鲎G因子实验法定量测定药用、食用蘑菇多糖中的（1，3）-β-葡聚糖含量

(1,3)-β-葡聚糖是蘑菇免疫调节和抗肿瘤多糖的核心结构。通过鲎的G因子法测定了从19种药用和食用蘑菇中提取的27个多糖样品中(1,3)-β-葡聚糖的含量,我们发现(1,3)-β-葡聚糖普遍存在于这些蘑菇多糖提取物中。但是,(1,3)-β-葡聚糖的含量随蘑菇的种类和多糖提取的部位不同有着很大的差异,平均值大约占多糖的34．8％。从香菇、裂褶菌、云芝、草菇、灰树花、鸡腿菇和姬菇中提取的9种多糖中(1,3)-β-葡聚糖含量远高于其余的多糖。适当的纯化可以提高蘑菇多糖中(1,3)-β-葡聚糖的含量。我们的研究表明鲎G因子法可以用来快速有效地测定蘑菇多糖提取物中的(1,3)-β-葡聚糖含量。     

鲎G因子实验法定量测定药用、食用蘑菇多糖中的(1,3)-β-葡聚糖含量

(1,3)--葡聚糖是蘑菇免疫调节和抗肿瘤多糖的核心结构。通过鲎的G因子法测定了从19种药用和食用蘑菇中提取的27个多糖样品中(1,3)--葡聚糖的含量,我们发现(1,3)--葡聚糖普遍存在于这些蘑菇多糖提取物中。但是,(1,3)--葡聚糖的含量随蘑菇的种类和多糖提取的部位不同有着很大的差异,平均值大约占多糖的34.8%。从香菇、裂褶菌、云芝、草菇、灰树花、鸡腿菇和姬菇中提取的9种多糖中(1,3)--葡聚糖含量远高于其余的多糖。适当的纯化可以提高蘑菇多糖中(1,3)--葡聚糖的含量。我们的研究表明鲎G因子法可以用来快速有效地测定蘑菇多糖提取物中的(1,3)--葡聚糖含量。     

食药用菌功能性β-葡聚糖荧光法测定研究

以酵母功能性β-1,3/1,6-葡聚糖为对照品,利用苯胺蓝和β-1,3/1,6-葡聚糖特异结合荧光特性,研究了葡聚糖荧光法测定时的各影响因素,建立了荧光法测定食药用菌功能性β-葡聚糖的方法。pH9.6缓冲液,80℃条件下避光反应15min,室温30min冷却后,398nm激发波长,508nm发射波长,20℃下进行荧光测定。在测定浓度2-20μg/mL范围内,荧光强度与浓度具有良好的线性关系(R2=0.9977),其中检出限为45μg/L,测定精密度和加样回收率良好,相对标准偏差(RSD)分别为1.86%和3.40%,并与酶法进行了比对验证,一致性良好,且荧光法更为节约时间和成本,并对灰树花菌、巴氏蘑菇、香菇和鲍氏针层孔菌四种食药用菌β-葡聚糖提取样品进行了葡聚糖纯度和提取率测定。     

马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)产生的开菲尔多糖的分离及其结构特性

研究了Lactobacillus kefiranofaciens发酵产生的开菲尔多糖的初步纯化方法,并对开菲尔多糖的分子组成、分子量以及单糖之间的连接方式进行了研究。研究结果表明,采用酶解与Sevage试剂相结合的方法进行纯化,当蛋白去除率为93%时,多糖得率60%,样品中多糖的百分含量为96%。采用HPLC和红外光谱研究表明,培养基的组成会明显影响开菲尔多糖中葡萄糖与半乳糖的比例,由MRS培养基发酵产生的KEFⅠ的相对分子质量约为2.4×105Da,葡萄糖/半乳糖约为1:4;而由改良的MRS培养基发酵产生的KEFⅡ的相对分子质量约为1.5×105Da,葡萄糖/半乳糖约为1:10。Lactobacillus kefiranofaciens发酵的开菲尔多糖分子中均含有β糖苷键。     

