探测植物病毒的DNA探针

以色列的Agriloab Biotechnology of Rehovot不久将向市场投放能够检测植物病毒的DNA探针。Agri-探针PV4能够检测马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、马铃薯卷叶病毒和马铃薯纺锤形块茎类病毒PSTV。目前的免疫测定法还不能测定出PSTV的存在。Agri-探针TYLCV可检测番茄黄曲叶病毒,一种由桔黄粉虱传播的病害。由于抗体不能有效的检测番茄黄曲叶病毒,所以该试验被认为是一种有意义的进展,植株的症状可应用于诊断中。Agrilab最近在Kiryat Weizmaan Scieace Park重新建立了一些实验     

分子生物学技术讲座（五）：放射性标记的DNA和RNA探针的制备

放射性标记的核酸探针（DNA和RNA探针）目前已被广泛地应用于分子生物学的各个领域,例如克隆的筛选,Southern杂交分析,基因表达水平的测定等等。放射性核酸分子探针是指特定的已知核酸分子片段,内含放射性核素（例：‘千、‘H和”S）,并能与被检测的核酸分子退火杂交（核酸序列互补）,因此可用于待测核酸样品中特定基因序列片段的探测。1探针的种类和选择根据核酸分子探针的来源及其性质可将其分成3大类,即：DNA探针、RNA探针和人工合成的寡聚核青酸探针。而DNA探针又可分为基因组DNA探针和。DNA探针。探针的选择是根据不…     

金秋梨和新高梨的分子遗传学对比分析

金秋梨和新高梨的形态性状、生物学性状以及酯酶同工酶、过氧化物酶同工酶、细胞色素氧化酶同工酶酶谱均产生了变化。利用异源DNA探针—小麦rDNA克隆pTA71,与四种核酸内切酶PstⅠ、BamHⅠ、EcoRⅠ及BglⅡ酶切消化的金秋梨和新高梨叶片总DNA杂交,结果表明,pTA71-PstⅠ和pTA71-BamHⅠ二种探针—酶组合可在金秋梨和新高梨中检测到RFLP差异。     

鹅源腺病毒基因组DNA物理图谱的构建

将鹅源腺病毒Y81G4株全基因组DNA的HindⅢ酶切片段分别插入质粒pUC18, 成功构建了全基因组DNA文库.在此基础上,将重组质粒携带的插入片段切出、回收并分别用地高辛标记后作为探针,与经限制酶BamHI、EcoRI、PstI、Eco RV消化的病毒基因组DNA进行Southern Blotting,杂交结果经比较综合后获得了该病毒基因组DNA的HindⅢ、Ba mH I、EcoR I、PstI、EcoR V限制性内切酶的物理图谱.利用已发表的含有鸡EDS76病毒AA-2 株基因组DNA右末端的重组质粒pBE42作为探针,与本病毒两末端重组质粒进行Southern Blo tting,根据同源性杂交结果确定了本病毒基因组DNA物理图谱与EDSVAA-2株相应的方向. 本病毒基础因组DNA物理图谱的精确构建,为进行基因组结构分析,筛选复制非必需区,构建禽腺病毒载体打下了基础.     

酶标DNA探针与Y染色体DNA的探测

 用辣根过氧化物酶标记DNA的技术,制备了酶标基因探针。研究了酶标过程和产物的电泳行为;用斑点杂交和southern印迹杂交探测了单链、双链DNA,灵敏度可达pg水平,以此酶标的Y染色体特异的DNA片段作探针,进行了DNA杂交的性别分析,证明该探针能清楚地区别两性基因组DNA,这对基因的研究和诊断有一定实用价值。     

支原体DNA探针诊断药

中外制药公司5月10日获准引进以美国Gen-Probe公司制造的支原体为对象的放射性(~(125)I标记)DNA探针诊断药.肺炎支原体DNA探针".这是继东的人乳头瘤病毒(HPV)、的乙型肝炎病毒的检查药之后被批准引进的第三种诊断试剂.预计作为体外诊断药9月份开始销售.     

