乙型肝炎病毒表面抗原基因在中国地鼠卵巢细胞中的高效表达及纯化抗原免疫原性的研究

本文报告了两个拷贝的adr亚型HBs基因的pSV2质粒组建,其中一个拷贝只含S基因,受SV40早期启动子的直接控制,另一个拷贝连接于pSV2质粒dhfr基因下游,含有前S和S基因及其本身的启动子,用此重组质粒转化CHO-dhfr~-细胞,经选择,获得了高效表达HBsAg的CHO-32-C23及CHO-Ⅱ-5细胞系,最佳培养条件及HBsAg分泌动态的研究结果表明,CHO-Ⅱ-5系细胞分泌HBsAg的最佳条件是37℃培养,培养基中加2％小牛血清,每日收换液;用5％小牛血清,每48小时收换液则次之,但较实用,转瓶培养产量约2.μg/ml,将CHO-32-C23细胞系产生的液体初步纯化,在聚丙烯酰胺凝胶上显示23k和27k蛋白带,用其免疫NIH小鼠,EDSO为0.119μg,对照血源菌ED_(50)为0.083μg,二者的免疫原性近似。     

转基因中国地鼠卵巢细胞B43系分泌的乙型肝炎病毒表面抗原颗粒中gp30的分子组成

使用生化和免疫沉淀方法,对转基因CHO细胞B43系分泌的乙型肝炎(乙肝)病毒表面抗原(HBsAg)颗粒在SDS-PAGE上出现的30kD多肽,进行了分子组成的研究。首先用蛋白转移抗体酶染方法证明是特异性HBsAg,再用糖染色法证明是糖蛋白,以gp30命名之。观察到,随纯化产品在4℃保存时间的延长,gp30逐渐消失,说明gp30不够稳定。含gp30的样品经过胰酶消化后的电泳带形和血源HBsAg对照者基本相同。放射免疫沉淀试验发现细胞内的目的基因的翻译产物只有p23,其后逐步合成gp25、gp27及gp30。用衣霉素抑制或用内源性糖苷酶-F处理的样品,gp27的糖链消失,形成p23;而gp30的一个与gp27相同的糖链也消失,从而形成“gp27”,说明gp27及gp30中均有一个-N-连接的糖链。而在gp30中尚有另一种不受衣霉素和糖苷酶-F处理影响的、由-O-连接的糖基,由此形成“gp27”。分析工程细胞在合成、运输及分泌过程中逐步形成p23、gp25、gp27和gp30,后者是由p23双糖化而成。     

应用杆状病毒载体在昆虫细胞系统中表达乙型肝炎病毒表面抗原基因

构建了同时带有乙型肝炎病毒表面抗原基因和大肠杆菌的β-半乳糖苷酶基因的杆状病毒转移载体质粒pVL941lacHBS。应用磷酸钙沉淀技术将pVL941lacHBS DNA转入事先用AcNPV感染过的Sf9细胞,在显色剂X-gal存在下,筛选无多角体的蓝色蚀斑。经过若干次蚀斑纯化,最后获得含乙肝病毒表面抗原基因和β-半乳糖苷酶基因的重组杆状病毒R-AcV941LS。 用R-AcV941LS感染Sf9细胞,在感染后72～96小时,用RPHA和RIA分别检测组织培养上清液和细胞裂解液中的乙型肝炎病毒表面抗原含量。结果,组织培养上清液为3.83μg/1×10~6～2×10~6细胞;细胞裂解液为4.39μg/1×10~6～2×10~6细胞。乙型肝炎病毒表面抗原的合成总量为8.22μg/1×10~6～2×10~6细胞。免疫电镜观察显示表达产物呈约22nm的球形颗粒。小鼠免疫接种实验结果表明,以R-AcV941LS感染Sf9细胞表达的乙型肝炎病毒表面抗原与在哺乳动物细胞系表达的乙型肝炎病毒表面抗原具有相近似的免疫原性。     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在异源细胞中的表达研究

