一株产多种β-内酰胺类抗生素酰化酶菌株的筛选

为了从大量的候选菌株中快速筛选头孢菌素酰化酶产生菌,设计并合成了一系列头孢菌素酰化酶的底物类似物。这些酰胺类的底物类似物由二部分组成,一部分为与头孢菌素相同或相似的侧链,另外一部分为发色基团或便于检测的基团。它们被酰化酶水解酰胺键以后可以方便快速的检测,因此用于对大量菌株进行快速筛选。采用这些化合物筛选到6株酰化酶阳性菌株。其中菌株ZH0650能够同时水解GL7ACA和多个底物类似物。进一步研究表明,该菌至少产生3种酰化酶,ADNABA酰化酶,青霉素G酰化酶和头孢菌素C酰化酶。我们初步纯化了ADNABA酰化酶和青霉素G酰化酶,并对头孢菌素C酰化酶的活力进行了鉴定。这是首次报道的可以产生青霉素G酰化酶和头孢菌素酰化酶等多种酰化酶的菌株,具有良好的应用前景。     

青霉素酰化酶高产菌株的快速筛选方法

采用青霉素梯度琼脂平皿筛选法,利用对青霉素G高抗性表型,专一筛选大肠杆菌青霉素酰化酶高产突变株。一次涂皿可淘汰绝大部分未突变株。我们从青霉素G梯度琼脂平皿上获得528株,从中得到32株产酰化酶活性高于出发菌株的正突变株,正突变率为6.06%,最高突变幅度为96.6%。     

青霉素酰化酶高产菌株的快速筛选方法

采用青霉素梯度琼脂平皿筛选法,利用对青霉素G高抗性表型,专一筛选大肠杆菌青毒素酰化酶高产突变株。一次涂皿可淘汰绝大部分未突变株。我们从青霉素G梯度琼脂平皿上获得528株,从中得到32株产酰化酶活性高于出发菌株的正突变株,正突变率为6.06%,最高突变幅度为96.6%。     

固定化青霉素G酰化酶水解头孢菌素G制备7—ADCA的研究

用聚丙烯腈纤维固定化青霉素酰化酶水解头孢菌素G制备7-ADCA,固定化酶对头孢菌素G的最适pH为9.0,最适温度50℃。在37℃、pH8.0固定化酶对头孢菌素G的表观米氏常数为1.67×10~(-2)mol/L。最大反应速度为3.01mmol·g~(-1)·min~(-1)。头孢菌素G溶液浓度在2％以上时,对固定化酶有明显的抑制作用。固定化酶水解头孢菌素G的最佳投料浓度为5％～6％,水解时用酶量以每克头孢菌素G投300U以上为好。按上述条件水解头孢菌素G,操作25批后固定化酶保留活力77.8％,7-ADCA平均收率92.68％。     

固定化青霉素酰化酶的研究

将巨大芽孢杆菌胞外青霉素酰化酶通过共价键连接到醋酸纤维素载体上,制成的固定化青霉素酰化酶的表观活力达2000 u／g左右(PDAB法)。水解lO％(w／v)的青霉素G钾盐落液,使用30批,保留活力70％以上。6-氨基青毒烷酸(6-APA)总收率平均达88．37％。固定化青霉素酰化酶水解青霉素G的最适pH为9．95,最适温度为55℃,表观米氏常数为1.093×10-2mol／L,在pH 5．8-10．7,温度45℃以下酶的活力稳定。     

大肠杆菌AE109青霉素G酰化酶的分离纯化及性质研究

 由发酵培养液所得大肠杆菌AE109菌体,先经高渗休克处理,继经D-苯甘氨酸-Sepharose 4B和DEAE-纤维素柱层析分离纯化得到青霉素G酰化酶,酶制品在非变性条件下的聚丙烯酰胺凝胶电泳上呈一条区带,而且可以结晶。在SDS变性条件下解离为α和β两个亚基。 酶性质的研究结果表明,由大肠杆菌工程菌AE109菌株所得青霉素G酰化酶与其亲本大肠杆菌AS1.76菌株所得青霉素G酰化酶性质相同。     

