巨桉BRI1基因的克隆和表达分析

为了解BRI1基因在巨桉中的功能,采用PCR技术克隆了EgrBRI1基因,分析了EgrBRI1的生物信息学和亚细胞定位,并对EgrBRI1基因响应激素和胁迫的差异表达进行了分析。结果表明,EgrBRI1基因全长3 893 bp,编码1 197个氨基酸。EgrBRI1蛋白稳定,空间结构复杂,存在3个motifs,主要定位于细胞膜。茉莉酸甲酯和油菜素内酯(BR)处理后,EgrBRI1基因在叶片中的表达上升,而水杨酸处理则没有明显的变化。盐胁迫和冷胁迫下,EgrBRI1基因表达表现为先下降后上升的趋势。因此,EgrBRI1基因能快速对外施激素做出响应,并在巨桉抗逆方面发挥重要作用,这可能是通过对BR信号的响应来实现的。     

紫花苜蓿MsCIPK8基因的克隆与表达分析

CIPK是植物中一类丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,在植物响应逆境胁迫中发挥着重要的作用。本研究根据盐碱胁迫下紫花苜蓿(Medicago sativa L.)转录组数据设计引物,通过RT-PCR克隆获得紫花苜蓿MsCIPK8基因,该基因CDS全长1341bp,编码446个氨基酸,编码蛋白相对分子质量50.73 kD,等电点6.72,具有CIPKS家族蛋白所特有的N端激酶域和C端NAF/FISL结构域。生物信息学分析结果显示,MsCIPK8为可溶性蛋白,二级结构多为无规矩卷曲;系统进化分析表明,紫花苜蓿MsCIPK8与蒺藜苜蓿(Medicago truncatula Gaertn.)MtCIPK8亲缘关系最近。两个蛋白序列比对发现存在4个差异位点,其中3个在保守结构域内。MsCIPK8在低温、干旱、盐和盐碱胁迫下表达量均受到诱导上调表达。低温胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量分别在12 h和3 h达到峰值;盐胁迫下,MsCIPK8在根中的表达量12 h达到峰值;盐碱胁迫下,根和叶中MsCIPK8的表达量在12 h后持续高表达;干旱胁迫下,MsCIPK8在根和叶中的表达量在12 h均达到峰值。上述结果表明MsCIPK8参与紫花苜蓿对干旱、低温、盐和盐碱等非生物胁迫的应答。     

巨桉EgrGBF1基因的克隆和表达模式分析

G-box结合蛋白(GBF)是一类能够识别并结合G-box的转录因子,广泛参与植物基因响应外界刺激的表达调控。通过巨桉(Eucalyptus grandis)初生生长到次生生长的转录组测序筛选出差异表达基因EgrGBF1,为探讨其在桉树生长发育中的功能,从巨桉中克隆了该基因,并进行了结构和进化分析。结果表明,EgrGBF1编码区长度为984 bp,编码327个氨基酸, 存在2个转录本,分别命名为EgrGBF1α和EgrGBF1β。实时荧光定量PCR结果表明,EgrGBF1α和EgrGBF1β在不同组织中,不同激素、胁迫处理下的表达模式不同,EgrGBF1α主要在茎尖表达,沿节间向下表达量逐渐降低,而EgrGBF1β在韧皮部高表达,在节间的表达量无显著差异。在水杨酸和缺硼处理下,EgrGBF1α和EgrGBF1β的表达趋势相反。EgrGBF1α在缺磷处理168 h的表达量最高,而EgrGBF1β在处理6 h的表达量最高。因此,EgrGBF1在桉树生长发育以及响应胁迫中发挥着重要作用,且转录本EgrGBF1α和EgrGBF1β可能具有不同的功能。     

地黄扩展蛋白基因RgExpA1的克隆与表达分析

采用RT-PCR方法对9个地黄扩展蛋白基因在地黄不同组织器官、不同发育时期的表达特点进行了分析,在此基础上用RACE方法克隆了主要在根中表达的RgExpA1基因的全长,并对该基因编码氨基酸的功能位点、拼接方式以及与同源基因的进化关系作了初步分析。     

植物甜蛋白brazzein基因的克隆与表达

根据大肠杆菌偏爱的密码子,利用PCR技术体外人工合成brazzein cDNA序列,并将其克隆至原核高效表达载体pET30a( )中。重组载体pET30a( )-brazzein转化至大肠杆菌BL21(DE3)中,经IPTG诱导后,SDS-PAGE结果证明pET30a( )-brazzein在大肠杆菌中获得高效表达,目的蛋白占总菌体蛋白25％左右。     