无性繁殖病毒序列的非放射性检测

无性繁殖的Epstein-Barr病毒、疱疹病毒(Ⅰ和Ⅱ型)和B犁肝炎病毒序列,被用作研制Southern印迹上非放射性检测系统的模型。这些克隆用结合了生物素或麦芽三糖的2′-脱氧UTP-烯丙基胺进行缺口翻译。然后在无关的细胞DNA存在或不存在的情况下,让这些探针同上述病毒DNA的限制酶消化物的Southern印迹进行杂交。     

地高辛标记探针检测重组定点突变巴曲酶蛋白宿主DNA残留量的研究

目的 建立检测重组定点突变巴曲酶原液中外源性DNA残留量的方法.方法 从重组定点突变巴曲酶酵母工程菌提取基因组DNA作为模板,制备地高辛标记探针.此探针与样品进行点样杂交,并进行显色反应.结果 3批重组定点突变巴曲酶原液中,每人份剂量的宿主DNA残留量均＜10 ng.结论 该方法检测灵敏度较好,特异性较强,可用于重组定点突变巴曲酶的检测.     

水稻草矮病毒血清学和分子检测方法的比较

将间接ELISA、非放射性分子杂交和RT-PCR三种方法应用于水稻草矮病毒(RGSV)的检测.结果表明,利用自制的融合蛋白GST-NC的抗血清检测RGSV的灵敏度为1mg鲜重的病株叶片或84ng提纯病毒,利用地高辛(DIG)标记的DNA探针NC的点杂交方法检测RGSV的灵敏度为50μg病叶或6ng病毒,而RT-PCR的检测灵敏度则为10μg 病叶或2ng的病毒,对上述三种方法的灵敏度和可操作性也进行了比较.     

特异性探针的使用

<正>为了用特异性探针检测检样中病原体的DNA,有必要使DNA相互反应形成双链DNA。在检测双链DNA时,必须预先标记特异性探针。有同位素标记和非同位素标记两种方法。用同位素标记者,在反应后洗去未反应的探针,仅测定放射强度便可。(图1)用非同位素法标记的DNA,在反应后,使之与碱性磷酸酶(ALP),过氧化物酶、β—D半乳糖苷酶等结合,以酶抗体法的原理检测杂交的DNA(图2)。由于最近市售一种与ALP直 (图1)用游离法杂交     

用简化的微量方法分析EGF受体基因在培养细胞中的表达

利用放射性同位素标记的基因片段或cDNA探针进行核酸分子杂交是分析基因表达的有效手段。将细胞DNA或RNA样品经琼脂糖凝胶电泳分离后转移到硝酸纤维素膜上,然后与放射性探针杂交,即Southern印迹法和Northern印迹法已被普遍采用,为了简化操作,也常使用(Dot Blot)点印迹法。利用上述技术进行基因或基因产物分析时,首先需要从细胞分离、纯化RNA和DNA。如果需     

用于HBV病毒快速诊断的分子信标探针设计

分子信标是一种高灵敏度、高特异性的新型荧光核酸探针.它在与互补DNA或RNA靶序列杂交时放出荧光.利用Genebank中调出已知HBV病毒ayr亚型基因组信息,通过BeaconDesigner4.0软件进行分子信标探针设计,共设计出6条分子信标探针,以便于为目前HBV病毒快速诊断提供参考.     

用^32P标记cDNA探针进行核酸斑点杂交检测马铃薯卷叶病毒（PLRV）

利用克隆的马铃薯卷叶病毒（ＰＬＲＶ）外壳蛋白（ＣＰ）基因ｃＤＮＡ,用切口平移法制成＾３２Ｐ标记探针,通过核酸斑点杂交,对马铃薯卷叶病毒ＲＮＡ,提纯的马铃薯卷法病毒和感染ＰＬＲＶ的马铃薯茎、叶、声     

滚环复制技术的建立及在RNA病毒基因检测中的初步应用

滚环复制是噬菌体繁殖所采取的一种基因复制方式,这种方式可使单链的环形分子在聚合酶和引物的作用下进行体外自我扩增。本文中用可特异性连接环化的寡核苷酸链作为探针,分别进行了1份细胞培养的禽流感病毒H5N1亚型样品、1份细胞培养的SARS病毒样品和4份丙型肝炎病毒阳性血清样品的检测。检测原理是探针与靶序列杂交后便可在T4DNA连接酶的作用下形成滚环复制中的环化单链分子,该分子在同温下可被特异性引物滚动复制和支链扩增。本文还利用按禽流感病毒NA1基因区序列合成的模拟DNA分子对该检测方法的灵敏度进行了测试。结果显示：利用固相RCA技术成功检测到三种RNA病毒的基因,该方法的灵敏度可达到能检测10^3拷贝模式DNA分子的水平。与传统的PCR方法敏感性的比较尚待进一步研究。     

