用DNA过量核酸分子杂交法对大鼠肝和大鼠肝癌细胞核RNA的比较研究

用DNA过量核酸分子杂交法观察到,大鼠肝癌细胞中重复频率在10~4以上的Poly(A)-核RNA的频率和种类,均比大鼠正常肝细胞有所增加。大鼠肝癌细胞中重复频率在1—4×10~2的Poly(A)-核RNA和Poly(A)~+核RNA的重复频率,比大鼠正常肝细胞减少,而RNA种类则增加。大鼠肝癌细胞中,接近单拷贝的Poly(A)-核RNA和Poly(A)~+核RNA,其频率比大鼠正常肝细胞略有增加,而种类则减少。用总细胞核RNA得类似结果。     

正常小鼠肝和腹水型肝癌细胞核内酸溶性蛋白质磷酸化的比较研究

染色质的组成成分,组蛋白和非组蛋白在特异的蛋白激酶作用下可以发生磷酸化修饰,组蛋白和非组蛋白的磷酸化和脱磷酸化可能在染色质的结构,基因表达以及DNA复制中起着重要的作用。本文比较是小鼠腹水型肝癌细胞核和正常小鼠肝细胞核内酸溶性蛋白质及其磷酸化的差异。正常小鼠肝细胞核酸溶性蛋白质的电泳染色图谱有一条明显可见的组蛋白H_1~0蛋白带,而对小鼠腹水型肝癌来说,此带极浅,但在腹水型肝癌细胞核酸溶性蛋白质的电泳染色图谱上可见到表观分子量约为68K的一条蛋白带,而正常小鼠肝未见此带。此外,从电泳胶片~(32)P放射自显影图谱可见腹水型肝癌组蛋白H_1,H_2A和非组蛋白带Ⅱ(MW43K),带Ⅲ(MW.67K)带Ⅳ(M.w.97K)磷酸化程度明显高于正常小鼠肝。     

小鼠正常肝、再生肝和腹水型肝癌H22a细胞酪氨酸蛋白磷酸酶的比较研究

小鼠肝在再生过程中,胞浆酪氨酸蛋白磷酸酶(PTPP)活力比正常肝有明显升高,并且伴有时相变化,,手术后24—48h活力达到最高,而H22a细胞各组分的活力都比正常肝低。PTPP在正常肝细胞的溶酶体中分布最高;再生肝中则在细胞核、胞浆和微粒体中更集中;在H22a细胞中,PTPP的活力分布趋于平均化。再生肝和H22a细胞胞浆中都缺少正常肝的a、b两个PTPP活力峰,其它五个主要PTPP峰与正常肝无根本的差别。     

小鼠再生肝、Hca腹水型肝癌与正常肝组织核内非组蛋白的电泳比较研究

核内非组蛋白蛋白质(简称NHP)是一类极不均一的蛋白质,代谢上不稳定,转换率较快。有人认为 NHP 与基因表达的调控有关,而癌变过程可能是基因表达的调控失常所致,因此当正常细胞转化为癌细胞时,NHP会发生改变。据文献报道,某些分化旺盛的组织,其NHP亦会发生变化,那么,癌变过程中NHP的变化是否与组织增殖者相同。换言之,癌细胞中NHP的变化是特异的,还是非特异的,似有研究的必要。本文以小鼠 Hca 腹水型肝癌为模型,小鼠正常肝为本底,小鼠再生肝为对照,用十二烷基硫酸钠(SDS)聚丙烯酰胺凝胶电泳——等电聚焦双向电泳为手段,观察比较了三组 NHP 的异同。同时还作了三组     

大鼠肝和肝癌DNA酶切片段与标记RNA杂交图谱比较

Southern印迹杂交实验提示,大鼠肝15kbp EcoR Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA杂交带强度,大于肝癌DNA相应片段;当以5′-~(32)P标记核RNA和3′-~(32)P标记核RNA代替~(125)Ⅰ标记核RNA时,在肝癌相应DNA片段处几无可见的杂交带。大鼠肝2.4kbp EcoR Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA杂交带明显强于肝癌相应DNA片段。而大鼠肝癌2.0kbp EcoRⅠ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA的杂交带明显强于大鼠肝相应DNA片段。大鼠肝2.2kbp和5kbpBamH Ⅰ片段与~(125)Ⅰ标记核RNA或5′-~(32)P标记核RNA或3′-~(32)P标记核RNA的杂交带,均明显高于肝癌相应DNA片段。~(125)Ⅰ标记大鼠肝癌核RNA与大鼠肝和肝癌2.2kbp或1.1kbpEcoR ⅠDNA片段的杂交带,弱于用~(125)Ⅰ标记大鼠肝核RNA为探针得之结果,当以5′-~(32)P标记核RNA代替~(125)Ⅰ标记核RNA为探针时,差异更明显。     

小鼠Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的研究——Ⅰ.正常小鼠肝和Hep.A腹水肝癌染色质磷酸化非组蛋白的比较

