一种大规模筛选单克隆及提取质粒的改进方法

利用α-互补(X-gal IPTG)从cDNA库中筛选特异克隆,以此去除含有未插入片段和插入片段小的克隆。运用展库的方法,通过辅助噬菌体对库中多个载体的切割,将载体以质粒的形式转化到大肠杆菌中;同时对质粒DNA碱裂解提取方法做了改进,建立了一种简单实用的大量提取质粒DNA的方法。该方法利用特定的蛋白质吸附膜吸附提取过程中的蛋白质,从而去除了使用酚-氯仿抽提蛋白质的复杂过程,减少了质粒DNA的损失,是一次性获得大规模质粒DNA的有效方法。获取的质粒DNA样品在纯度和浓度上都可以满足测序、PCR及Southern杂交等分子生物学实验的要求。     

衣原体pORF5质粒编码蛋白致病机制的研究进展

衣原体(Chlamydia)是一类具有独特的两相发育周期、专性细胞内寄生的革兰阴性菌,能引起人类多种疾病。pORF5是衣原体隐蔽性质粒编码的分泌性效应蛋白。近年来研究证实,pORF5质粒编码蛋白是衣原体重要的毒力蛋白,与衣原体致病密切相关。现就衣原体pORF5质粒编码蛋白的生物学特性、致炎性作用、抗凋亡作用及促自噬作用作一概述。     

玉米线立体类质粒的克隆和鉴定

S型细胞质雄性不育玉米的线粒体类质粒S-1为一个长6.4kb的双链线状DNA分子。本文对基本上全长的S-1（只用限制内切酶PstI在两端各切掉128bp）在pUC18和pBR322两种质粒中进行了克隆得到4种杂合的质粒。限制性酶切图谱证明它们分别是S-1以不同方向克隆在两种质粒中的结果,Southern印迹杂交也证明S-1克隆在pBR322中.     

猪β2-AR基因重组质粒的快速筛选

为建立一种高效快速鉴定重组质粒的实验方法,将猪β2-肾上腺素能受体（β2-AR）基因与pET-32C重组,构建β2-AR基因表达载体pET32CAR,以T7启动子引物和猪β2-肾上腺素能受体基因特异性引物为PCR引物,挑取重组质粒转化单菌落直接进行PCR,产物经电泳发现,5个候选克隆中有3个克隆扩增出了一条约2kb的特异性条带,并且插入方向正确,随机选取其中1个克隆用限制性酶切鉴定以及DNA测序验证PCR筛选的正确性,研究结果表明;在采用PCR方法对重组克隆进行鉴定时,可以直接使用细菌菌落参与反应,而无须提取克隆的DNA,与传统的实验方法相比,筛选的时间缩短至3-4h,大大提高了重组DNA的筛选效率。     

双歧杆菌质粒聚合酶基因对质粒载体稳定性的影响

目的探讨双歧杆菌天然质粒的聚合酶基因（Bifidobacterium plasmid polymerase,BPP）对人工构建的大肠埃希菌～双歧杆菌穿梭质粒载体（shuttle vector）在长双歧杆菌中稳定性的影响。方法首先电转化质粒pBADs—A和pBADs-BPP至长双歧杆菌,培养鉴定后,接种含质粒pBADs—A和pBADs-BPP的双歧杆菌于AMP^-和AMP^＋的MRS培养液中。厌氧培养后,将样品涂布于AMP^＋的MRS固体培养板上计数菌落数。结果相同条件下质粒pBADs·BPP组菌落数高于质粒pBADs—A组（P〈0．05）。结论BPP可以增加质粒载体的稳定性。     

几丁质酶表达质粒pKChiA和pMChiA的构建及表达*

从质粒pLCHIA中切出含粘质沙雷氏菌 (Serratiamarcescens)几丁质酶基因 (chiA)的 1 8kbHinfI片段 ,将其插入到表达载体pKK223-3强启动子Ptac下游的SmaI位点内 ,构建成几丁质酶表达质粒pKChiA。再用内切酶BamHI从pKChiA质粒中切出 2.1kbPtac ChiA片段 ,并将其重组到质粒pMC71A的单一BamHI位点内 ,构建成另一种几丁质酶表达质粒pMChiA。这两种质粒可在大肠杆菌HB101和JM10     

