糙皮侧耳乙醛脱氢酶基因PoALDH1的克隆与非生物胁迫下的表达分析

本研究从糙皮侧耳中克隆了乙醛脱氢酶基因PoALDH1(Gen Bank登录号为KT026035)和其全长c DNA序列。长为2 016bp的PoALDH1序列编码478个氨基酸,分子量约为52k Da,氨基酸序列中含有乙醛脱氢酶保守的谷氨酸活性位点和半胱氨酸残基活性位点。PoALDH1基因在大肠杆菌中表达后显示,重组菌株的乙醛脱氢酶比活力为0.58U/mg,且重组菌株的乙醛耐受性显著高于对照菌株。实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR)分析PoALDH1基因在糙皮侧耳不同发育时期的表达结果显示,PoALDH1基因在原基期的表达量约为双核菌丝期的5倍。PoALDH1基因在原基发育起始阶段经光照及温差刺激后均上调表达。当糙皮侧耳菌丝暴露在不同浓度的氯化钠及甘露醇的条件下时,菌丝生长均受到抑制且PoALDH1基因的表达量均高于对照。研究结果将为进一步从分子水平揭示糙皮侧耳的抗逆机制以及食用菌的发育奠定一定基础。     

糙皮侧耳原基期差异表达基因分析

为解析糙皮侧耳原基期与菌丝期差异表达的基因,本研究以原基期cDNA为检测子（tester）、双核菌丝期cDNA为驱赶子（driver）,采用抑制性消减杂交法（suppression subtractive hybridization,SSH）构建了糙皮侧耳SSH cDNA文库。菌液PCR验证SSH cDNA文库插入cDNA片段后,挑取了2 055个差异转化子,差异转化子经3次反向Northern杂交筛选,得423个信号差异显著的克隆;阳性克隆测序后,经NCBI数据库Blastn和Blastx比对,共得206条差异表达序列（expressed sequence tag,EST）,重复序列去除后,有46个基因参与了细胞急救和防御、能量代谢、转录和蛋白调控、膜蛋白和信号转导,18个基因编码未知功能的推定蛋白,5个无任何同源性的新基因。挑取10个差异表达基因进行半定量RT-PCR,发现这些序列在原基期的表达水平显著高于菌丝期。结果表明,本研究成功构建了糙皮侧耳原基期与菌丝期SSH cDNA文库,为进一步分离糙皮侧耳生长发育相关基因并研究糙皮侧耳的发育机制奠定了基础。     

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的AFLP指纹图谱分析

在对糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)的AFLP分析条件进行优化的基础上,利用该技术建立了14株产自不同地区的糙皮侧耳：DNA指纹图谱,并进行了数据分析。结果表明,在合成的14条引物的不同组合中,引物对E-3／M-3可以产生较多的DNA多态片段,E-AGC／M-CAT引物对的扩增效果最好,共获得184条DNA扩增带,其中多态性条带i101条,占54．89％。利用UPGMA法对所获数据进行聚类分析,计算得到糙皮侧耳菌株之间的遗传距离,发现不同品种间遗传距离差异较大,从0．192到0．754,说明糙皮侧耳的遗传多样性比较丰富。绘制的指纹分析树状图表明,14个糙皮侧耳菌株被分为6个组群,其中P17和杂3的相似性系数最高,达到了81．2％,而侧5与其他菌株的亲缘关系相对最远。     

糙皮侧耳染色体计数和担孢子形成过程中细胞核行为的研究

糙皮侧耳(Pleurotus ostreatus)菌褶经有丝分裂阻断剂预处理、原生质体铺片和Gie-msa 染色并结合苏木精染色后,经过多次反复实验观察,证明糙皮侧耳的染色体条数为 9(n=9);糙皮侧耳从菌褶分化完成到子实体完全成熟的过程中,不断有少量新的双核担子产生,发生核配直到释放担孢子。其减数分裂同步性不高。减数分裂后,4个子核分别进入4个担孢子中,留下中空的担子。     