尾巨桉HMGR基因的克隆及表达分析

基于RACE技术克隆得到尾巨桉3-羟基-3-甲基戊二酰CoA还原酶(EuHMGR)基因全长为1955bp,包含1560bp的开放阅读框(ORF),编码519个氨基酸。生物信息学分析表明EuHMGR包含两个HMG-CoA结合基序和两个NADP(H)结合基序;同源建模得到EuHMGR三维构象呈"V"型,包含N-结构域、S-结构域和L-结构域。将EuHMGR组DNA与cDNA序列进行比对表明EuHMGR存在一个319bp的内含子。通过实时定量PCR进行组织特异性表达分析表明EuHMGR在茎中的表达量最高,叶次之,在根中基本无表达。该研究为后续尾巨桉EuHMGR的功能验证以及遗传转化奠定基础。     

水稻C2H2型锌指蛋白基因RZF71的克隆与表达分析

利用生物信息学和RT-PCR方法从水稻幼苗组织中分离了1个新的C2H2型锌指蛋白基因RZF71, 该基因编码一条250个氨基酸残基的多肽, 含有两个典型的C2H2型锌指结构。半定量RT-PCR分析表明: RZF71在根、茎、叶和幼穗中呈组成性表达, 在根中的表达丰度略高; 在高盐和PEG6000胁迫的水稻幼苗组织中, RZF71的表达显著增强, 但低温和ABA处理对该基因的表达量影响不大。农杆菌介导的洋葱表皮细胞GFP瞬时表达实验表明: RZF71定位于细胞核内。讨论了RZF71可能作为一个转录调控因子在水稻耐高盐和渗透胁迫中的作用。     

烟草磷转运蛋白基因NtPHT2;1的克隆和表达分析

植物对磷酸盐的吸收与利用主要依靠磷转运蛋白,其中PHT2家族编码的低亲和磷转运蛋白主要负责植物在正常供磷条件下磷酸盐的吸收、转运与再利用。为了探究低亲和磷转运蛋白基因NtPHT2;1在烟草转运磷酸盐中的作用和表达模式,本研究以普通烟草K326的cDNA为模板,克隆得到NtPHT2;1,对该基因进行生物信息学分析和蛋白质的亚细胞定位,并通过荧光定量PCR技术对该基因在低磷等非生物胁迫下的基因表达模式进行分析。结果表明：（1）NtPHT2;1基因的全长为1 764 bp,编码587个氨基酸。（2）亚细胞定位结果表明,NtPHT2;1蛋白定位于叶绿体上。（3）同源性比对发现,NtPHT2;1蛋白与辣椒CaPHT2;1蛋白的同源性最高达到91.00%。（4）启动子分析表明,NtPHT2;1启动子含有参与调控植物衰老、逆境胁迫相关的顺式作用元件。（5）组织表达模式分析表明,NtPHT2;1在叶片中的表达量最高,新叶中的表达量比老叶中的高;在低磷诱导条件下,该基因的表达量与正常条件相比差异不显著。（6）不同非生物胁迫下的表达模式表明,在盐胁迫和干旱胁迫下,该基因的表达量显著降低。研究认为,NtPHT2;1基因主要是负责烟株正常生长发育条件下磷酸盐的转运与利用。     

香蕉胁迫相关蛋白基因的克隆及其表达分析

通过随机克隆测序的方法从香蕉根系cDNA文库中获得胁迫相关蛋白基因,命名为MaSAP1(GenBank登录号为AGH14257.1)。扩增获得的cDNA序列与质粒OZ092的目的片段序列一致,表明MaSAP1是香蕉SAP基因编码框全长cDNA,包含一个510bp的最大开放阅读框,编码一个长169个氨基酸的蛋白质。蛋白质序列同源比对发现其含有完整的A20和AN1基序结构。系统进化树比对分析表明,MaSAP1与水稻和獐茅的亲缘关系较近。组织特异性研究表明,MaSAP1基因在香蕉根和果实中的表达量较高,在茎中的表达量最低。实时荧光定量PCR分析表明MaSAP1响应激素的处理,同时也响应干旱、低温、高盐和枯萎病菌的侵染等胁迫。可见,MaSAP1基因在植物生长发育和植物响应逆境中具有重要作用。     

