清与CD20阳性细胞Raji的结合活性。[结果]得到了高亲和力的人源化CD20抗体的轻链和重链基因片段,并成功地构建了重组表达载体pc DNA3.1/ZEO(+)-CD20L和pc DNA3.1(+)-CD20H,并可在CHO-K1细胞中表达,通过RT-PCR证明基因在CHO细胞中成功表达,ELISA法测得培养上清的含量在0.45~4.72μg/m L之间,流式检测表明上清中的抗体可与Raji细胞结合。[结论]成功构建并表达筛选了17株单克隆抗体,15号的表达量最大,为4.72μg/m L,为下一步研究抗体的亲合力、免疫原性以及生物学功能打下基础。     

抗CD20嵌合抗体的表达与活性检测

表达了基因重组抗CD20嵌合抗体并对其生物学活性进行了初步鉴定。设计合成轻、重链可变区序列;提取血液RNA,通过RT-PCR得到人κ、IgG1的轻、重链恒定区序列。运用重叠延伸PCR,连接可变区与恒定区,将轻、重链基因连接至pIRES双表达载体。将质粒以阳离子脂质体转染CHO细胞,ELISA挑选阳性克隆,共获得7株表达较高的克隆,表达量约为2mg/L。扩大培养阳性克隆anti-CD20-1B3,收获上清,以蛋白A进行亲和层析纯化表达蛋白。SDS-PAGE检测表明纯化纯度达到95％,蛋白相对分子量与理论值吻合。以CD20₊细胞Raji、Daudi、Ramous检测,表明该抗体能与CD20抗原特异性结合,体外杀伤试验说明抗体能够杀伤CD20₊淋巴瘤细胞。     

抗CD20抗体高产细胞株的筛选及质量评估

目的:筛选高表达单克隆细胞株,并通过优化培养基及流加物,最终达到提高目的蛋白产量及质量的目的。方法:通过有限稀释法对转染目的蛋白的CHO-S细胞进行单克隆化,应用双抗夹心ELISA方法对单克隆细胞株抗体表达量进行初步评估,最后根据筛选细胞株的活率、密度、产量及代谢情况,选择2~3株单克隆细胞进行培养条件优化,并对获得的发酵液进行纯化捕获,根据抗体蛋白表达量、糖型、等电点、纯度、酸碱峰分布等进行相应的评估分析,筛选出最优细胞株及最优培养方案。结果:经过单克隆化处理以及培养条件优化,蛋白的表达量由初始的不到500mg/L提升到2 290mg/L,且抗体蛋白纯度高达97.48%。抗体蛋白质量分析结果显示B1方案为该实验最优培养方案。结论:通过细胞株筛选、培养基优化能显著提高抗体蛋白的产量及质量,同时对抗体蛋白糖型、等电点、纯度等均有一定程度的优化。因此工业生产中可以通过高表达克隆的筛选、培养工艺优化等对目的蛋白产量及质量进行一定程度的改善与提高,对后期实验研究及工业化方案开发都具有很好的指导意义。     

抗CD20单克隆抗体治疗B 细胞淋巴瘤的效应机制

B细胞淋巴瘤是一种主要的非霍奇金淋巴瘤(non-Hodgkin’s lymphoma,NHL),95%以上的B细胞淋巴瘤均表达B细胞分化抗原CD20。尽管目前CD20在B细胞分化发育过程中的具体功能尚未阐明,但其特有的表达方式和在细胞膜上的分布特点决定了其成为B细胞淋巴瘤靶向治疗的主要靶点。近十年来,随着抗CD20单克隆抗体的不断发展和进步,联合传统的CHOP化疗方案,在NHL的治疗中显示出良好的效果。虽然,近年来抗CD20单抗逐渐被用于B细胞相关的自身免疫病的治疗,但相关作用机制尚不明确。在针对NHL的临床治疗中,抗CD20单抗的疗效被认为依赖于效应器机制,主要有ADCC、CDC和细胞凋亡。虽然抗CD20在淋巴瘤的治疗中具有显著的免疫疗效,但部分瘤荷较大的病人出现了耐药和复发,循环中大量B细胞由于单抗的结合而被机体的单核巨噬细胞吞噬或NK细胞杀伤,机体出现成熟B细胞空缺期,同时单核巨噬细胞、NK细胞和补体大量消耗,造成机体免疫效应功能饱和和效应器耗竭。本文就抗CD20单克隆抗体在治疗淋巴瘤中的具体作用机制及可能造成的机体效应器耗竭问题做一简要的概述。     

抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体的表达、鉴定及活性分析

设计并合成多个60bp左右的DNA小片段 ,经重叠延伸PCR扩增获得1640bp的抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体完整基因片段 ,将其克隆入真核定点表达载体pcDNA5 FRT中 ,脂质体法转染Flp-In^TM CHO细胞 ,获得稳定表达细胞株 ,目的蛋白在上清中的表达量约为 300μg/L。采用Ni_NTA柱对其进行了纯化 ,经SDS-PAGE蛋白电泳及Western-blot分析结果表明 ,含组氨酸标签的目的蛋白的分子量约为 70kD ,与预期结果一致。活细胞间接免疫荧光实验和玫瑰花环实验证明抗CD3抗CD20双特异性单链抗体具有与Ramous(CD20+)及Jurkat(CD3+)细胞特异性结合的活性。光学显微镜下可以观察到抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体可以有效介导人外周血淋巴细胞裂解B淋巴瘤细胞Ramous。以上工作为进一步了解抗CD3 抗CD2 0双特异性单链抗体的体内体外生物学活性奠定了基础。     

抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体介导的B淋巴瘤细胞体外裂解作用

在构建并成功表达抗CD3/抗CD20双特异性单链抗体(bscCD3×CD20)的基础上,对其在体外介导T淋巴细胞杀伤Ramous B淋巴瘤细胞的生物活性进行了分析。Annexin V/PI(AV/PI)染色和形态学观察及扫描电镜分析表明bscCD3×CD20介导的B淋巴瘤细胞体外裂解作用是通过先诱导靶细胞凋亡而继发坏死、裂解的方式实现的。非放射性细胞毒性分析表明bscCD3×CD20介导的T淋巴细胞杀伤活性随抗体浓度、反应时间和效靶比的升高而增加。在抗体浓度为5μg/mL、作用时间为24h、效靶比为10∶1时,杀伤活性最高可达87·3%。采用美国SuperArray人细胞凋亡芯片检测细胞杀伤起始阶段细胞凋亡相关基因的表达水平变化,许多凋亡相关基因的表达均发生了不同程度的上调或下调,其中ATM基因表达升高了187倍,p53基因升高了15倍,提示ATM-p53途径可能是bscCD3×CD20介导T细胞诱导B淋巴瘤细胞凋亡的主要途径。     

B 细胞膜CD20 抗原的分布与单分子力谱探测

CD20抗原分子在B细胞上表达下降是慢性B淋巴细胞白血病 (B-CLL) 的标志性特征。采用激光扫描共聚焦显微镜 (LSCM) 和量子点标记相结合的方法对正常和B-CLL外周血CD20+B淋巴细胞膜表面CD20抗原分子的表达及分布进行了荧光成像。同时,采用原子力显微镜 (AFM) 对CD20+B细胞的形貌及超微结构特征进行了表征,并且将AFM针尖用生物素化的单克隆抗体进行修饰,对CD20+B细胞表面的CD20抗原-抗体之间的单分子力谱进行了探测。LSCM荧光图像显示,B-CLL CD20+B淋巴细胞上CD20分子的表达量比正常CD20+B淋巴细胞显著降低。AFM结果显示,B-CLL CD20+B淋巴细胞超微结构比正常的粗糙。力谱结果显示,CD20抗原-抗体的相互作用力大约是非特异性黏附力的5倍,CD20分子在正常CD20+B淋巴细胞膜上分布比较均匀,小部分有聚集现象,反之,在B-CLL CD20+B淋巴细胞膜表面分布稀疏。利用以上两种方法能进一步观察到B-CLL外周血B淋巴细胞的异常,并在一定程度上解释临床上B-CLL病人对利妥昔的低反应现象,为针对抗原CD20的治疗用药选择提供参考。     

CD20F(ab′)2抗体的发酵与纯化

转化了质粒PYZcpp3的 16C9大肠杆菌可高水平地分泌表达可溶性CD2 0F(ab′) 2 抗体 ;采用经优化的培养条件 ,在发酵罐上进行高密度培养OD550 值达 14 0 ;每升湿菌菌重 2 0 0g ;抗体的产量每升为 2 4 1mg ,其中F(ab′) 2 片段达 5 0 % ,F(ab′) 2 可以特异性的识别CD2 0 细胞并与CD2 0相结合 ;F(ab′) 2 对Raji细胞的IC50 值为 2 2 8μg mL ;而Fab′对Raji细胞的IC50 值为 4 5 9μg mL。     

CD20F(ab'''')2抗体的发酵与纯化

转化了质粒PYZcpp^3的16C9大肠杆菌可高水平地分泌表达可溶性CD20 F(ab’)2抗体;采用经优化的培养条件,在发酵罐上进行高密度培养OD550值达140;每升湿菌菌重200g;抗体的产量每升为241mg,其中F(ab’)2片段达50％,F(ab‘)2可以特异性的识别CD20^ 细胞并与CD20相结合;F(ab‘)2对Raji细胞的IC50值为22.8μg／mL;而Fab’对Raji细胞的IC50值为45．9μg／mL。     

