酵母3-脱氧葡糖醛酮代谢酶的分离纯化及部分性质

3-脱氧葡糖醛酮 ( 3- deoxyglucosone)是美拉德反应的主要中间产物 ,对生物体具有毒性作用 .用硫酸铵分部沉淀、DEAE- cellulose52、Hydroxyapatite、DEAE- Sepharose CL- 6B柱层析从酿酒酵母 YBr-M( S.cerevisiae YBr-M)抽提液中分离纯化了 3-脱氧葡糖醛酮代谢酶 (以 NADPH为辅酶 ) .该酶是单一的分子 ,分子量为 44k D,反应最适 p H为 7.0 ,p H6.0～ 8.0之间酶活性相对稳定 ,以 3-脱氧葡糖醛酮为底物的米氏常数 Km 为 2 .2 5mmol/ L.在 35℃以下保温 30 min酶活不变 ,50℃保温 30 min后酶活损失 50 % .该酶对二羰基化合物的活性较高 ,对单羰基化合物则较低 ,其催化作用受碘乙酸、N-乙基顺丁烯二酰亚胺的抑制 ,而被β-巯基乙醇、二硫苏糖醇激活 ,催化作用必须以 NADPH为专一辅酶 ,当用 NADH代替 NADPH时 ,活力只有 5.3% .     

产3-脱氧葡糖醛酮代谢酶微生物的研究*

从海洋细菌中筛选到一株产３－脱氧葡糖醛酮代谢酶活力较高的菌株Ｆｓ－４—Ｃ－３,并对其进行了最适产酶条件的研究。实验证明：以鱼肉蛋白胨为氮源、蔗糖为碳源,在培养基起始ｐＨ值为７．８～８．０,温度为２８℃,盐度为５％的情况下,培养９６ｈ,产酶最高。３－ＤＧ可以诱导产酶。     

细菌3—脱氧葡糖松还原酶产生菌及产酶条件

从１２株细菌菌株中筛选到一株产３－脱氧葡糖松还原酶的高产菌Ｂａｃｉｌｌｕｓｓｐ．２并研究了该菌株的产酶条件。在所试验的细菌中,３－脱氧警戒松氧化酶活性较低甚至检测不出,而还原酶活性普遍较高。     

细菌3-脱氧葡糖松还原酶产生面及产酶条件

从12株细菌菌株中筛选到一株产3-脱氧葡糖松还原酶的高产菌Bacillussp．2,并研究了该菌株的产酶条件。在所试验的细菌中,3-脱氧葡糖松氧化酶活性较低甚至检测不出,而还原酶活性普遍较高。该菌株最佳产酶条件为：培养基组成（％）：牛肉膏0．3,牛肉蛋白陈1．0,氯化钠0．5,0．5mmol／L3-脱氧葡糖松。培养基起始pH6．6,30℃振荡培养48h,产酶量最高,酶活力可达36．4u／g。3-脱氧葡糖松对产酶有诱导作用,而甲基乙二醛对产酶有抑制作用。     

海洋细菌Bacillus sp.2-羰基还原酶的纯化和性质

从一株海洋细菌Bacillussp .中通过硫酸铵分级盐析、QSepharoseFF阴离子交换层析、Hydroxyapatite柱层析和SephadexG 1 0 0凝胶过滤 ,分离纯化出一种 3 脱氧葡糖醛酮代谢酶 ,定性为 2 羰基醛还原酶。以粗酶液作起始 ,所获样品纯度提高 1 41 4倍 ,活力回收率 1 1 4%。 2 羰基醛化合物对该酶是特异性很好的底物 ,该酶对 3 脱氧葡糖醛酮的Km为 2 5mmol L ,分子量约为 33kD ,反应最适pH为 6 2 ,在pH5 0～ 8 0 ,温度 30℃以下酶活保持稳定。适量的ED TA、巯基乙醇或二硫苏糖醇能提高酶的活性 ,碘乙酸、N 乙基顺丁烯二酰亚胺均造成酶部分失活。     

3-脱氧葡糖松代谢酶产生菌的筛选及产酶条件

从霉菌和酵母中筛选到一株酵母（Saccharomycescerevisiae231）,该菌株具有能够代谢3-脱氧葡糖松（3－deoxyglucosone）的酶,且活性较高。研究了该菌株的最适产酶条件：培养温度28℃,培养基起始pH7.0,培养时间12h,碳源、氮源分别为蔗糖、牛肉膏,添加KH₂PO₄、Ca（H₂PO₄）₂·H₂O能促进产酶。     