巨桉EgrWAT1基因克隆和功能初步分析

为探究WALLS ARE THIN (WAT1)在木本植物中木材形成以及响应胁迫中的作用,利用生物信息学工具进行分析,并以巨桉（Eucalyptus grandis）为材料克隆EgrWAT1S及其另一转录本EgrWAT1L,通过实时荧光定量PCR(qRT-PCR)探究其在不同组织、节间以及响应胁迫时的表达模式。结果表明：EgrWAT1S在韧皮部表达量较高,而EgrWAT1L主要表达在根部。在茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）处理和盐胁迫以及缺磷、缺硼处理时,其表达存在着明显不同的模式,在MeJA、SA处理时甚至存在着相反的表达模式。这些结果表明EgrWAT1L基因可能通过转录调控来影响EgrWAT1S表达和进一步的蛋白翻译来响应激素和胁迫处理。为进一步研究WAT1基因在巨桉生长发育过程中的作用和调控方式提供基础,也为将来桉树的分子育种提供可能。     

不同施氮水平对巨桉幼树耐旱生理特征的影响

采用盆栽方法,研究了巨桉幼树在N0(不施氮)、N1(1.4g尿素·盆-1)、N2(2.8g尿素·盆-1)3个氮处理水平下,连续干旱不同时间[分别停水0(D0)、3、6、9、12、15、18d]时巨桉的生理响应。结果显示:(1)除D0外,试验期内N1和N2处理的巨桉叶片含水量(LWC)、叶片相对含水量(LRWC)和叶片保水力(LWHC)基本低于N0水平,尤其在干旱中期最为明显,表明在干旱胁迫前施氮可能对巨桉叶片水分生理产生负面作用。(2)干旱初期,氮处理间的可溶性蛋白(SP)和可溶性糖(SS)含量的差异不大,而干旱处理后期(9~18d),N0处理的SP和SS较初期明显增加,但N1和N2处理相对于N0变化较为平缓,表明施氮不利于SP和SS积累;N1和N2处理下脯氨酸(Pro)含量的增幅随着干旱胁迫时间的延长明显大于N0处理。(3)随干旱时间延长干旱程度加重,N1、N2处理巨桉叶片过氧化氢(H2O2)和丙二醛(MDA)含量明显高于N0处理,表明施氮使得巨桉在干旱条件下水分缺乏更为严重,产生更多的活性氧(ROS)。(4)整个干旱处理期内,施氮并未显著改变巨桉的超氧化物歧化酶(SOD)活性和抗坏血酸(AsA)含量,但N1和N2的过氧化物酶(POD)活性明显高于N0。(5)施氮增加了巨桉叶片的色素含量并在干旱初期和中期保持较高水平,在干旱初期(0~3d)增加了巨桉叶片的净光合速率(Pn),但随着干旱时间的延长而迅速下降;施氮(N1、N2)的蒸腾速率(Tr)和气孔导度(Gs)在干旱初期均显著小于N0,但在干旱中后期(6d以后)各处理间差异不显著且均处于极低水平。研究表明,水分充足时施氮有助于增强巨桉的光合同化能力,促进其生长,但遇到持续干旱时施氮更易面临水分亏缺,降低其抵抗干旱的能力,因此在巨桉人工林的经营管理过程中,不应在干旱或季节性干旱即将到来之前施氮,若干旱过程中需施氮则应采取灌溉等途径保证其充足的水分供应。     

赤桉ACT1和ACT2基因的克隆与生物信息学分析

为了解赤桉(Eucalyptus camaldulensis)肌动蛋白(Actin)在生长发育过程中的功能,根据赤桉幼苗转录组数据库中的肌动蛋白基因序列,从赤桉嫩叶中克隆了2条Actin基因片段,并利用RACE技术获得Actin基因的全长cDNA,分别命名为ECACT1和EC-ACT2基因。生物信息学分析表明,这两条基因的全长cDNA分别为1533 bp和1387 bp,均含有1个编码377个氨基酸的开放阅读框。经比对分析,赤桉Actin蛋白的氨基酸序列与其他植物Actin蛋白的具有较高的相似性,并且具有Actin蛋白特有的保守序列和相关特征。因此推测这两条基因对桉树的生长发育具有一定的调控作用。     