白菜型冬油菜β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达

为探明β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase)对油菜(Brassica campestris)抵御低温胁迫能力的作用,通过蛋白质谱分析得到β-1,3-葡聚糖酶蛋白,采用RT-PCR技术克隆白菜型冬油菜(B.rapa)陇油6号和天油4号β-1,3-葡聚糖酶的c DNA序列;并对该序列进行生物信息学分析;进而采用实时荧光定量PCR及半定量PCR检测β-1,3-葡聚糖酶基因在低温胁迫下的表达模式。结果获得长度为1 032 bp的陇油6号β-1,3-葡聚糖酶基因开放阅读框,编码343个氨基酸,相对分子量为38.102k Da,理论等电点为6.63,其与菜心(B.rapa subsp.chinensis)和甘蓝型油菜(B.napus)的蛋白质氨基酸序列同源性高达93.94%。该基因编码的酶是一个主要由α-螺旋组成的亲水性稳定蛋白,含有1个信号肽,存在2个跨膜结构域。该基因在进化上高度保守,其保守序列属于植物的糖基水解酶家族17特有的保守结构域。β-1,3-葡聚糖酶基因表达模式分析显示,4°C时该基因上调表达,继续低温(–4°C)胁迫处理,该基因上调表达至峰值,至–8°C时其表达下调。研究表明从白菜型冬油菜中克隆的β-1,3-glucanase在冬油菜品种陇油6号抗寒过程中发挥作用。     

β-1,3-1,4葡聚糖酶基因克隆表达及其抗菌活性与机理研究进展

β-1,3．1,4-葡聚糖酶是一类能水解β-1,3．糖苷键和β-1,4-糖苷键的酶,因其主要分解大麦中的β-1,3-1,4-葡聚糖和细菌地衣多糖,所以又称地衣多糖酶。综述了β-1,3．1,4-葡聚糖酶基因的克隆表达及其抗菌活性与机理最新研究进展。     

灵芝菌丝体中β-葡聚糖的提取

比较了热水回流法、热水-酶回流法、超声波法以及超声波-酶水解法等4种提取方法对灵芝菌丝体中β-葡聚糖提取得率的影响。结果表明,采用超声波-酶水解法所得β-葡聚糖的得率最大,影响提取的关键因素为超声波功率(A),水料比(B),p H(C)和加酶量(D)。进一步采用Box-Behnken设计及响应面分析法对这4个因素进行了优化。结果显示,因素A、B、C对β-葡聚糖提取得率的影响达到极显著水平(P0.01),但因素D和所有因素之间的交互作用并不显著(P0.05)。通过回归拟合,建立了预测灵芝β-葡聚糖提取的多项式模型。经响应面最优分析,获得4个因素的最佳水平为:超声波功率275.54W,水料比25.62:1(V/M,m L/g),p H 7.17,加酶量1.05%。经实际试验验证,在该条件下,灵芝菌丝体β-葡聚糖得率可达5.50mg/g。     

马乳酒样乳杆菌(Lactobacillus kefiranofaciens)产生的开菲尔多糖的分离及其结构特性

研究了Lactobacillus kefiranofaciens发酵产生的开菲尔多糖的初步纯化方法,并对开菲尔多糖的分子组成、分子量以及单糖之间的连接方式进行了研究.研究结果表明,采用酶解与Sevage试剂相结合的方法进行纯化,当蛋白去除率为93%时,多糖得率60%,样品中多糖的百分含量为96%.采用HPLC和红外光谱研究表明,培养基的组成会明显影响开菲尔多糖中葡萄糖与半乳糖的比例,由MRS培养基发酵产生的KEFⅠ的相对分子质量约为2.4×105Da,葡萄糖/半乳糖约为14;而由改良的MRS培养基发酵产生的KEFⅡ的相对分子质量约为1.5×105Da,葡萄糖/半乳糖约为110.Lactobacillus kefiranofaciens发酵的开菲尔多糖分子中均含有β糖苷键.     