海洋细菌Bacillus sp.2—羧基还原酶的纯化和性质

从一株海洋细菌Bacillus sp,中通过硫酸铵分级盐析,Q Sepharose FF阴离子交换层析,Hydroxyapatite柱层析和Sephadex G-100凝胶过滤,分离纯化出一种3－脱氧]葡糖醛酮代谢酶,定性为2－羧基醛还原酶,以粗酶液作起始,所获样品纯度提高141．4倍,活力回收率11．4％,2－羧基醛化合物对酶是特异性很好的底物,该酶对3－脱氧葡糖醛酮的Km和2.5mmol/L,分子量约为33kD,反应最适pH为6．2,在pH5．0－8．0,温度30℃以下酶活保持稳定,适量的ED－TA,巯基乙醇或二硫苏糖醇能提高酶的活性,碘乙酸,N-乙基顺丁烯二酰亚胺均造成酶部分失活。     

产3—脱氧葡糖醛酮代谢酶微生物的研究

从海洋细菌中筛选到一株产３－脱氧葡糖醛酮代谢酶活力较高的菌株Ｆｓ－４－Ｃ－３,并对其进行了最适产酶条件的研究。实验证明：以鱼肉蛋白胨为氮源、蔗糖为碳源,在培养基起始ｐＨ值为７．８～８．０,温度为２８℃,盐度为５％的情况下,培养９６ｈ,产酶最高,３－ＤＧ可以诱导产酶。     

3—脱氧铺糖松代谢酶产生菌的筛选及产酶条件

从霉菌和酵母中筛选到一株酵母,该菌株具有能够代谢３－脱氧葡糖松的酶,且活性较高,研究了该菌株的最适产酶条件：培养温度２８℃,培养基起的ＰＨ７．０,培养时间１２ｈ,氮源分别为蔗糖,牛肉膏、添加ＫＨ２ＰＯ４、Ｃａ（Ｈ２ＰＯ４）２,Ｈ２Ｏ能促进产酶。     

链霉菌C-3662产生的纤溶活性蛋白酶的纯化与理化性质

 从链霉菌 C- 3662发酵上清液中 ,通过硫酸铵沉淀 ,CM- Sepharose Fast Flow和 Phenyl-Sepharose Fast Flow等层析色谱 ,分离纯化得到了具有纤溶活性的蛋白酶 CGW- 3,反向 HPLC鉴定纯度为 90 % ;每立升发酵上清液可得到 8mg纯品 ,活性回收率 46% ,CGW- 3为一单肽链蛋白 ,分子量 2 2 72 1 ,对丝氨酸蛋白酶抑制剂 PMSF敏感 ,对 EDTA不敏感 ;其 N端 1 5个氨基酸的顺序为 VVGGTRAAQGEFPFM,与微生物来源的胰蛋白酶类丝氨酸蛋白酶有较高的同源性 . CGW- 3的等电点 p I9.0 ,纤溶活性的最适 p H为 7.5～ 8.0 ,对温度比较敏感 .CGW- 3不仅具有直接降解纤维蛋白作用 ,而且能够激活纤溶酶原     

蚯蚓两种抗菌肽的分离纯化及部分性质

经硫酸铵沉淀、超滤、阳离子交换分离和反相快速蛋白质液相色谱（FPLC）分析,得到了两种新的蚯蚓抗菌肽F-1与F-2,经电喷雾离子源质谱（ESI-MS）测定,其相对分子质量为535.27和519.27.串联质谱（MS/MS）数据表明F-1的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Ser-Ser,F-2的肽序列为Ac-Ala-Met-Val-Gly-Thr.最小抑菌浓度（MIC）实验表明,F-1与F-2对鹑鸡肠球菌(Enterococcus gallinarum)、绿脓杆菌(Pseudomonas pyocyanea)、鲍氏不动杆菌(Acinetobacter baumanii)、土生克雷伯氏菌（Klebsiella terrigena）的最小抑菌浓度分别为11.4 mg/L和12.85 mg/L,对粪肠球菌(Enterococcus faecalis)的最小抑菌浓度分别为22.8 mg/L和25.68 mg/L.对真菌白色念株菌（Candida albicans）没有表现为完全的抑制作用.     