本研究构建了一系列乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因的表达载体,其中HBsAg基因的启动区被小鼠金属硫蛋白启动子取代;而对HBsAg基因下游非编码区的几种基因元件则进行了不同的删除,并且添加异源基因调控元件。利用Hela细胞瞬时表达系统对各种构建物的表达水平进行分析。实验发现：除了必须取代HBsAg基因原有的启动子外,乙型肝炎病毒(HBv)增强子Ⅰ及其多聚腺苷酸化(poly A)信号对HBsAg在非肝脏细胞中表达也至关重要。但HBsAg的poIy A信号可用异源的poly A信号及猴空泡病毒(sV 40)T抗原基因的剪接信号取代。在HeLa细胞表达系统中,这种取代可进一步提高HBsAg的表达水平。反之,HBV增强子Ⅱ在HeLa细胞中对HBsAg基因的表达无显著作用。实验结果提示：除了已报道的HBV增强子Ⅰ能激活基因本身的启动子外,很可能还存在另外的功能,即对HBsAg转录体起稳定作用。     

乙型肝炎病毒表面抗原S和前S1融合基因转基因细胞系的建立与细胞性质的研究

构建了ｐＣＨＢＳＳＩＧ质料,其特点是ＣＭＶ立即早期启动子调控乙型肝炎（乙肝）表面抗原Ｓ＋前Ｓ１融合基因在前,ＳＶ４０早期启动子调控ＧＳ扩增基因在后,此质粒转化到ＣＨＯ－ｄｈｆｒ＾－细胞中,经克隆加ＭＳＸ及ＭＴＸ筛选、扩增,建立了７个高效表达乙肝表达抗原Ｓ及前Ｓ１融合蛋白细胞系ＧｄＳＳ１,并检测了其中ＧｄＳＳ１－１８细胞系的生物学特性,结果表明：未发现微生物污染,无致瘤性、遗传稳定,电镜下可观察到２     

乙型肝炎病毒表面抗原基因在昆虫体系中的表达

利用组建的苜蓿尺蠖核型多角体病毒(AcNPV)非融台蛋白基因转移载体将乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)基因成功地插入粉纹夜蛾(Tn)NPV中,HBsAg基因在感染了重组病毒的草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)离体细胞以及粉纹夜蛾和蓖麻蚕等虫体中获得了表达,免疫电镜下观察到典型的乙型肝炎病毒表面抗原22nm颗粒。感染重组病毒的蓖麻蚕预蛹每克蛹重可产HBsAg蛋白1．6μg。表达产物经DEAE－纤维素层析得到的HBsAg粗提物可作临床检测用,再经抗体亲和柱层析可得到纯的HBsAg。     

乙型肝炎病毒表面抗原preS1在大肠肝菌中的表达与鉴定

本文报告利用ｐＷＲ５９０质粒为载体,构建了含ｌａｃ启动子,β－半乳糖苷酶（１－５９０）基因,Ｘａ因子的四肽识别位点和ＨＢＶ ｐｒｅＳ１,ｐｒｅＳ２编码序列的表达质粒,并成功地大肠杆菌中获得稳定表达。融合蛋白经Ｘａ因子消化和高效液相层析,得到了ｐｒｅＳ１（１－９１）纯肽。此肽特异性地与人肝细胞质膜结合,从而为肝细胞上存在ｐｒｅＳ１受体提供了直接的实验依据,也为分离和鉴定肝细胞上ｐｒｅＳ１受体打下良好     

