重组巴斯德毕赤酵母发酵生产几丁质酶的条件优化研究

研究了利用重组巴斯德毕赤酵母诱导表达重组几丁质酶的条件。在摇瓶水平上研究了诱导时间、pH、甲醇流加量、油酸等因素对重组几丁质酶表达的影响。结果发现诱导108h蛋白表达量最高;偏酸性环境不利于蛋白表达,维持在pH5.5～6.0最佳;甲醇最佳诱导浓度为1%;添加0.05%的油酸有助于提高蛋白表达量。在此基础上通过正交试验设计优化了培养基配方,在优化条件下,蛋白表达量达171.99mg/L,酶活达49.58U/mL。     

响应面法优化重组巴斯德毕赤酵母合成ECH42的培养基组分及其重组酶降解几丁质的研究

采用响应面法在摇瓶水平对重组巴斯德毕赤酵母合成内切几丁质酶的培养基组分进行优化,并探讨重组内切几丁质酶降解几丁质的最佳反应条件。首先对培养基中显著影响内切几丁质酶活力的关键组分通过Plackett-Burman试验设计进行筛选;然后通过Box-Behnken试验设计和响应面法确定关键组分的最佳浓度。结果筛选出3个具有显著效应的关键组分为酵母膏、油酸和吐温-80,最佳浓度分别为：2.45%、0.17%和0.62%。优化后的最佳培养基组成为：2.45%酵母膏、2.00%蛋白胨、0.50%酵母氮碱（YNB）、0.50%甲醇、0.17%油酸、0.62%吐温-80和0.40% PTM₁。在该培养基中,重组巴斯德毕赤酵母在摇瓶水平（25mL/250mL）发酵生产内切几丁质酶的活力高达92.26U/mL。重组内切几丁质酶催化几丁质降解的最佳反应条件为：粉末几丁质浓度为4%,pH和温度分别为7.0和30℃,反应时间为10h。研究结果为后期在发酵罐中大规模生产内切几丁质酶和几丁寡糖提供了基础。     

重组毕赤酵母高密度发酵生产内切型纤维素酶的条件优化

为优化内切型纤维素酶高密度发酵工艺条件,在7.5L发酵罐高密度发酵条件下,研究内切型纤维素酶表达量以及毕赤酵母胞外蛋白酶合成水平的影响因素。研究表明:经340mL甘油补料发酵后,在甲醇诱导阶段,pH为5.0,温度为25℃,利用甲醇检测流加控制器控制甲醇体积分数为0.33%～0.35%时,EGI表达量可达421.1IU/mL,比采用固定甲醇流加速率的发酵方法提高了1.49倍。     

重组毕赤酵母生产β-葡萄糖苷酶发酵条件初步研究

为提高重组毕赤酵母(P.pastoris KM71/pPIC9K-bgl)生产β-葡萄糖苷酶的产量,在摇瓶条件下对重组P.pastoris产β-葡萄糖苷酶的发酵过程进行了优化,得到最佳的条件:生长阶段甘油浓度为30 g/L,接种量为10%,诱导阶段甲醇的初浓度为4%,过程补加甲醇0.5%,诱导温度30℃,pH7.5,诱导周期120 h,酶活可达到245 U/mL。在此基础上,在3 L发酵罐上进行初步放大,流加甘油提高细胞密度至OD_(600)为170,开始流加甲醇诱导,最终BGL酶活达到1 175 U/mL。比摇瓶提高了4.8倍,为β-葡萄糖苷酶工业化生产打下了坚实的基础。     

重组毕赤酵母产木聚糖酶的发酵条件优化研究

采用单因素实验确定重组毕赤酵母产木聚糖酶生长相的最适条件,然后利用Plackett—Bur—man实验设计对诱导相培养基成分和培养条件的10个因素进行筛选,方差分析结果表明,影响木聚糖酶表达的主要因子为酵母膏、诱导pH和摇床转速;在此基础上,用Box—Behnken的响应面方法对3个因素进行进一步优化,当酵母膏为11．13彰L,pH为6．38,摇床转速为228r／min时酶活有最大值,为262．77u／mL,较优化前提高了175．44％。优化后的摇瓶发酵条件应用于7L发酵罐并连续诱导培养120h,发现诱导72h后的木聚糖酶酶活最高,为2054．89u／mL。     