糙皮侧耳染色体计数和担孢子形成过程中细胞核行为的研究

糙皮侧耳（Ｐｌｅｕｒｏｔｕｓ ｏｓｔｒｅａｔｕｓ）菌褶经有丝分裂阻断剂预处理、原 生质体铺片和Ｇｉｅ－ｍｓａ染色并结合苏木精染色后,经过多次反复实验观察,证明糙皮侧耳的染色体条数为９（ｎ＝９）;糙皮侧耳从菌褶分化完成到子实体完全成熟的过程中,不断有少量新的双核担子产生,发生核配直到释放担孢子。其减数分裂同步性不高。减数分裂后,４个子核分别进入４个担孢子中,留下中空的担子。     

紫孢侧耳、糙皮侧耳及其融合菌株的同工酶分析

采用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳方法对紫孢侧耳、糙皮侧耳及其融合菌株的酯酶和过氧化物酶同工酶进行了分析。经多次试验,得到了两亲株和融合株恒定的同工酶谱, 在酶谱中融合菌株与亲株有明显差异,并表现出典型的双亲株互补酶带特征,从而证实融合菌株为两亲株基因重组之产物。 Abstract: After many repetitions,the patterns of esterase isozyme and peroxidase isozyme of Pleurotus sapidus,Pleurotus ostreatus and their fusant strains were obtained.There were differences among the parent strains and theirfusant strains in theirisozyme bands.Parental isozyme bands appeared in patterns of fusant strains.Itdemonstrated that fusant were recombinants of P.sapidus and P.ostreatus.     

原生质体再生对糙皮侧耳Pleurotus ostreatus病毒脱除的效果

以糙皮侧耳Pleurotus ostreatus菌株新831和豫6为材料,从这两个菌株的菌丝体中提取了糙皮侧耳病毒基因组,共有3个dsRNA片段,大小分别为8.2kb、2.6kb和1.1kb。采用菌丝尖端分离脱毒、原基组织分离脱毒和原生质体再生脱毒技术对糙皮侧耳菌丝体进行脱毒处理,利用dsRNA技术对脱毒效果进行检测。结果显示,原基组织分离脱毒后3个条带依然存在;菌丝尖端分离脱毒后,8.2kb和1.1kb 2个条带完全脱除,2.6kb的条带亮度有所减弱;原生质体再生脱毒后3个条带完全脱除;对3种脱毒技术得到的菌株进行生理生化指标测定,结果显示,原生质体再生脱毒菌株的菌丝生长速度、生物量、呼吸强度、纤维素酶活等均明显优于出发菌株、原基组织分离脱毒和菌丝尖端分离脱毒菌株;栽培结果表明,原生质体再生脱毒菌株前两茬菇的生物学效率达到96.4%－99.1%,比出发菌株提高19.9%－25.4%,并且菌盖宽度和长度有所增加,表明原生质体再生技术可以有效脱除糙皮侧耳菌株病毒,提高糙皮侧耳栽培产量。     

启动子替代构建糙皮侧耳漆酶高产菌株

POXC是糙皮侧耳合成最多的一种漆酶。应用启动子替代技术,用构巢曲霉的甘油醛-3-磷酸脱氢酶基因（gpd）启动子替代POXC基因的启动子,构建了超量表达POXC糙皮侧耳转化子。转化子中POXC基因表达量比出发菌株提高了0.72–3倍。在PDA平板培养、PD摇瓶培养和棉籽壳试管培养条件下,转化子漆酶活力显著提高,比出发菌株提高了1.5倍以上。用棉籽壳栽培,转化子菇产量比出发菌株提高了16.2%,培养料中木质素含量比出发菌株减少21%。结果表明,应用高效启动子替代能够显著提高糙皮侧耳漆酶基因的表达量、漆酶活力及其木质纤维素降解能力。     

野生糙皮侧耳多糖的提取、分离纯化和组分分析

以野生糙皮侧耳子实体为材料,用水浸法及乙醇沉淀法提取多糖;用过氧化氢、重蒸酚、不同含量的活性碳进行脱色;然后用氢氧化锌法、三氯醋酸法、sevag法、胰蛋白酶与sevag法相结合的方法进行脱蛋白;再通过透析和柱层析作进一步分离纯化;最后以纸层析法进行组成糖分析.结果表明:野生糙皮侧耳的水溶性多糖以1.5%活性碳脱色效果最...     