人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区的克隆和序列测定

克隆人成骨肉瘤细胞CD147基因编码区并进行序列测定。以人成骨肉瘤细胞系MG63的mRNA为模板,采用RT-PCR方法得到人CD147的编码区cDNA,克隆至载体pcDNA3．1( )中,酶切鉴定后进行序列分析。结果获得人CD147编码区基因和重组质粒pcDNA3．1( )／asCD147,并经DNA序列分析证实其序列和献报道一致。以上结果证明了CD147在成骨肉瘤细胞中也有表达,为进一步进行其结构和功能研究打下了基础。     

丙型肝炎病毒重要编码蛋白重组腺病毒载体的构建

旨在构建含HCV core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒载体。运用PCR技术扩增目的基因片段,通过酶切连接方法将上述7种基因片段克隆至穿梭质粒pAdTrack-TO4中,然后将重组质粒用PmeⅠ线性化后与骨架质粒pAdEasy-1在BJ5183细菌中同源重组。用PacⅠ酶把重组腺病毒载体线性化后转染HEK293细胞后产生重组腺病毒颗粒。利用穿梭质粒中带有绿色荧光蛋白GFP对其感染效率进行监测。结果显示,酶切鉴定和测序结果均证实含core、E1、E2、F、NS3、NS5a和NS5b基因的重组腺病毒构建成功,在感染的Huh7细胞中观察到绿色荧光蛋白GFP。成功制备了高滴度的腺病毒Ad-core、Ad-E1、Ad-E2、Ad-F、Ad-NS3、Ad-NS5a和Ad-NS5b,为后续研究奠定了基础。     

大肠杆菌中整合状态的F′质粒复制起点的克隆和分析

用标记获救法克隆了整合状态的F′质粒的复制起点,证明了由这一复制起点构成的mini-F质粒在不亲和性和对吖啶橙的敏感性方面和自主状态的F′质粒都没有不同。对这一复制起点和来自自主状态的F质粒的复制起点进行了亚克隆,并作限制性内切酶酶切分析比较,没有发现两者在结构上有差异。本文的结果提示,F质粒和F′质粒在发动染色体复制中对recA基因的依赖性的不同,可能与质粒整合在染色体上的位置不同有关。     

Anti-HIF-1α-pEGFP重组质粒的构建及表达

目的构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,转染人宫颈癌Hela细胞,用以探讨HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用。方法应用基因重组技术构建EGFP-HIF-1α反义重组质粒,通过脂质体介导将其转染入Hela细胞,倒置荧光显微镜观察转染效果,Western blot检测HIF-1α蛋白的表达。结果酶切鉴定结果显示含EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建成功,并能在Hela细胞中封闭HIF-1α蛋白的表达。结果 EGFP-HIF-1α反义重组质粒构建及转染成功,封闭Hela细胞中HIF-1α蛋白的表达,为进一步研究HIF-1α蛋白在宫颈癌的生长、转移中的作用提供试验基础。     

日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白编码基因的克隆和表达

根据曼氏血吸虫抱雌沟蛋白SmGcp序列和日本血吸虫编码抱雌沟蛋白保守区的基因片段jGcp1分别设计三对引物,以日本血吸虫中国大陆株成虫mRNA为模板 ,用RT－PCR法扩增出大小为1949bp的基因片段。经序列分析推断该基因片段含编码日本血吸虫抱雌沟蛋白基因的阅读框,与SmGcp碱基一致性为85％,其理论推测氨基酸组成与曼氏血吸虫抱雌沟蛋白的一致性为83．7％。将上述扩增的基因片段克隆到表达载体pET28c( )中,在大肠杆菌BL21中获得表达,融合表达产物分子量约为80kD。利用日本血吸虫成虫抗原免疫血清对该表达产物进行Western印迹检测,在预测位置出现了明显的识别条带,说明该编码日本血吸虫中国大陆株抱雌沟蛋白基因的表达产物具有抗原性。     