重组毕赤酵母表达棘孢木霉几丁质酶Tachi1的酶学性质研究及表达条件优化

【目的】对转棘孢木霉几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母工程菌GS-tachi1-K进行诱导表达,研究重组几丁质酶Tachi1的酶学性质,优化表达条件。【方法】对GS-tachi1-K进行甲醇诱导培养,纯化目的蛋白Tachi1进行几丁质酶酶学性质的研究;通过单因素和正交试验对GS-tachi1-K菌株产几丁质酶Tachi1表达条件进行优化。【结果】GS-tachi1-K表达的几丁质酶Tachi1表观分子量约为44 kDa,酶反应最适的温度和pH分别为50℃和5.5,具有较宽的温度、pH适用范围;50℃以下保持较高的酶活力,在碱性条件下稳定性较差;受Ag+、Hg2+、Cu2+、Fe2+和高浓度的SDS及β-巯基乙醇强烈抑制。该菌株的最佳表达条件为:pH为6.5,甲醇诱导浓度为0.5%,起始细胞浓度为OD600=2,甲醇诱导时间为180 h;几丁质酶Tachi1活力可达17.93 U/mL,蛋白表达量为6.19 g/L。【结论】成功实现了棘孢木霉新几丁质酶基因tachi1的毕赤酵母高效分泌表达,工程菌GS-tachi1-K具有高表达量和表达产物酶活性高两个特点,明确了几丁质酶Tachi1的酶学性质和最佳诱导表达条件,为该几丁质酶及其基因的深入研究和开发利用奠定了基础。     

毕赤酵母表达巴曲酶发酵条件的优化研究

目的对表达重组巴曲酶的巴斯德毕赤酵母的发酵条件进行优化,确定最佳的发酵控制条件以获得重组巴曲酶的最高表达量。方法通过多因素正交实验确定巴曲酶发酵培养的最适培养条件。结果表达温度在25℃,pH值为7．0,加入甲醇的量为10g／L时为最优发酵条件,诱导表达时间为84-96h。结论重组巴曲酶可以开发为止血药,代替临床应用的从蛇毒中提取的巴曲酶。     

毕赤嗜甲醇酵母工程菌高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的研究

目的:对毕赤嗜甲醇酵母工程菌inu-26高密度培养表达黑曲霉菊粉内切酶的条件进行优化,找出最佳的外源蛋白表达条件。方法:在摇瓶优化培养的基础上进行发酵罐高密度培养,优化最佳产酶条件。结果:以葡萄糖为碳源、微量元素添加量100～200mL/L、甲醇浓度1g/L、pH6.0～7.0、诱导时间96h时酶的表达量最高;摇瓶模拟高密度培养表明影响酵母生长的最主要因素葡萄糖和硫酸铵的最佳浓度分别为20～45和11.5g/L;利用培养基F1进行高密度培养优于其他培养基,工程菌生长符合指数生长曲线,细胞生长延迟期为1.36h,比生长速率μ为0.4846h-1。结论:以葡萄糖为碳源,采用葡萄糖-甲醇混合诱导和100%甲醇单一诱导相结合,在菌体鲜重约为280g/L时连续诱导96h,菌体生长良好,不会出现自溶,且酶的表达量最高,为摇瓶培养的3倍多,酶活最高可达540 U/mL。     

重组巴斯德毕赤酵母产米根霉α-淀粉酶发酵条件的研究

为了提高重组菌的淀粉酶表达量,以可分泌表达米根霉α-淀粉酶的甲醇快速利用型巴斯德毕赤酵母重组菌为基础,采用摇瓶发酵方式对影响重组菌表达淀粉酶的多个因素进行了研究和优化。摇瓶发酵条件确定为:温度为30℃,pH值为6.0,接种量为2.0(OD_(600)),甲醇补加方式采用前72 h发酵时间内每隔12h添加至终浓度为1.0%,72 h以后每隔24 h添加至终浓度为1.0%,在此条件下获得的淀粉酶最高表达量为47.5 U/mL,且在无机盐培养基中和有机氮源培养基中获得的淀粉酶发酵单位相当。以摇瓶发酵数据为基础确定15 L发酵罐放大实验条件为:无机盐培养基,温度为30℃,pH值为6.0,接种量为10%,甲醇流加方式采用DO—Start法控制,在此发酵条件下获得的淀粉酶表达量为440 U/mL,约为摇瓶发酵方式获得的淀粉酶表达量的9倍。     

巴斯德毕赤酵母表达外源蛋白的优化策略

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统已成为外源蛋白最理想的表达系统之一,诸多的优点体现了其广泛的研究价值和应用价值。综述了P.pastoris表达外源蛋白时在载体选择与利用、外源基因改造、翻译后修饰及表达稳定性等方面的优化策略,以加速其应用。     

响应面分析优化产木聚糖酶毕赤酵母基因工程菌培养条件

研究不同碳源、氮源和无机盐对毕赤酵母AX181菌株产木聚糖酶的影响。实验表明,分别采用葡萄糖和玉米浆干粉为碳源和氮源可以明显提高木聚糖酶的产量。无机盐单因子优化实验显示添加适量的（NH4）2SO4、KH2PO4、MnSO4·H2O、FeSO4·7H2O也可以部分提高木聚糖酶产量。在此基础上利用响应面法优化毕赤酵母产木聚糖酶培养基,利用12次实验的Plackett—Burman设计实验筛选出影响产木聚糖酶的3个主要因素,即玉米浆干粉、MnSO4·H2O和FeSO4·7H20。并进一步通过最陡爬坡路径逼近最大响应区域,采用中心组合实验设计确定最佳条件。优化后的产木聚糖酶培养基组分为（g/L）：葡萄糖40．00,玉米浆干粉80．84,（NH4）2SO46．25,KH2PO41．25、MnSO4·H2O0．35,FeS04-7H2O1．31。培养基优化后,实际产酶2883．86u／mL,是优化前YPD培养基产酶的2．51倍。     