巨桉种源/家系综合选择研究

为选择巨桉(Eucalyptus grandis)优良种源,对其13个种源177个家系性状进行遗传分析。结果表明,22月生巨桉除生长量在区组间差异显著外,其他性状在种源、家系和区组间均存在极显著的差异;50月生时各性状差异均达极显著水平。50月生时,单株材积位于前四的种源分别是2号(来自昆士兰州Copperlode)、3号(来自昆士兰州Ravenshoe)、1号(来自昆士兰州N W Townsille)和11号(来自四川省黑龙滩)。50月生时,有78个家系的单株材积增长量超过总体家系平均值(0.08 m3),位于前三的家系是分别为2号(来自2号种源)、156号(来自福建天马东溪的10号种源)和93号(来自昆士兰州Bambaroo的8号种源)。50月生巨桉的胸径、树高、单株材积、干形、分枝和冠幅的遗传力分别为0.56、0.91、0.73、0.67、0.64和0.76;这些性状的表型变异系数分别为26.64%、29.37%、64.41%、17.58%、15.26%和45.80%;遗传变异系数分别为25.94%、24.30%、60.97%、28.59%、26.07%和42.96%。相关性分析表明,冠幅和分枝呈较小的负相关,其余各性状间均呈正相关性。结合生长指标和形质指标,最终筛选出4个优良种源和18个优良家系。     

滇南亚高山巨桉种源/家系变异及早期选择研究

为筛选滇南亚高山的巨桉(Eucalyptus grandis)优良品系,对53月生的巨桉11种源173家系的生长性状进行分析。结果表明,所有生长性状在种源和家系间均呈极显著差异;胸径、树高、单株材积、干形、分枝和冠幅的表型和遗传变异系数分别为26.90%~28.84%、23.84%~25.28%、62.34~67.55、13.04%~25.62%、13.04%~25.41%和35.07~39.93,各性状种源遗传力为0.94~0.96,家系遗传力为0.88~0.95。相关分析表明,胸径与树高、单株材积、干形和冠幅呈极显著正相关,树高与其他性状均呈极显著正相关关系,干形与分枝的相关系数为0.70,冠幅与干形和分枝均呈负相关关系(r2=-0.03)。单株材积的遗传增益始终最大,以5%为入选率时,遗传增益高达66.11%;入选率不同,胸径与树高、干形与分枝的遗传增益的变化趋势基本相同,但不同性状的遗传增益值的排序发生变化。以10%为入选率,经综合指数选择有17个家系入选,均来自1号(昆士兰Copperlode)、4号(昆士兰Koombooloomba)、6号(昆士兰Copperlode Falls Dam)、7号(昆士兰Bambaroo)、9号(福建天马东溪)和11号(四川乐山)种源,2号(昆士兰Ravenshoe)和8号(昆士兰Tully Gorge National Park)种源表现最差,排前6名的家系为289号、283号、2号、42号、121号和82号,也分别分布在入选种源中,说明入选家系不仅生长优良而且遗传多样性比较丰富。     

马尾松PmPGK1和PmGPIC基因的克隆和表达分析

为了解马尾松（Pinus massoniana）磷酸甘油酸激酶1（PGK1）与胞质溶胶葡萄糖磷酸异构酶（GPIC）的功能，采用RACE技术克隆了PmPGK1和PmGPIC基因，并进行了生物信息学分析与亚细胞定位，采用实时荧光定量PCR技术分析PmPGK1和PmGPIC的表达特性。结果表明，PmPGK1和PmGPIC全长为2 106和1 848 bp，分别编码507和566个氨基酸。PmPGK1和PmGPIC分别定位于叶绿体和胞质溶胶。PmPGK1表达量为新叶 > 老叶 > 新茎 > 根 > 花；而PmGPIC为老叶 > 花 > 新叶 > 新茎 > 根。低温胁迫24 h，PmPGK1和PmGPIC的表达量均随时间延长先降低后升高，且PmGPIC的表达量在处理2 h后即降至较低水平；高浓度CO₂胁迫24 h，PmPGK1的表达量随时间延长呈降低-升高-再降低的变化趋势，PmGPIC的表达下调但变化较不显著。因此，推测PmPGK1主要参与卡尔文循环及叶绿体/质体糖酵解，PmGPIC主要参与细胞质基质糖酵解；PmPGK1、PmGPIC活性在低温胁迫下均受抑制；PmPGK1活性在CO₂胁迫下受到显著抑制，而PmGPIC活性的影响不大。     