灰树花中一种抗烟草花叶病毒的蛋白质的纯化及其性质

通过硫酸铵分级沉淀、阴离子交换柱层析及凝胶过滤柱层析,从灰树花子实体中分离到了一种具有抑制烟草花叶病毒（TMV）侵染活性的热稳定蛋白——GFAP.经常规凝胶电泳和等电聚焦电泳显示为单一条带,而SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳结果证明该蛋白质含有两个亚基,其分子质量分别为34 ku、40 ku.等电聚焦测定蛋白质pI为3.76,含糖量约为2%.GFAP的40 ku条带N端氨基酸序列为ACCVPSVTEFENAINSDPVM,将其与GenBank中的氨基酸序列检索比较后没有发现同源序列,预示可能为一新的氨基酸序列.GFAP与TMV混合接种心叶烟,当GFAP浓度为32 mg/L时即可完全抑制浓度为10 mg/L的TMV的侵染,而4 mg/L的GFAP对浓度为40 mg/L的TMV的抑制率仍可达60%以上.     

A Novel Metalloproteinase,Almelysin, from a Marine Bacterium,Alteromonas sp. No. 3696: Purification and Characterization

We have discovered a novel metalloproteinase, which has high activity at low temperatures, from the culture supernatant of a marine bacterium. The strain was identified as Alteromonas sp. No. 3696. The metalloproteinase, named almelysin, was purified to homogeneity from the cultured supernatant at 10°C by two column chromatographies. About 20 mg of purified almelysin was obtained from 18.4 liters of the culture supernatant. The molecular mass of almelysin was estimated to be 28 kDa by SDS–PAGE and the isoelectric point was 4.3. The optimum pH for activity of almelysin was pH 8.5–9.0 and 6.5 using casein and (7-methoxycoumarin-4-yl)acetyl(MOCAc)-Pro-Leu-Gly-Leu-(N³-[2,4-dinitrophenyl]-L-2,3-di-aminopropionyl)[A₂pr(Dnp)]-Ala-Arg-NH₂ as substrates, respectively. Almelysin was stable between pH 7.5–8.0 and below 40°C. The optimum temperature for the activity was observed to be 40°C using both casein and MOCAc-Pro-Leu-Gly-Leu-A₂pr(Dnp)-Ala-Arg-NH₂ as substrates. The activity of almelysin was inhibited by such metallo chelators as EDTA and o-phenanthroline, while talopeptin, phosphoramidon, and SMPI, typical metalloproteinase inhibitors, had no effect. Almelysin primarily cleaved the Ala¹⁴-Leu¹⁵ bond and Phe²⁴-Phe²⁵ bond, and secondarily the Tyr¹⁶-Leu¹⁷ bond in oxidized insulin B-chain. However, almelysin could not cleave the His⁵-Leu⁶, His¹⁰-Leu¹¹, and Gly²³-Phe²⁴ bonds, which were cleaved by other metalloproteinases. These results indicate that the substrate specificity of almelysin is different from other metalloproteinases. Interestingly, Alteromonas sp. No. 3696 strain produced another proteinase as well as almelysin at 25°C.     

大连蛇岛蝮蛇类凝血酶基因在毕赤酵母中的克隆表达及分离纯化(英)

根据同源性分析设计引物,通过RT-PCR方法从大连蛇岛蝮蛇毒腺总RNA中合成扩增出类凝血酶基因,之后将该基因克隆到表达载体pPIC9K中,经电激转化后整合至毕赤酵母细胞基因组中.经筛选得到甲醇快速生长型转化子His⁺Mut⁺在500 ml摇瓶中培养,甲醇诱导分泌表达.上清液中重组类凝血酶是通过两步柱层析得到：Q Sepharose FF和Benzamidine-Sepharose 4BCL.与天然蛇毒类凝血酶一致,分泌表达的重组类凝血酶具有较强的酯酶活性,但精氨酸甲酯如TAME的水解活性较弱.此重组类凝血酶在37℃中性溶液中保存过夜将分解成小肽,但在0℃下很稳定.该酶的最适pH为8.0.     