研究了Hep.A腹水肝癌染色质磷酸化非组蛋白的变化。Hep.A肝癌染色质非组蛋白,磷酸化非组蛋白的含量以及非组蛋白被磷酸化的比例都较正常小鼠肝增加,分别达到正常肝的2.2,4.4和2.0倍。非组蛋白含磷量也增加,达到正常肝的1.36倍。结果表明Hep.A肝癌染色质非组蛋白磷酸化比例增加。但单位重量非组蛋白及磷酸化非组蛋白所含磷酸基团反而下降,仅分别为正常肝的65%和32%。Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的SDS-凝胶电泳图谱显示分子量为69,000道尔顿的蛋白部份明显增加,此外还有一正常细胞缺乏的分子量为47,000道尔顿的蛋白部份出现。等电聚焦电泳表明等电点偏低的蛋白部份增加。氨基酸组成分析证明两种细胞磷酸基团的接受体基本相同。实验结果表明Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白与正常小鼠肝有质与量的差别。     

小鼠Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的研究——Ⅰ.正常小鼠肝和Hep.A腹水肝癌染色质磷酸化非组蛋白的比较

研究了Hep.A腹水肝癌染色质磷酸化非组蛋白的变化。Hep.A肝癌染色质非组蛋白,磷酸化非组蛋白的含量以及非组蛋白被磷酸化的比例都较正常小鼠肝增加,分别达到正常肝的2.2,4.4和2.0倍。非组蛋白含磷量也增加,达到正常肝的1.36倍。结果表明HeP.A肝癌染色质非组蛋白磷酸化比例增加。但单位重量非组蛋白及磷酸化非组蛋白所含磷酸基团反而下降,仅分别为正常肝的65%和32%。Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白的SDS-凝胶电泳图谱显示分子量为69,000道尔顿的蛋白部份明显增加,此外还有一正常细胞缺乏的分子量为47,000道尔顿的蛋白部份出现。等电聚焦电泳表明等电点偏低的蛋白部份增加。氨基酸组成分析证明两种细胞磷酸基团的接受体基本相同。实验结果表明Hep.A肝癌染色质磷酸化非组蛋白与正常小鼠肝有质与量的差别。     

电镜技术在核酸分子杂交研究中的应用

电子显微镜是目前唯一能直接看到DNA或RNA分子的工具,而电泳、同位素标记等技术只能间接地测定这些分子,电镜就是以它这种得天独厚的优点在核酸分子研究中崭露头角。基因的准确定位,核酸复制模型的完善,真核基因DNA倒转重复序列“十字架”结构的观 察及内含子的二发现等等,近四十年来,核酸分子杂交技术取得如此可喜的成绩,电镜所作的贡献是不能低估的。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅲ.正常小鼠肝和Hep A腹水肝癌中K型丙酮酸激酶同工酶的比较研究

从正常小鼠肝和Hep A 腹水肝癌中纯化了K 型丙酮酸激酶(PyK)。当比较这两种不同来源的PyK 时,发现下列各项指标均极为接近或完全相同。这些指标是:1.在磷酸纤维素柱上被相近浓度的KCl 洗脱下来。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率完全一致,两者混合样品在不同的电泳条件下均不能分开。3.两酶在50℃保温时的失活速度基本相同,半失活时间均为11.5分。4.两酶的pH 活性曲线几乎完全重合,其最适pH 均为7.4。5.六种氨基酸中的每一种对两酶的抑制百分率十分接近。Mg~( )或丝氨酸对两酶的激活也基本一致。6.两酶对底物PEP 和ADP 均呈正协同别构效应,不论PEP 或ADP 的Hill 氏系数(η_H)S_(0.5)和K_(0.5s)也十两分接近。7.苯丙氨酸对两酶均呈别构抑制效应,其η_H或表观Ki 也基本相同。8.ATP 对酶均呈别构抑制效应,两酶的Hill 氏曲线互相平行,且几乎重合。(9)用葡聚糖G-200凝胶过滤法测得正常小鼠肝和Hep A 中K 型PyK 的分子量分别为224,000及210,000道尔顿,其差别在实验误差范围内。(10)用双相免疫扩散鉴定,两酶都能和兔抗大鼠M 型PyK 抗体起沉淀反应,且沉淀线完全吻合。总结上述结果,证明肝癌细胞中K-PyK 与正常小鼠肝脏中的K-PyK 具有相同的性质,表现相似的动力学,提示它们很可能具有相同的结构,也即可能是同一种酶。癌细胞的基因表达产物既与正常相同,说明癌细胞中PyK 同工酶活性的改变可能是由于基因调控的失常而不是结构基因本身DNA 中碱基顺序的改变。     

生物素标记核酸探针的分子杂交技术及其应用

核酸分子杂交是基于核酸链间互补碱基对的特异性结合,测定核酸碱基顺序同源性的一种现代技术,是基因工程、分子遗传及医学诊断中常用的方法。该法较常规诊断法灵敏度高、特异性强,目前,已广泛应用于重组DNA的筛选、基因分祈、染色体基因定位及病毒病诊断等方面。     