血浆1,3-β-D葡聚糖检测联合念珠菌评分对侵袭性真菌感染的诊断价值

目的探讨血浆1,3-β-D葡聚糖检测(G试验)和念珠菌评分(CS)对侵袭性真菌感染(IFI)的诊断价值。方法收集2011年6月~2016年6月某院ICU科收治的201例IFI高危患者的病例,按照欧洲癌症研究治疗组及真菌研究组(EORTC/MSG)诊断标准,确诊9例,临床诊断73例,拟诊29例,非感染组90例,应用MB-80微生物动态快速检测系统及配套G试验试剂盒定量检测血浆中1,3-β-D葡聚糖的含量(1,3-β-D葡聚糖含量≥10pg/mL为阳性),并对201例高危患者进行念珠菌评分(评分结果≥3为阳性),计算G试验与CS单独或联合使用敏感度、特异度、阳性预测值、阴性预测值。结果 IFI感染部位以呼吸道最常见,致病菌以白念珠菌为主。血浆1,3-β-D葡聚糖检测阳性者有88例,念珠菌评分阳性者有85例。联合使用血浆1,3-β-D葡聚糖检测与念珠菌评分,其灵敏度、特异度、阳性预测值、阴性预测值分别为:95.1%、71.1%、75.0%、94.1%;相比血浆1,3-β-D葡聚糖检测与念珠菌评分单独使用,其灵敏度、阴性预测值最高,特异度、阳性预测值相近。结论血浆1,3-β-D葡聚糖检测与念珠菌评分联合应用时,灵敏度及阴性预测值均较单独使用增高,联合应用对诊断侵袭性真菌感染意义更大。     

黄粉虫β-1,3-葡聚糖识别蛋白的分离纯化及部分生物学功能

采用中性盐沉淀、凝胶层析等常规方法纯化黄粉虫Tenebrio molitor血淋巴中的β-1,3-葡聚糖识别蛋白,并对其在酚氧化酶原激活系统中的作用进行了初步的研究。结果表明:黄粉虫血淋巴的β-1,3-葡聚糖识别蛋白的分子量约为70 kDa,主要分布于血浆中。纯化的β-1,3-葡聚糖识别蛋白只能特异性地识别β-1,3-葡聚糖而不能识别肽聚糖。在β-1,3- 葡聚糖所诱导的酚氧化酶原的激活过程中,随着酚氧化酶原激活程度的提高,内源性β-1,3-葡聚糖识别蛋白的含量逐渐减少。抗β-1,3-葡聚糖识别蛋白多克隆抗体对黄粉虫血淋巴中由β-1,3-葡聚糖所诱导的酚氧化酶活性起抑制作用,且该抑制作用呈现一种剂量依赖性的趋势。上述结果有助于深入了解β-1,3-葡聚糖对黄粉虫血淋巴酚氧化酶原激活系统的激活作用。     

绿色木霉LTR-2 β-1, 3-葡聚糖酶基因的克隆及其在 毕赤酵母中的表达

根据从GenBank中检索到的木霉菌β-1,3-葡聚糖酶基因序列设计引物,以高产β-1,3-葡聚糖酶菌株--绿色木霉LTR-2的cDNA为模板,采用PCR方法扩增得到内切β-1,3-葡聚糖酶基因(glu).将glu克隆至载体pMD18-T上,进行了全序列测定.序列分析表明该基因由2289个核苷酸残基组成,含有一个开放阅读框架,可以编码762个氨基酸,与报道基本相同.翻译后的氨基酸序列含有两个β-1,3-葡聚糖酶的保守区RVVYIPPGTY和AASQNKVAYF.基因与已发表的木霉β-1,3-葡聚糖酶基因有较高的同源性,其中和哈茨木霉bgn3.1和绿木霉bgn13.1的同源性达到93%.序列已经提交GenBank,登录号为EF176582.将glu基因插入到巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)穿梭载体pPIC9K中,获得重组质粒pGLU14,经线性化后转化毕赤酵母菌株KM71.经大量平板筛选,获得能有效分泌表达β-1,3-葡聚糖酶的毕赤酵母工程菌株KGLU14,菌落PCR扩增证实了glu基因已经整合到酵母基因组中.SDS电泳结果表明其β-1,3-葡聚糖酶的分子量大约为80kDa,和理论推测值大致相同.摇瓶发酵结果表明,培养基中β-1,3-葡聚糖酶的活力可达889U/mL.     