聚合酶链反应在兽医诊断病毒学中的应用

用直接或间接的诊断方法检测病毒感染。 所谓直接方法,即是检测样品中的病毒粒子或它们的某些成分,如:病毒核酸或病毒蛋白。最普通的常规直接诊断法是一种叫做‘黄金标准’的方法,包括:分离病毒并进行电镜观察、用抗原-ELISA检测病毒抗原、补体结合检测和免疫荧光测定、以及免疫过氧化物酶或过氧化物酶-免疫过氧化物酶染色法。     

开发检测支原体样植物病原体的探针

农林水产省国际农林水产业研究中心(JIRCAS)生物资源部研究员中岛一雄、该部主任研究官林隆治和泰国Khon Kaen大学、菲律宾国际水稻研究所(IRRI)的研究组开发了检测植物寄生性支原体样病原体(MLO)的DNA探针。开发该种探针还是第一次。 中岛等使用由于MLO侵染而患黄萎病的水稻、患叶化病的芝麻、患白叶病的甘蔗,从宿主植物DNA中分离出MLO的DNA。分别选患病植物DNA和与植物种特异反应的MLO DNA片段,用过氧化物酶标记,制作DNA探针获得成功。     

应用聚合酶链式反应扩增和光敏生物素标记的cDNA探针检测马铃薯纺锤块茎类病毒

以含马铃薯纺锤块茎类病毒(potato spindle tuber viroid,PSTV)RNA的总核酸为模板,加入人工合成的互补DNA引物,用反转录酶合成PSTV cDNA;在聚合酶链式反应系统中,用两个PSTV特异性引物进行cDNA扩增,用以制备光敏生物素标记的PSTV cDNA探针。用此探针进行斑点杂交检测含PSTV的马铃薯核酸提取液和汁液均出现阳性杂交信号,而健康马铃薯的核酸提取液和汁液的结果均为阴性。光敏生物素标记探针检测纯化PSTV的灵敏度可达5pg;检测感染PSTV的马铃薯块茎汁液的可测出最高稀释度为1:400。     

针对多种强致病性病毒的基因芯片检测方法的建立

为了制备灵敏的可检测多种烈性病毒性病原体的基因芯片,本研究设计了针对21种烈性病毒性病原体的基因芯片检测探针,每种5条,长50 bp.并以甲病毒属的基孔肯亚病毒和黄病毒属的黄热病毒细胞培养物为检测模型,摸索了合适的病毒基因处理与扩增方法.将提取的病毒RNA先用DNase Ⅰ处理,以去除掉其中的DNA分子,然后利用病毒属特异性引物进行反转录,以引导病毒基因组的合成,从而尽可能地减少宿主细胞基因成分的干扰.进行随机PCR扩增后将扩增产物与基因芯片进行杂交,分别出现了4条基孔肯亚病毒探针信号和5条黄热病毒的探针信号,说明所设计的检测探针具有较好的特异性,可用于这2种病毒的特异性检测.这种病毒基因样品的处理和扩增方法也为此基因芯片的临床应用奠定了基础.     

植物病毒检测芯片的杂交条件优化

利用芯片点样仪将5种侵染马铃薯的病毒/类病毒(苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、黄瓜花叶病毒-卫星病毒、马铃薯病毒Y、马铃薯块茎纺锤状类病毒)的保守区寡核苷酸(Oligonucleotide,oligo)探针和PCR探针点样于玻片,并以植物18S rRNA作为内参照制成基因芯片。研究探针浓度、杂交时间、杂交温度以及点样液对芯片杂交的影响,并验证优化后病毒检测芯片的特异性。结果表明,寡核苷酸探针浓度介于5-20 ?mol/L之间对杂交信号强度影响不大,PCR探针浓度与杂交信号强度间呈线性关系;在45℃杂交4 h时,芯片的杂交信号最强,且该条件下进行杂交对两种探针芯片的影响趋势一致;点样液中以DMSO的杂交效果最好。经过整体条件优化后的两种探针芯片在杂交检测上具有较高的特异性,适于检测植物病毒。     

亚洲小车蝗Oedaleus asiaticus痘病毒DNA探针的构建和初步应用(英文)

用限制性内切酶酶切亚洲小车蝗痘病毒DNA,将酶切后的DNA片断克隆到质粒pGEM—7zf( )中。用随机引物法标记克隆的外源亚洲小车蝗痘病毒DNA片断为探针。经Southern及斑点杂交证明此探针对新疆戟纹蝗Dociostaurus kraussi及微孢子虫Nosema locusstae有特异性,对新疆意大利蝗Calliptomus italicus无特异性。构建的探针可检测1ng亚洲小车蝗痘病毒DNA及10~2病毒包含体,也可检测感染病虫匀浆液中的痘病毒。