丛枝菌根真菌响应桉树茄科雷尔氏菌侵染进程基因的筛选与鉴定

【背景】桉树(Eucalyptus)青枯病危害严重,丛枝菌根真菌(arbuscular mycorrhizal fungi,AMF)与桉树共生影响桉树对青枯病的抗性,而AMF响应桉树青枯菌侵染的机制仍不清楚。【目的】探索AMF响应桉树茄科雷尔氏菌(Ralstonia solanacearum)的侵染机制。【方法】以非菌根化和异形根孢囊霉(Rhizophagus irregularis)菌根化巨桉(Eucalyptus grandis)分别受茄科雷尔氏菌侵染0、24、48和96 h接种后(hour post-inoculated, hpi)的根系组织为研究对象,基于转录组测序筛选和鉴定菌根化巨桉根系中异形根孢囊霉响应茄科雷尔氏菌侵染的基因信息。【结果】与对应非菌根化桉树受茄科雷尔氏菌侵染的时间点相比,菌根化桉树中异形根孢囊霉响应青枯菌侵染显著差异表达基因为3 382–5 989个,随青枯侵染时间进程的增加,异形根孢囊霉特异性响应茄科雷尔氏菌侵染差异表达基因数量逐渐增多。茄科雷尔氏菌侵染24 hpi时,异形根孢囊霉显著富集共生体生长、孢子形成和凋亡信号通路、铁载体等相关基因;茄科雷尔氏菌侵...     

巨桉和天竺桂幼树对不同浓度SO2的光合生理响应

二氧化硫是大气主要污染物之一,可对植物的关键生理过程光合作用产生重要影响。利用密闭环境控制室熏气处理,研究不同浓度(自然状态下浓度、0.5mg·L-1、1.5mg·L-1、3.0mg·L-1)SO2对盆栽巨桉和天竺桂幼树叶绿素含量、光响应曲线、光合特征参数、光合日变化及硫含量的影响。结果表明:(1)SO2胁迫显著减少了巨桉叶绿素a、b含量,且叶绿素a/b值显著降低,而天竺桂在SO2胁迫下叶绿素a、b含量显著增加,叶绿素a/b值无显著影响。(2)SO2胁迫显著抑制了两树种的净光合速率(Pn);在SO2胁迫下巨桉气孔导度(Gs)、胞间CO2浓度(Ci)和蒸腾速率(Tr)显著上升,而天竺桂的Gs和Tr显著被SO2抑制,Ci随SO2浓度的增加先升高后降低。(3)巨桉表观量子效率(AQY)、暗呼吸速率(Rd)、光补偿点(LCP)和光饱和点(LSP)及天竺桂Rd和LCP均随着SO2浓度的增加而先升高后降低,而天竺桂的AQY和LSP逐渐降低。(4)一天中,SO2胁迫显著提高了巨桉Pn、Gs和Tr,而对天竺桂Pn无显著影响,较低浓度SO2胁迫显著促进了天竺桂Gs和Tr,高浓度SO2胁迫则显著抑制其Gs和Tr;SO2胁迫显著抑制了两种植物的Ci。(5)SO2胁迫下,巨桉和天竺桂幼树叶片硫含量均显著增加。研究认为,巨桉对较低浓度的SO2胁迫有一定的适应能力,但对高浓度SO2胁迫的抗性不如天竺桂强,这可能与二者不同的叶片形态及生理特性有关。     

毛竹miR398和miR408的克隆及其表达分析

为了解毛竹(Phyllostachys edulis)中miR398和miR408的表达情况,从毛竹叶片中分离了二者的前体序列,并用实时定量PCR技术对其表达模式进行了研究。结果表明,毛竹中miR398和miR408前体序列ped-MIR398和ped-MIR408长度分别为83 bp和92 bp,二者均能形成稳定的茎环结构,其中成熟miRNA序列(ped-miR398和ped-miR408)均位于5′端臂上。ped-miR398和ped-miR408均为组成型表达,在毛竹叶中表达量最高。强光、蔗糖和GA3处理后,叶片中ped-miR398与pedmiR408的表达量均上调;CuSO_4和ABA处理后,叶片中二者的表达量均下调;黑暗、NaCl和4℃处理后,前者表达量上调,后者表达量下调。因此,ped-miR398与ped-miR408在毛竹适应逆境胁迫过程中可能发挥着不同的调控作用。