重组anti－CD20 scFv／CD80／CD28/ζ非复制型逆转录病毒的构建及其在Jurkat细胞株中的表达

目的:构建表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ重组非复制型逆转录病毒,转染Jurkat细胞株使其表达目的蛋白.方法:采用DNA重组技术把pBULLET上的CD28-ζcDNA插入到已含anti-CD20 scFv/CD80的真核逆转录病毒载体pLNCX质粒上,转染PA 317细胞株,收获上清液获非复制型逆转录病毒,感染NIH 3T3细胞株,用PCR、流式细胞术检测目的基因在NIH 3T3细胞的表达情况,确定病毒滴度.挑取高滴度的包装细胞株收获病毒,感染Jurkat细胞,经G418筛选细胞,用RT-PCR检测目的基因表达情况.结果:经酶切及测序鉴定均证实pLNCX/anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ的成功构建; 用PCR能够从逆转录病毒感染的NIH 3T3细胞中扩增出一条与目的基因大小一致的DNA片段; 流式细胞术检测显示该目的基因能够在NIH 3T3细胞中表达目的蛋白; 经RT-PCR,能够从转染的Jurkat细胞株中扩增出1条与目的基因大小一致的DNA片段.结论:成功构建高滴度表达anti-CD20 scFv/CD80/CD28/ζ非复制型逆转录病毒,并能在Jurkat细胞中表达目的蛋白.     

基于抗CD20单克隆抗体的2种夹心ELISA法的建立

目的:建立和比较2种灵敏、特异的夹心ELISA方法,用于准确定量检测食蟹猴血浆中重组抗CD20人源化单克隆抗体(rh-anti-CD20zumab)浓度。方法:以rh-anti-CD20zumab为基础,分别用山羊抗人IgG F(ab')2抗体和驴抗人IgG Fc抗体包被96孔酶标板,加入待测样品,均采用HRP标记的猴血清吸附的山羊抗人IgG抗体进行检测,加底物显色,读取D450nm值。结果:建立了2种定量检测rh-anti-CD20zumab的夹心ELISA方法并进行了确证,样品的前处理分别为1∶20和1∶10,方法的线性范围分别为40~5000和40~12 500 ng/mL,定量下限均为40 ng/mL,两者的板内、板间精密度分别小于16.2%和19.4%,准确度分别为-10.3%~16.6%和-14.4%~12.9%。2种方法均具有良好的特异性和稀释线性,且都未出现钩状效应。结论:方法学确证表明,本研究建立的2种ELISA法均符合新生物制品临床前药代动力学研究指导原则的要求,可用于rh-anti-CD20zumab的检测,为后续rh-anti-CD20zumab在食蟹猴体内的药代动力学研究提供了不同的检测方法。     

Rituximab与CD20分子的相互作用的分子机制和结构基础

Rituximab（中文名：美罗华）是罗氏公司生产的一种广泛应用于治疗非霍奇金氏淋巴瘤和一些其他淋巴瘤、以及自身免疫性疾病的单克隆抗体类药物。它是第一种通过美国FDA认证的单抗类抗肿瘤药物,每年仅在美国的销售额就超过20亿美元,其作用靶标为B细胞表面抗原分子CD20。     

重组人鼠嵌合抗CD20单克隆抗体免疫原性检测方法的建立

目的:建立一种灵敏、特异、操作简单的ELISA方法,用于检测食蟹猴血清中抗CD20单克隆抗体的免疫原性。方法:首先采用桥连ELISA法对抗药物抗体(ADA)进行定性筛选,以抗CD20单克隆抗体作为包被抗体,以生物素标记的抗CD20单克隆抗体作为检测抗体,二者共同结合血清中存在的ADA,以D450/560nm值超过临界值作为阳性判断标准;初筛为阳性的样本采用免疫清除法进一步确证,并同时进行免疫交叉试验考察ADA对供试品和原研对照品的免疫反应有无差异。结果:建立了检测ADA的筛选方法和确证方法,确定了检测的临界值和归一化因子,血清中抗药物抗体的检测灵敏度达3.5 ng/m L,批内/批间精密度介于3.1%~7.4%,准确度介于-1.2%~9.5%;食蟹猴连续给药后,部分个体产生特异性抗体,且抗体滴度随时间延长而增高。结论:建立的ADA筛选方法和确证方法可用于毒性试验的免疫原性检测;动物给药剂量对抗体的产生有较大影响,低剂量连续给药更易诱发特异性抗体产生。     

利用AFM探测淋巴瘤细胞表面CD20抗原与其抗体的相互作用

在分子水平阐明细胞生理活动深层次的机制是当前生命科学的重要研究课题. AFM的发明为揭示细胞生理活动的分子本质提供了新的技术手段. 利用AFM单分子力谱技术在近生理环境下对B淋巴瘤细胞表面的CD20抗原与其抗体Rituximab之间的特异性结合反应进行了探索性的研究, 通过对探针进行功能化, 测量了CD20抗原与Rituximab之间的特异性结合力, 同时观察了CD20抗原在B淋巴瘤细胞表面的分布, 并分析了在外部拉力作用下, CD20-Rituximab复合物的分子内力与伸长量的关系. 实验结果为深入研究Rituximab的作用机制奠定了基础.