乙型肝炎病毒adr和adw亚型表面抗原在非洲绿猴肾细胞中的表达

用pSV2-gPt作载体,将乙型肝炎病毒adr亚型的全序列基因和adw亚型的Bgl Ⅱ大片段DNA分别插入PSV 2-gpt BamHI及Bgl Ⅱ切口,获得4种重组质粒。它们都含有SV40DNA复制起始点、早期启动子、大肠杆菌黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶(XGPRT)和氨苄青霉素抗性基因(Apr)。经酶切鉴定,选出正向重组质粒PSV 2-gbr1和pSV 2-gbw1,并分别转化Vero细胞,在选择培养基的压力下,两个质粒所含乙型肝炎表面抗原DNA均得到表达。     

利用人摄金蛋白(METALLOTHIONEIN)启动子和牛乳突瘤病毒在哺乳动物细胞中表达乙型肝炎表面抗原

用人Metallothioenin-Ⅱ启动子、乙型肝炎表面抗原基因,SV40早期基因的编接位点和多聚A位点构成了表达组件,然后插入到经改造过的BpV-1质粒中。所得质粒pdMTsAg-5转染小鼠C127细胞得到转化克隆。Ausria Ⅱ检测证明13株中有12株能产生HBsAg。对其中一株进行HBsAg收率观察,隔天收获为292.6～525.8μg/升,每天收获为200.9～369.0μg/升,可连续收获60天以上。经重金属离子诱导后,收率增至583～854.4μg/升。培养液经超滤浓缩和两次密梯离心后,可集中为一个狭窄的峰,顶峰的Ausria Ⅱ cpm为1.05×10~7,密度为1.20g/ml。     

表达乙型肝炎病毒表面抗原和Epstein-Barr病毒膜抗原的双价痘苗病毒的组建

从痘苗病毒天坛株分离了晚期11k蛋白编码基因的启动子,以痘苗病毒天坛株为载体,构建了双价的重组痘苗病毒。分别在7.5k和11k蛋白基因启动子的控制下,表达乙型肝炎病毒表面抗原和EB病毒的膜抗原。用重组痘苗病毒免疫的家兔,同时产生对这两种抗原的抗体。免疫电镜下观察到乙型肝炎病毒表面抗原颗粒。     

激活补体类乙型肝炎病毒表面抗原(HBsAg)循环免疫复合物在急慢性乙型肝炎中的意义

激活补体类HBsAg循环免疫复合物(HBsAg/C3-CIC )的检出率,与HBV复制标志的关系,在急慢性乙型肝炎病毒感染中表现不同。在慢性肝病(包括慢性迁延性乙型肝炎、慢性活动性乙型肝炎、乙型肝炎后肝硬化和HBV感染指标阳性的原发性肝癌)患者中,HBeAg阳性者,其HBsAg/C3-CIC的检出率显著高于HBeAg阴性者,且随HBeAgS/N值的升高而增加。在由HBV e系统组合成的四种模式中,单纯HBeAg阳性模式的检出率显著高于其它三种模式;在多聚白蛋白受体(PHSAr)阳性者中检出率显著高于PHSAr阴性者。而急性乙型肝炎(AH)的HBsAg/C3-CIC检出率无类似差异。这些结果提示,HBsAg/C3-CIC在HBV感染的急慢性肝病中具有不同的病理生理意义。     

乙型肝炎病毒adr亚型NC-1毒株表面抗原基因的顺序测定与结构研究

用内引物法自pHBVNC-1质粒DNA经Sau3A1降解的1.3Kb片段中,快速、连续测定了HBV adr NC-1表面抗原基因全顺序,与其它三株adr亚型S基因比较,顺序同源性为99％,与adw及ayw亚型比较,同源性为94％。不同亚型间的错义突变比同一亚型不同毒株间的错义突变多。比较11株adr亚型、2抹adw亚型与2株ayw亚型的S基因全顺序,发现在第47,110,113,126,160位的密码子在r亚型中有同源性,在w亚型中也有同源性,所以是w/r亚型决定簇的候选部位。第46,68,134,159,168位的密码子在d亚型中有同源性,而在y亚型中也有同源性,所以是d/y亚型抗原决定簇的候选部位。