黑曲霉F044脂肪酶的分离纯化及酶学性质研究

黑曲霉F044脂肪酶发酵上清液经硫酸铵沉淀、透析、DEAESepharoseFastFlow阴离子交换层析和SephadexG-75凝胶过滤层析得到电泳纯的脂肪酶,纯化倍数为73·71倍,活性回收率为34%。对纯化脂肪酶性质研究表明:该脂肪酶分子量约为35~40kD,水解橄榄油的最适温度和最适pH分别为45℃和7·0,在60℃以下和pH2·0~9·0之间有很好的稳定性。该脂肪酶的水解活性对Ca2 表现明显的依赖性,而Mn2 、Fe2 和Zn2 对脂肪酶则有显著的抑制作用。在最适条件下水解pNPP的Km和Vmax分别为7·37mmol/L和25·91μmol/(min·mg)。其N-端的15个氨基酸序列为Ser(Glu/His)-Val-Ser-Thr-Ser-Thr-Leu-Asp-Glu-Leu-Gln-Leu-Phe-Ala-Gln。     

Purification of xylanase from alkaliphilic Bacillus sp. K-8 by using corn husk column

The objective of this work was to apply low cost materials, agricultural residues, to the purification of xylanase. The results showed that crude extracellular, cellulase-free xylanase of an alkaliphilic Bacillus sp. strain K-8 could be purified in a single step by affinity adsorption–desorption on a corn husk column using a high flow rate, under the conditions 25 mM acetate buffer, pH 4.0, 4 °C, which prevented the hydrolysis of xylan by xylanase. After adsorption, the xylanase was eluted from the enzyme–corn husk complex with 500 mM Urea. The enzyme was purified 5.3-fold to homogeneity from culture supernatant. The molecular weight of the purified enzyme was 24 kDa as determined by sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE). The specific activity and recovery yield after purification were 25.4 U/mg protein and 42.3%, respectively.     

Bacillus sp.ZJS3基因组测序及砷胁迫下相关基因表达分析

【背景】环境中高毒性As³⁺的微生物氧化在砷的生物地球化学循环中起重要作用,具有潜在的应用价值。【目的】Bacillus sp.ZJS3菌株是本实验室前期分离鉴定的一株As³⁺耐受菌株,而且对多种重金属具有耐受性,期望进一步明确该菌株在As³⁺胁迫下菌体形态变化及应对砷胁迫的遗传基础,为As³⁺耐受细菌的研究提供基础数据。【方法】使用单分子实时测序（single-molecule real-time sequencing,SMRT）及Illumina测序技术对Bacillus sp.ZJS3菌株进行全基因组测序,对其基因进行功能注释和生物信息学分析,并结合绝对定量PCR技术对砷抗性及砷代谢相关基因进行分析。【结果】Bacillus sp.ZJS3菌株基因组大小为5.82 Mb,GC含量为35.9%,包含染色体1个、质粒3个、CDS数量为5 981个、tRNA 104个、sRNA 136个、rRNA 42个、串联重复序列173个、基因岛13个、转运蛋白1 023个、跨膜蛋白1 717个和双组分调控基因160个。NR、Swiss-Prot、Pfam、COG、GO和KEGG数据库分别可注释Bacillus sp.ZJS3菌株基因组中97.66%、69.30%、78.52%、65.49%、67.65%和43.87%的基因。绝对定量PCR结果表明,arsC基因在砷处理条件下显著高于对照组,而arsB基因在砷处理条件下显著低于对照组。【结论】Bacillus sp.ZJS3菌株在As³⁺胁迫下可能导致细胞分裂无法正常进行,进而影响细胞形态。基因组中aqpZ、arsA、arsB、arsC等基因的存在表明该菌株具有As³⁺外排和还原As⁵⁺的能力,phoUpstBACS的存在表明菌株可以吸收As⁵⁺,但菌株受到外界环境As³⁺胁迫时arsB表达水平降低。     

海洋弧菌褐藻胶裂解酶的分离纯化及性质

从海带糜烂物中分离到一株高产胞外褐藻胶裂解酶的海洋弧菌 (Vibriosp .QY10 1) ,利用硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等方法从发酵液中分离纯化了褐藻胶裂解酶 (alginatelyase)。SDS PAGE电泳结果表明 ,该酶分子量为 39kD。酶反应最适pH为 7.5 ,最适反应温度为 30℃。Na 、Ca2 、Mn2 对酶活性有促进作用 ,Fe2 、Ni2 以及EDTA对酶活性有抑制作用。酶的底物专一性初步分析结果表明 ,该酶具有降解多聚古罗糖醛酸[poly(G) ]及多聚甘露糖醛酸 [poly(M) ]的活性。