Cloning and developmental expression of a metzincin family metalloprotease cDNA from oyster mushroom Pleurotus ostreatus

A cDNA clone, PoMTP, encoding a putative metzincin family metalloprotease was isolated from the expressed sequence tags of a basidiomycete Pleurotus ostreatus. The 5'-end sequence of PoMTP was determined by the 5'-RACE method. Full-length cDNA sequence (1140 bp) of PoMTP contained a 870 bp open reading frame encoding a protein product of 290 amino acids in addition to a 99 bp of 5'-untranslated sequence and a 171 bp of 3'-untranslated sequence with a poly(A) tail. The deduced amino-acid sequences of PoMTP contained an extensive zinc-binding consensus sequence and a so-called Met-turn sequence which are typical for the metzincin family of metalloproteases, indicating that the PoMTP protein belongs to the metzincin metalloproteases. Four cysteine residues were also observed in the zinc-binding region of PoMTP amino-acid sequence, which are known to be important for the structure and the function of some subfamilies of the metzincins. Comparison of the PoMTP in sequence database showed no significant homology with functionally known metalloproteases of Armillaria mellea, Grifola frondosa, Lentinula edodes, Pleurotus ostreatus, Schizophyllum commune and Tricholoma saponaceum in mushroom. Northern blot and qunatitative RT-PCR analyses indicated the PoMTP mRNA to be abundant at primordial and fruit body stages, but scarce at the mycelial stage, suggesting that the PoMTP metalloprotease plays an important role in mushroom fruiting.     

北风菌中的甾体和甾体苷类化合物

从口蘑科真菌北风菌(Pleurotus ostreatus (Jacq.:Fr.) Kummer)的乙酸乙酯部分分离鉴定了12个甾体类化合物,其中包括8个麦角甾醇类甾体及4个甾体苷.利用现代波谱技术及化学方法,鉴定了一个新化合物3-O-β-D-glucopyranosyl-22E, 24R-ergosta-7, 22-diene-5α, 6β, 9α-triol.其余11个已知化合物分别为22E, 24R-ergosta-7, 22-diene-3β, 5α, 6β, 9α-tetraol、 3-O-β-D-glucopyranosyl-22E, 24R-ergosta-7, 22-diene-5α, 6β-diol、 22E, 24R-ergosta-7, 22-diene-3β, 5α, 6β-triol、 22E, 24R-ergosta-5, 7, 22-trien-3β-ol 3-O-β-D-glucopyranoside、 ergosterol、 22E, 24R-ergosta-7, 22-dien-3β-ol 3-O-β-D-glucopyranoside、 22E, 24R-ergosta-7, 22-diene-3β-ol、 22E, 24R-ergosta-4, 6, 8, 22-tetraen-3-one、 22E, 24R-ergosta-7, 22-diene-3β, 5α, 6α-triol、 ergosterol peroxide 和22E, 24R-ergosta-7, 22-diene-3β, 5α-diol-6-one.     

Isolation of DNA topoisomerase II gene from Pleurotus ostreatus and its application in phylogenetic analysis

AIM: We performed experiments to isolate DNA topoisomerase II gene from Pleurotus ostereatus and to discuss its application as a feasible and credible molecular maker in phylogenitic analysis. METHODS AND RESULTS: A fragment of PosTopII was amplified from a P. ostreatus cDNA clone by nested polymerase chain reaction (PCR), using degenerate primers and primer walking. The full-length gene sequence was obtained with 3' and 5'-full RACE-PCR. The PosTopII cDNA is 4808 bp length and contains an open reading frame (ORF) of 4713 bp. The predicted peptide has 1571 amino acids, and exhibits strong sequence homology to other eukaryotic topoisomerase II. The PosTopII sequence was compared with the homologous genes to determine it can be used as a reliable molecular maker for P. ostreatus. CONCLUSIONS: The complete sequence of PosTopII cDNA clone was obtained. The phylogenetic relationships were consistent with other classification methods based on the morpological characteristics and rDNA gene sequences. SIGNIFICANCE AND IMPACT OF THE STUDY: This is the first report on isolation of a DNA topoisomerse II from P. ostreatus. Findings from this study indicate that the DNA topoisomers II can be applied as a reliable meker for taxonomic distinction in the genus Pleurotus.     