重组毕赤酵母发酵生产S-腺苷甲硫氨酸培养条件优化

甲醇营养型毕赤酵母生产S-腺苷甲硫氨酸(SAM)是通过其表达的SAM合成酶催化L-甲硫氨酸(L-Met)和ATP反应而合成的。本文采用全合成培养基,在摇瓶上进行了培养条件的优化,确定了接种量、pH、PTM1、PO43-等初步条件。并根据SAM生物合成的特征,重点对其碳、氮源的影响作了进一步的分析优化。结果表明:当CaSO40.465g/L,K2SO49.10g/L,MgSO4.7H2O 7.45g/L,PO43-0.5mol/L情况下,生长阶段,甘油4%、硫酸铵4.00g/L为最佳;诱导表达阶段,L-Met1.0g/L,甘油与甲醇比例为0.5、硫酸铵8.00g/L为最佳。优化后,SAM产量诱导4d后达1.48g/L,诱导5d后可达1.70g/L(131mg/g干细胞),L-Met的转化率可达40.65%,既利于工艺放大又便于产品的分离纯化。     

发酵重组Pichia pastoris生产腺苷甲硫氨酸的研究

在5L发酵罐中对高产S腺苷甲硫氨酸的重组Pichia pastoris发酵进行了研究。重组菌在pH5．0生长,然后调为pH6．0积累腺苷甲硫氨酸,在30℃、溶氧5％及流加甲硫氨酸和尿素的条件下培养82h后,产量达4．3g／L。     

海参i-型溶菌酶在毕赤酵母基因工程菌中优化表达及纯化

将实验室已构建的毕赤酵母基因工程茵(pPIC9K-SjLys/GS115)作为海参i-型溶茵酶生产菌株,本研究分别从甲醇浓度、培养基pH、温度和诱导时间对其产酶发酵条件进行优化.实验得出甲醇诱导浓度为1.0％,发酵培养基初始pH 6.0,温度30℃,培养96 h为最佳目的蛋白表达条件,其发酵液中海参i-型溶菌酶含量达10.63 mg/L.将发酵液经离心和超滤浓缩后得到上清液,再经离子交换和凝胶过滤层析纯化获得海参i-型溶菌酶产品,其酶活力达826.44 U/mg.经测定该酶对革兰氏阳性菌溶壁微球菌和革兰氏阴性菌副溶血弧菌均具有明显的抑菌作用.     

Cyclic fed-batch culture for production of human serum albumin in Pichia pastoris

Simple cyclic fed-batch culture (cfbc), consisting of a constant medium feed with periodic withdrawals of culture, resulted in a product yield (13.4 mg protein per gram biomass) similar to that obtained using the complex multiphase industrial production strategy (13.7 mg protein per gram biomass). In cfbc, productivity was ultimately limited by the rate at which the cells could assimilate methanol. Glycerol was inhibitory to growth at high concentrations. However, product yield continued to increase as the glycerol concentration was increased. In chemostat culture, dissolved oxygen concentration influenced product yield independently of any detectable influence on cell growth.     

Impact of methanol concentration on secreted protein production in oxygen-limited cultures of recombinant Pichia pastoris

The methylotrophic yeast Pichia pastoris is a powerful system for production of recombinant proteins, showing high ability to secrete properly folded proteins. A major plus is the strong AOX1 promoter highly induced by methanol. During growth on methanol, however, oxygen readily becomes limiting. In oxygen-limited cultivations of recombinant Pichia pastoris, the methanol concentration had a strong impact on the production of a single-chain antibody fragment (scFv). High methanol concentrations were required to compensate the lack of oxygen and fully induce recombinant protein production, at the same time reducing gratuitous biomass formation due to a lower biomass yield. Product concentrations of 60, 150, and 350 mg/L were obtained with methanol concentrations of 0.3, 1, and 3% (v/v). Moreover, accumulation of a putative product fragment that cannot be removed during affinity purification was prevented at high methanol concentrations. Cell vitality after 100 h was maintained above 98% and 96% of the culture with 0.3% and 3% methanol, respectively. In cultivations supplemented with oxygen, in contrast, methanol concentration between 0.3% and 3% did not influence the product yield of 300-400 mg/L. Thus, efficient recombinant protein production under oxygen-limitation seems to require high methanol concentrations, enabling product concentration as high as otherwise obtained only with expensive supply of pure oxygen.     

重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学研究

构建了重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵动力学模型。实验考察了分批发酵过程中甘油消耗、甲醇浓度、菌体浓度、溶氧、补料时间对青霉素G酰化酶活力的影响。应用Matlab软件,对菌体生长、基质消耗和产物生成方程进行最优参数估算和非线性拟合,得到相应的动力学模型。模型的计算值与实验值能较好地拟合,表明所建模型能较好反映重组毕赤酵母产青霉素G酰化酶的分批发酵过程。