乌梅丸水提液中多糖理化性质分析及预防结肠炎的作用

目的:考察乌梅丸水提液中多糖含量,建立HPLC法分析乌梅丸多糖分子量及单糖组成方法,观察其对右旋葡聚糖硫酸钠(DSS)所致小鼠溃疡性结肠炎(UC)的预防作用,为乌梅丸临床用药及药理活性成分的研究提供依据。方法:采用水提醇沉法提取多糖;硫酸-苯酚法测定乌梅丸多糖含量;凝胶色谱法-龙智达分子量工作站测定多糖分子量;PMP柱前衍生化法HPLC分析单糖组成;DSS(3%)法建立UC小鼠模型。ICR小鼠50只随机分为5组:正常组,模型组,乌梅丸多糖2.5%,5%,10%剂量组,每组10只。造模前7天,在乌梅丸多糖治疗各组的小鼠饮水中添加乌梅丸多糖,一直给药维持至实验结束(第14天)。结果:葡萄糖在0~0.08 mg·m L-1浓度范围内呈良好的线性关系(r=0.998);右旋葡聚糖酐标准品分子量在2500~2000000 Da范围内呈良好线性关系(r=0.998);乌梅丸水提液中多糖含量为40.3%,纯化的乌梅丸多糖糖含量为91.6%;分子量范围在171343~525009 Da之间,分布系数D=1.18;其多糖的单糖组成主要为甘露糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖和木糖组成,其相对含量比为1.8:1.0:19.3:32.8:4.2;乌梅丸多糖能降低结肠组织损伤程度。结论:多糖可能是乌梅丸汤剂中有效的活性成分,对小鼠UC有一定的防治作用,其理化性质分析方法简便快速,结果准确,重复性好,可作为乌梅丸多糖的质量控制方法。     

紫芝细胞壁大分子量葡聚糖的纯化及结构鉴定

采用超微粉碎、热水浸提法从紫芝子实体水提残渣中获得细胞壁粗多糖,通过30%乙醇沉淀、20%醇洗的方法纯化出大分子量均一多糖GSCW30E-20E。苯酚硫酸法检测其多糖含量为98.03%,单糖组成分析显示其仅由葡萄糖组成,高效凝胶尺寸排阻色谱-多角度激光散射仪-示差折光检测技术测定其重均分子量为1.552×10 ⁶g/mol。通过红外光谱、甲基化及核磁共振分析对其结构进行解析,结果表明,GSCW30E-20E是一种β-D-葡聚糖,该多糖主链由β-(1,3)-糖苷键连接而成,每3个糖残基主链上通过β-(1,6)-糖苷键连有一个葡萄糖残基为支链。     

乙醇-酶体系预处理结合水提法提取灵芝中β-葡聚糖的研究

采用乙醇-酶预处理体系,结合水提法较系统地研究了灵芝子实体中β-葡聚糖的提取技术。结果表明,乙醇-酶体系预处理的关键参数为:乙醇质量分数60%(V/V),加酶量1.5%(M/V,g/m L)、酶解温度45℃、酶解p H8.0;在乙醇-酶体系预处理的基础上,进一步采用单因素试验和Box-Benhnken试验设计与响应面分析法对灵芝子实体中β-葡聚糖的热水提取工艺进行了优化。结果显示水提温度、提取时间、水料比3个因素及水提温度与水料比二者的交互作用对β-葡聚糖的提取有显著影响。经优化后获得3个核心因素的最佳水平为:提取温度80℃、提取时间2.5h、水料比35:1。在乙醇-酶预处理结合水提取条件下,灵芝子实体中β-葡聚糖的提取得率可达0.412mg/g,是传统无水乙醇回流预处理结合水提法提取β-葡聚糖得率的2.1倍。本研究为灵芝β-葡聚糖的进一步提取放大试验奠定了技术基础。     

荞麦麸皮多糖的分离纯化及其外貌表征的分析

采用水提醇沉法对荞麦麸皮多糖(Buckwheat bran polysaccharide,BBP)进行提取,通过DEAE-52纤维素柱层析法和Sephadex G-200对其进行分离纯化,采用凝胶过滤法对多糖组分的分子量进行测定,采用扫描电镜对荞麦麸皮多糖及其分离纯化的多糖组分的外貌进行分析,用红外光谱对分离纯化的三个荞麦麸皮多糖组分的苷键构型进行分析。结果表明:DEAE-52纤维素和Sephadex G-200对荞麦麸皮粗多糖具有较好的分离纯化效果,得到了三个多糖组分(BBP-Ⅰ、BBP-Ⅱ和BBP-Ⅲ),其分子量分别为1.56×10~4Da、5.85×10~4Da、8.45×10~4Da。扫描电镜的结果表明,BBP其表面粗糙,凹凸不平,三个分离纯化的多糖组分形貌差异较大,分别以球状、片状、棒状为主。红外光谱扫描表明BBP-Ⅰ和BBP-Ⅲ为ɑ-糖苷键化合物,BBP-Ⅱ为β-糖苷键化合物。荞麦麸皮多糖组分外貌的差异性为其进一步的结构探究提供了重要依据。     