肝癌中丙酮酸激酶同工酶的研究——Ⅲ.正常小鼠肝和Hep A腹水肝癌中K型丙酮酸激酶同工酶的比较研究

从正常小鼠肝和Hep A腹水肝癌中纯化了K型丙酮酸激酶(PyK)。当比较这两种不同来源的PyK时,发现下列各项指标均极为接近或完全相同。这些指标是:1.在磷酸纤维素柱上被相近浓度的KC1洗脱下来。2.聚丙烯酰胺凝胶电泳迁移率完全一致,两者混合样品在不同的电泳条件下均不能分开。3.两酶在50℃保温时的失活速度基本相同,半失活时间均为11.5分。4.两酶的pH活性曲线几乎完全重合,其最适pH均为7.4。5.六种氨基酸中的每一种对两酶的抑制百分率十分接近。Mg~( )或丝氨酸对两酶的激活也基本一致。6.两酶对底物PEP和ADP均呈正协同别构效应,不论PEP或ADP的Hill氏系数(η_H)S_(0.5)和K_(0.5s)也十两分接近。7.苯丙氨酸对两酶均呈别构抑制效应,其η_H或表观Ki也基本相同。8.ATP对酶均呈别构抑制效应,两酶的Hill氏曲线互相平行,且几乎重合。(9)用葡聚糖G-200凝胶过滤法测得正常小鼠肝和Hep A中K型PyK的分子量分别为224,000及210,000道尔顿,其差别在实验误差范围内。(10)用双相免疫扩散鉴定,两酶都能和兔抗大鼠M型PyK抗体起沉淀反应,且沉淀线完全吻合。总结上述结果,证明肝癌细胞中K-PyK与正常小鼠肝脏中的K-PyK具有相同的性质,表现相似的动力学,提示它们很可能具有相同的结构,也即可能是同一种酶。癌细胞的基因表达产物既与正常相同,说明癌细胞中PyK同工酶活性的改变可能是由于基因调控的失常而不是结构基因本身DNA中碱基顺序的改变。     

DNA-膜固相核酸分子杂交技术及其应用

我们曾采用液相核酸分子杂交竞争抑制实验,比较了小鼠正常肝和小鼠腹水肝癌的细胞核RNA和细胞质RNA。液相核酸分子杂交技术具有其优点,如DNA-RNA杂交率比较高等,但也存在有不足之处,如变性DNA的自我“退火”,直接影响到DNA-RNA杂交分子的形成等。有鉴于此,我们又采用了Gillespie和Spie-gelman(1965年)的DNA-膜固相核酸分子杂交技术,分析比较了我所建立的二乙基亚硝     

Digoxigenin标记核酸探针分子杂交技术探讨

Dig标记和检测试剂盒中的封阻试剂配制成0.05%、0.1%、0.3%、0.5%、0.7%、0.9%六种浓度,65～68℃温度时,溶解时间分别为10、15、20、35、40、45分钟;预杂交,在免疫测定中进行封阻,背景反应最小,其次是不预杂交,在免疫测定中进行封阻,再次是预杂交,在免疫测定中不封阻;标记探针保存在-20℃,至少可稳定18个月,同一探针重复使用三次可获得满意效果.以上结果表明,DigDNA标记和检测系统将代替~(32)p标记及其检测系统.     

用于核酸分子杂交实验的电泳转移器

核酸分子杂交实验中需要把电泳分离的核酸区带转移到载体膜上。转移的方法有吸水纸法和电泳法。前者简便,但对大分子核酸效果较差,需时较长。后者效率与分子量无关,转移迅速,但实验设备稍复杂。目前,国际上电泳转移多用带铂电极的凝胶脱色器(亦有专用设备出售),转移时间1～6小时。我们在研究对一重氮苯砜乙基纤维素纸(DBSE纸)杂交法中自制了简单的电泳转移器,以不锈钢作电极,转移需时15分钟～1小时,效果满意。     

小鼠腹水型肝癌的核型分析

本文以几种分带Giemsa染色技术和Ag—As染色,分析小鼠腹水肝癌的核型。结果表明,小鼠腹水肝癌是一种近二倍体肿瘤,染色体众数为42—43,有标记染色体4—5条。2—3条染色体带有银染色阳性的核仁组织者,后者常出现在M1和M3两条标记染色体的次缢痕部位。     

简介核酸杂交技术在医学上的应用

近年,上海一家儿童医院应用引进的一种“人类凝血因子探针”,对一例血友病B高危孕妇进行产前诊断获得成功,使孕妇中止妊娠,从而防止了一名目前尚无理想治疗方法的血友病B患儿出生。应用基因探针的核酸杂交技术,虽然问世才十年光景,却已被誉为“二十世纪生物学一项重要成就”和“继罗、科赫(R.Koch)之后