平菇菌粗多糖的抗氧化活性研究

采用深层发酵技术生产平菇粗多糖,时其清除DPPH自由基、羟自由基的能力、铁离子螯合能力以及还原力进行了比较分析。结果表明：菌丝体粗多糖和发酵液粗多糖均具有较强的抗氧化能力,但2种多糖的抗氧化能力存在差异;茵丝体粗多糖清除DPPH自由基的能力较强,其EC。。值为2．20mg／mL;发酵液粗多糖清除羟自由基的能力、铁离子螯合能力以及还原力较强,其EC50值分别为0．72mg／mL、3．32mg／mL和7．91mg／mL。在一定的浓度范围内,多糖的浓度增加,其抗氧化能力也随之增强,呈量效依赖关系。     

平菇产植酸酶菌株的筛选及植酸酶基因区域的克隆

从平菇（Pleurotus ostreatus）8个菌株中筛选出3株高产植酸酶菌株,并根据GenBank中植酸酶基因的保守区设计并合成一对特异性引物,以平菇菌丝的总DNA为模板,通过PCR扩增,获得了一条长约920 bp的片段.DNA序列测定结果表明,该片段长度为919 bp.采用blast进行序列比对,结果表明：该片段与曾报道的源于Trametes pubescens的植酸酶phyA（GenBank Accession：AJ310700）基因相比较,其DNA序列同源性为93%.该片段含有3个内含子,含有植酸酶基因的活性位点保守序列（Active-site sequence）RHGARYPT.     

微波协同酶法提取平菇柄多糖的工艺研究

为优化微波协同酶法提取平菇柄多糖的工艺条件,在单因素试验的基础上,选择提取时间、微波功率以及液料比为自变量,多糖得率为响应值,采用中心组合设计的方法,研究各自变量及其交互作用对多糖得率的影响。利用响应面分析方法,模拟得到二次多项式回归方程的预测模型,并确定平菇柄多糖提取工艺的最佳条件为:微波功率420 W,提取时间8 min,液料比55:1,在此条件下,最大得率达到6.05%。     

磷酸氢二铵对糙皮侧耳菌丝生长及基质降解酶活性的影响

氮源种类和浓度均会对糙皮侧耳Pleurotus ostreatus菌丝长势、生长速率以及代谢产生影响,而氮匮乏与氮过量积累都会对糙皮侧耳的生长产生不利影响。为了研究氮源对糙皮侧耳菌丝生长和基质降解酶活性的影响,本研究选取磷酸氢二铵[(NH4)2HPO4]作为唯一氮源,通过在培养基中添加不同浓度的磷酸氢二铵检测糙皮侧耳菌丝生长速率和木质纤维素降解酶的活性,筛选出糙皮侧耳生长的最适磷酸氢二铵浓度。结果表明,当磷酸氢二铵的添加浓度区间为10–20 mmol/L时菌丝长势最好。以缺氮时的酶活作为对照,当磷酸氢二铵的添加浓度为10 mmol/L时,羧甲基纤维素酶的活力最强,显著高于对照组(P<0.05);当添加浓度为5 mmol/L时,滤纸纤维素酶的活力最强,显著高于对照组(P<0.05),而10 mmol/L浓度下的酶活力比5 mmol/L时稍有下降,但二者之间无显著性差异(P>0.05);当添加浓度为40 mmol/L时,木聚糖酶的活力最强,显著高于对照组(P<0.05);当添加浓度为10mmol/L时,漆酶的活力最强,显著高于对照组(P<0.05)。基质降解酶...