GL—7ACA酰化酶（C130）β亚基N端氨基酸残基的突变及功能

戊二酰 7 氨基头孢烷酸酰化酶 (即GL 7ACA酰化酶 ,EC .3.5 .1.11)的催化中心通常在 β亚基N端的第一个氨基酸 ,底物亲和标记的研究亦显示N端存在着结合靶点 ,因而该区域的结构可能与酶的功能密切相关。对C130 β亚基N端的 2～ 8位氨基酸残基分别进行了肽段置换和定点突变研究。将N端前 8位肽段置换为来源于Arthrobacterviscosus的青霉素G酰化酶 (PAC)的对应序列后 ,C130酰化酶活力丧失 ;而置换为来源于E .coli的青霉素G酰化酶 (PGA)的对应序列后 ,酰化酶活力仍然保留 ,但Km 值从 0 .44× 10 -3 mol·L-1增大为 0 .5 5× 10 -3mol·L-1,kcat值由 4.92s-1降低为 1.6 4s-1。另对C130 β亚基N端 2～ 4位氨基酸残基作了单点突变 :第 4位的Trp为可能的底物类似物结合位点 ,被变为Tyr后 ,它对底物GL 7ACA的结合能力略为减弱 ,kcat则降低为 2 .2 9s-1;而变为Leu后 ,Km 为 0 .34× 10 -3 mol·L-1,kcat为 3.15s-1;第 3位的Ser变为Met、Ala及Cys后 ,随着Km值逐渐降低 ,kcat也有所降低 ,而S3 M、S3 A突变体的kcat/Km 值比野生型的分别增加了 2 2 .3%和 39.3% ;将活性中心Ser(β1)邻位的Asn(β2 )变为Gln后 ,C130酶活大幅度下降 ,kcat减为 0 .47s-1。上述结果表明 ,C130 β亚基N端的前几个氨基酸残基均可对酶的功能     

青霉素酰化酶基因的克隆与表达I．青霉素酰化酶基因的克隆

用EcoR I—Pst I双酶解的pBR322作为克隆载体,从大肠杆菌D816染色体克隆了青霉素酰化酶基因,这个基陶位于9．1Kb EcoRI片段上。所得克隆株整体细胞酶学特性与大肠杆菌D816一致,酶反应最适温度为55℃,最适pH为7．8—8．0。以青霉素G作为底物时Km为10．3mM,转化产物为6一氨基青霉烷酸。克隆株大肠杆菌c600(pPAl)合成青霉索酰化酶仍需苯乙酸诱导并被葡萄糖阻遏,细胞青霉素酰化酶的活性比大肠杆菌c P1(高2—4倍。     

大肠杆菌AS1.76青霉素G酰化酶基因的克隆和定位

通过DNA体外重组,由E. colt AS 1.76菌株染色体DNA获得了青霉素G酰化酶基因克隆。测定了pPGA20质柱的限制性内切酶图谱,并构建了若干个pPGA2(／的变种。这些变种的酶活力及其酶切位点关系的分析结果表明,青霉素G酰化酶基因定位在 HindIII 和Sinai酶切位点之间小于2．8Kb DNA片段上。     

以聚丙烯腈纤维为载体制备固定化青霉素G酰化酶的研究

以酸部分水解聚丙烯腈纤维为载体 ,以戊二醛为交联剂 ,共价键结合制备了固定化胞外青霉素G酰化酶。当水解后的载体中 NH2 基含量为 690 μmol g和含水量为 64%时 ,对酶蛋白的固定量达 1 0 0mg g以上 ,固定化酶的活力达 2 30 0IU g ,酶活力总产率为 30 % ,固定化效率为 56%。酶活力的总产率和固定化率随加酶量的增加而降低。该酶可以将浓度为 2 5%～1 2 5%的青霉素G钾盐水解 98%以上。批投青霉素G钾盐为 1 0g,酶负荷为 1 50IU g(PGK) ,经2 0批水解反应后 ,剩余酶活力为 80 %。用二硫基苏醣醇处理固定化酶 ,对水解青霉素G钾盐的操作稳定性有促进作用。固定化酶的室温保存半衰期为 1 30d。用戊二醛和硼氢化钠溶液处理固定化酶后 ,酶活力的室温保存稳定性有所降低。     

胞外青霉素酰化酶产生菌的自然分离

利用菌种的自然突变进行“出发菌株Ⅱ”的自然分离,从用肉眼选出的22株菌中,经初筛选选出650u／10ml以上高产菌株8株,再经过复筛选出780u／100ml的活力菌株2株,命名为“6‘＃、8’＃”。用于胞外酶的生产,月平均酶活5975u／100ml。经验证,“6‘＃、8‘＃”高产菌产菌适用于胞外青霉素酸化酶的生产。     

青霉素G酰化酶工业进化的研究进展

青霉素G酰化酶是近几十年来β内酰胺类抗生素领域应用最广、开发最成功的酶之一。伴随着β-内酰胺类抗生素由化学合成法变更为酶法在中国的大规模产业化,得到了充分的开发与应用,取得了成功。青霉素G酰化酶不但用于水解制备6-APA、7-ADCA,更重要的是用于氨苄西林、头孢氨苄、阿莫西林、头孢拉定、头孢克洛等抗生素的制备。本文综述了近15年青霉素G酰化酶在我国研究与应用的历史沿革、基因与蛋白质结构、工业应用表达体系、工业评价标准与进化研究,还对各种突变株在具体医药工业领域的开发应用进行了综述,旨在梳理青霉素G酰化酶结构与性能的进化趋势以及在医药工业领域取得的巨大成就,同时也为相关人员在此领域进行深耕提供参考。     