沈农一号马齿苋的多糖提取方法研究

分别采用热水法、低级醇法和酶法从沈农一号马齿苋中提取有效成分多糖并测定其含量。结果表明,酶法的浸提效果要优于热水法和低级醇法,提取率提高约10%。本实验首次运用纤维素酶辅助提取马齿苋多糖,收率提高。     

药用真菌β-(1,3)-D-葡聚糖构效关系及检测方法研究进展

β-（1,3）-D-葡聚糖是许多活性真菌多糖的核心结构,由于具有免疫调节、抗肿瘤等多种生物活性,已成为研究热点。本文从β-（1,3）-D-葡聚糖的主链、支链分支度、支链基团、分子量及空间结构等方面介绍了结构与生物活性之间的关系,并对目前该类多糖的定性方法及鲎G因子、半乳糖神经酰胺ELISA等定量检测方法进行了综述。     

药用真菌β-(1,3)-D-葡聚糖构效关系及检测方法研究进展*

β-(1,3)-D-葡聚糖是许多活性真菌多糖的核心结构,由于具有免疫调节、抗肿瘤等多种生物活性,已成为研究热点。本文从β-(1,3)-D-葡聚糖的主链、支链分支度、支链基团、分子量及空间结构等方面介绍了结构与生物活性之间的关系,并对目前该类多糖的定性方法及鲎G因子、半乳糖神经酰胺ELISA等定量检测方法进行了综述。     

青稞中β-1,3葡聚糖酶的纯化及部分性质研究

β-1,3-葡聚糖酶[EC．3．2．1．39]存在于大多数的高等植物中,它们由一个小的基因家族编码,在植物不同的生理活动中起着重要的作用。采用NaCl抽提、硫酸铵分部沉淀和2步离子交换法和分子筛从青稞的胚芽中提纯得到了一种β-1,3-葡聚糖酶。在非变性电泳中纯化的β-1,3-葡聚糖酶用银染只有一条蛋白带,运用底物进行的活性染色时在相同位置也只显示一条酶活性带。此活性染色可以直接在电泳胶板上快速鉴定和检验β-1,3-葡聚糖酶。纯化的β-1,3-葡聚糖酶在还原及非还原条件下的SDS-PAGE变性电泳中,呈现一条分子量为32kD的主要蛋白带及2条低分子量的弱带,表明此酶无链内二硫键存在。等电聚焦分析显示其等电点为8．1。上述结果表明纯化得到的是一种碱性β-1,3-葡聚糖酶。     

甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因的电子克隆与分析

以高粱β-1,3-葡聚糖酶基因(β-1,3-glucanase gene)cDNA序列为探针,搜索甘蔗EST数据库,而后通过电子克隆技术,拼接获得甘蔗β-1,3-葡聚糖酶基因ScBG。采用生物信息学方法,对该基因编码蛋白从氨基酸组成、理化性质、跨膜结构域、卷曲螺旋、亚细胞定位、信号肽、功能域及高级结构等方面进行了预测和分析。结果表明:ScBG基因全长1270bp,包含一个长达1011bp的完整开放读码框(open reading frame,ORF),编码336个氨基酸,分子量为34.8KD,理论等电点为4.98。该蛋白质很可能是胞外定位的诱导物释放型酸性葡聚糖酶,是一种稳定的分泌蛋白,且可信度达最高等级1。该蛋白属于糖苷水解酶第17家族,含有N端信号肽,在第7～29位氨基酸处含有跨膜信号区,在第31～321位氨基酸处含有糖苷水解酶17家族结构域,含2个主要的功能结构域。10个物种ScBG蛋白氨基酸序列的同源性分析表明,甘蔗ScBG基因编码蛋白与高粱β-1,3-葡聚糖酶基因的编码蛋白的同源性最高,达79.82%。以上研究结果为ScBG基因下一步的分子克隆、功能鉴定和应用提供基础。