烟草花叶病毒蚕豆株系外壳蛋白基因及3‘端非编码区的克隆与序列分析

根据烟草花叶病毒Ｕ１株系序列,人工合成引物,用ＲＴ法合成了ｃＤＮＡ后,通过ＰＣＲ技术扩增并克隆了烟草花叶病毒蚕豆株系的外壳蛋白的基因和３‘端非编码区。ＤＮＡ序列测定结果表明,外壳蛋白基因全长４８０个碱基,编码１５８个氨基酸,３’端非编码区全长２０４个碱基,与ＴＭＶ－Ｕ１株系的同源率为１００％。     

IFITM1基因真核表达质粒的构建及鉴定

目的:获得IFITM1基因片段并构建真核表达质粒.方法:采用RT-PCR技术扩增IFITM1,将扩增产物连接至pcDNA3.1载体,对重组质粒进行测序验证,结果:构建了真核表达质粒pcDNA3.1-IFITM1,通过酶切、测序等方法验证完全正确.结论:成功构建了IFITM1基因的真核表达质粒,为下一步探讨IFITM1基因在子宫颈癌HeLa细胞中的作用提供了实验基础.     

白念珠菌新型耐药基因IPF14744敲除质粒的构建

目的 构建用于白念珠菌IPF 14744基因敲除的载体质粒.方法 分别扩增白念珠菌IPF 14744基因ORF两侧上下游的片段,通过酶切与连接反应,将上下游片段分别插入到p5921质粒的hisG-URA3-hisG盒两端,从而形成IPF 14744敲除载体质粒pUC-14744- URA 3.结果 成功获得IPF 14744基因敲除载体质粒.结论 所获得的质粒pUC-14744- URA3可用于白念珠菌IPF 14744基因的敲除.     

一种快速提取质粒DNA用于鉴别重组克隆的方法

介绍了一种利用过夜培养的菌液瞬时提取质粒DNA,并用于电泳鉴别含有插入子克隆的方法。事先无需准备许多繁琐的相关试剂,提取质粒的全过程只需3~5min就可完成,非常适合于做重组克隆的快速鉴别。     

地衣芽孢杆菌的β－内酰胺酶基因的克隆与穿梭质粒的建造

本文简要报道了地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)染色体上的β-内酰胺酶基因的克隆化,及以此基因为基础建造了一批能在大肠杆菌(E．Coli)和枯草杆菌(Bacillus sub-tillis)中都起作用的穿梭质粒的实验。该β－内酰胺酶基因在枯草杆菌中产生大量产物并可分泌到细胞外。     

疱疹病毒编码的miRNAs的研究进展

MicroRNAs (miRNAs)是一类长约22个核苷酸的RNA,在数量、序列、结构、表达和功能上具有多样性。目前,通过生物信息学手段和分子克隆方法,已发现了3518种miRNAs,在控制细胞的生长发育、分化、凋亡等过程中发挥着十分重要的作用。最近研究发现某些病毒基因组也能够编码miRNAs,其中大部分为疱疹病毒,这些miRNAs在调控病毒自身表达以及病毒与宿主相互作用方面可能起到重要的作用。找出病毒可能编码的miRNAs,探索其对病毒感染、复制、表达的作用,有助于病毒分子生物学的研究,也会为研发防治病毒的新方法和新途径提供新的思路。     

细菌素编码基因的定位分析

细菌素生物合成相关的基因经常成簇出现:结构基因、对自身产生免疫的基因及产生辅助蛋白质的基因组成操纵子结构,其中结构基因是细菌素编码基因,它可能在质粒上也可能在染色体上,为了初步定位细菌素编码基因是在质粒上还是染色体上,综述细菌素编码基因的初步定位方法,为深入研究细菌素提供依据。