温度对大肠杆菌青霉素G酰化酶基因表达的影响

含有大肠杆菌青霉素G酰化酶基因的质粒pWGA在菌株DH5α中表达时,表现为温度敏感。在30℃和37℃两种培养温度下,用Northern Blot和Western Blot研究了菌体的转录水平和翻译水平。结果表明菌体培养温度升高不影响mRNA的转录,但不利于青霉素酰化酶前体蛋白的正确加工,导致青霉素酰化酶在37℃发酵生产时酶活力单位的下降。     

固定化细胞生产7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸

为了用重排酸制备7-氨基脱乙酰氧基头孢烷酸(7-ADCA),我们从20株具有青霉素酰化酶活性的大肠杆菌中筛选裂解重排酸的菌株,发现凡能裂解青霉素G的菌株都能裂解重排酪,其中 Asl．76菌胜酶活力高。     

组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶重组大肠杆菌发酵条件研究

目的:对重组大肠杆菌组成型表达粪产碱杆菌青霉素G酰化酶(AfPGA)进行了发酵条件研究。方法:在摇瓶和5L发酵罐中研究了(NH4)2SO4和葡萄糖浓度对质粒的分离稳定性及青霉素G酰化酶表达的影响。结果:该工程菌质粒具有分离不稳定性,培养基中无(NH4)2SO4时发酵过程中pH和糊精水解生成葡萄糖的浓度变化较小,细胞前期(0h-12h)的生长速率降低,质粒分离稳定性和青霉素G酰化酶的表达水平提高。发酵过程中维持低葡萄糖水平可以限制细胞的生长速率,提高质粒稳定性和促进青霉素G酰化酶的合成。采用混合碳源发酵,发酵培养基含糊精2g/L,12h后以1g/L.h恒速流加葡萄糖至35h,控制流加过程葡萄糖浓度0.1g/L左右,平均比生长速率为0.06h-1,发酵结束时质粒稳定性为86%,青霉素G酰化酶的表达水平达23 000U/L。结论:重组大肠杆菌组成型表达青霉素G酰化酶的研究对工业生产有一定指导意义。     

利用DNA家族重排提高青霉素G酰化酶合成活力

NA家族重排技术是酶定向进化的有力工具 ,已在实际应用中获得了巨大成功。来源于Providenciarettgeri、Escherichiacoli和Kluyveracitrophila的青霉素酰化酶基因序列同源性为 6 2 .5 %～ 96 .9%。在Providenciarettgeri青霉素酰化酶基因克隆和表达的基础上 ,利用DNA家族重排技术构建了上述基因的嵌合体突变库。通过平板初筛获得有活力的阳性克隆 ,表达提取突变酶测定其合成水解活力比。对突变酶进行随机测序的结果表明多基因嵌合体突变库显示出明显的多样性。通过一轮重排及筛选 ,获得了合成活力提高 4 0 %的突变酶 ,并且发现α亚基的重排对酶合成活力的提高更加有效。上述方法的应用有望获得合成活力进一步提高的青霉素G酰化酶。     

化学修饰对青霉素G酰化酶活性的影响

为进一步阐明大肠杆菌AE 109青霉素G酰化酶(PA,E.C.3.5.1.11)的结构与功能关系,研究了数种修饰剂对酶活性的影响;同时测定了四种作用物存在下对各修饰剂修饰酶的影响。结果表明Ser残基处于酶的活性部位,Met残基可能处于与底物结合的部位,His和Cys残基与酶的活性无关。     

头孢菌素酰化酶

7-氨基头孢烷酸(7-amino cephalosporanic acid, 7-ACA)是医药工业合成大多数头孢菌素的重要原料.头孢菌素酰化酶(cephalosporin acylase, CA)催化头孢菌素C(CPC)和戊二酰-7-氨基头孢烷酸(GL-7ACA)的水解反应, 生成7-ACA.根据CA催化底物的不同, 可将其划分为两类：CPC酰化酶和GL-7ACA酰化酶.由CA的同源性、分子质量大小和基因结构, 可以把头孢菌素酰化酶划分为五种;讨论了酶的基本性质.通过CA与N端亲核水解酶(Ntn水解酶)的比较, 推测CA属于Ntn水解酶, 并由此可以进一步理解它们的生理功能.     

大肠杆菌头孢菌素C乙酰酯酶的敲除对头孢菌素C酰化酶应用的影响

7-氨基头孢烷酸(7-ACA)是合成头孢菌素类抗生素的重要中间体,工业上通常采用头孢菌素C酰化酶一步水解头孢菌素C制备,但在该反应产物中存在一个主要杂质3-去乙酰基-7-氨基头孢烷酸(D-7-ACA),该杂质的产生是由大肠杆菌中内源基因aes编码的头孢菌素C乙酰酯酶水解头孢菌素C或7-ACA引起的.为了防止D-7-AC...