腺病毒基因组DNA的分子克隆

腺病毒基因组ＤＮＡ的分子克隆ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇｏｆＡｄｅｎｏｖｉｒｕｓｅｓ’ＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡ。／／曲章义,郭彩铃,牛美娟,王玉兰,李绍贤（哈尔滨医科大学微生物学教研室哈尔滨１５００８６）腺病毒是儿童呼吸道感染的重要病原,严重地威胁着儿童的健康和生命安全,尤其是我国北方地区,腺病毒感染更为严重。但目前尚无腺病毒感染的特异性快速诊断和预防方法,不利于腺病毒的早期预防和治疗,因而,对腺病毒感染进行快速、特异性诊断和预防具有重大意义。     

S1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1 核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下 ,该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构 ,对质粒pUC19的实验证明 ,S1 核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在 2 5 μL总反应体积中 ,按 10 0ngDNA加入 5u至 17u的S1 核酸酶 ,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小 ,单酶切位点的出现率较低 ,很难用常规方式进行克隆 ,以S1 核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒 (5 37bp) ,经S1 核酸酶线形化后 ,成功地克隆到pMD18 T载体上。     

犬Ⅰ型腺病毒DNA的酶切分析及分子克隆

犬Ⅰ型腺病毒(CAV-1)弱毒用限制性内切酶EcoR Ⅰ,BamH Ⅰ,Pst Ⅰ,Sph Ⅰ和Hind Ⅲ消化分析后其图谱与强毒株相比没有差异。将弱毒DNA用Pst Ⅰ完全消化后以鸟枪法克隆到载体质粒pBluescrip'SK中,经用光生物素标记的CAV-1 DNA杂交筛选以及Pst Ⅰ分析重组质粒证明已将分子量为5.5,3.5,2.85,1.2,0.32和0.28Kb的CAV-1DNA片段克隆到质粒中。克隆到的这些片段将可考虑进一步研究作为探针检测犬及狐狸等野生动物的腺病毒感染。     

鸭和人乙型肝炎病毒DNA体外高效转录体系分子克隆的建立

分子生物学的发展主要在于其所必需技术的发展,体外放射标记出高比活的DNA分子探针,可提高核酸分子检测的敏感性。目前,国内使用的HBV DNA分子探针,均为缺刻转移(Nick Translation)方法标记,敏感性可检出1-2Pg,1984年Melton等报告了依DNA为横板在体外转录合成高比活的单链RNA探针(SSRNA-p)敏感10倍。     

诺卡氏菌酰胺酶基因的分子克隆及在大肠杆菌中表达的初步研究

酰胺酶是一种重要的工业酶。利用生物信息学手段,在和已知酰胺酶基因序列分析比对的基础上,首次从Ncordiasp.YS-2002中成功地克隆得到酰胺酶基因ami,并对其基因序列及氨基酸序列的性质进行了分析。结果表明,所得酰胺酶基因ami片段大小共为1446bp,由启动子区、阅读框和回文结构终止区三部分构成。序列分析和进化树分析表明,Ncordiasp.YS-2002酰胺酶是一种比较特殊的酰胺酶,不含大多数酰胺酶共同具有的保守区序列。进一步将酰胺酶基因连接到pET-28a( )上,转入大肠杆菌BL21(DE3)中筛选获得重组菌株PEAB。酶活测定结果表明重组菌具有酰胺酶酶活,但较低,其原因可能是因为大量表达的产物主要以包涵体的形式存在。     

DNA测序技术的进展和挑战

基因是人类的遗传信息的载体,其遗传和表达影响人类的繁衍及各种生命活动;个体基因组DNA序列突变往往会导致疾病的发生,获取个体的基因组DNA序列将有助于疾病的诊断.DNA测序技术潜在的医学应用前景使其近几年有了飞速的发展.本文将介绍各代DNA测序技术已经取得的进展,目前尚待克服的挑战及可能的解决办法,并着重分析最新的单分子测序技术的发展潜能及临床应用前景.     

S1核酸酶作用与微环DNA分子的克隆策略

米曲霉来源的S1核酸酶具有降解单链DNA或RNA的作用。在适当的条件下, 该酶能将不同的环形DNA分子从超螺旋转变成开环和线形结构,对质粒Puc19的实验证明, S₁核酸酶的这种转变作用与加入的酶量呈正相关。在25μL总反应体积中,按100ng DNA加入5u至17u的S1核酸酶,能获得较高比例的线形DNA。由于微环DNA分子太小,单酶切位点的出现率较低,很难用常规方式进行克隆,以S₁核酸酶进行线形化是微环DNA克隆的途径。pC3是已知最小的真核生物线粒体DNA类质粒（537bp）,经S₁核酸酶线形化后,成功地克隆到pMD18-T载体上。     

大粉瘤菌小亚基rDNA片段的克隆测序

对大粉瘤菌Lycogalaflavofuscum的19SrDNA片段进行了克隆测序,序列长度为1443bp。同时将之与多头绒泡菌的相应序列进行了比较,其序列同源性为58.16%。     

泡桐丛枝病类菌原体DNA的分子克隆与序列分析

以部分纯化的泡桐丛枝病类菌原体为材料,抽提ＤＮＡ,进行ＥｃｏＲ Ⅰ－Ｈｉｎｄ Ⅲ双酶切,回收的ＤＮＡ 片段插入到载体ｐＧＥＭ－３Ｚｆ（＋ ）中,转化Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ ５α。经双重杂交初筛以及Ｄｏｔｂｌｏｔ和Ｓｏｕｔｈｅｒｎ ｂｌｏｔ杂交的回交确证,获得两个仅与患丛枝病泡桐总核酸有杂交而与健康对照无杂交的克隆（Ａ４,１．６９ ｋｂ;Ｃ４２,２．０８ ｋｂ）。部分测序的结果表明：Ａ４ 和Ｃ４２插入片段中Ａ＋Ｔ含量分别为７２．５％ 和６７．９％ ,具有典型支原体属微生物的碱基组成特征     

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒(BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段,经pGEM-T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因2379bp长的核苷酸序列,推导出793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示,BusuNPV与HzSNPV的同源性最高,达57%;与OpMNPV的同源性最低,为39.6%。     

The linear mitochondrial plasmid pClK1 of the phytopathogenic fungus Claviceps purpurea may code for a DNA polymerase and an RNA polymerase

Summary Plasmid pClK1, a linear mitochondrial plasmid of Claviceps purpurea, was completely sequenced. The sequence contains two long open reading frames (ORF1, 3291 bp; ORF2, 2910 bp), and at least four smaller ORFs. The potential polypeptide derived from ORF1 shows homology to the family B type DNA polymerases. The product of ORF2 has significant homology to the mitochondrial RNA polymerase of yeast and RNA polymerases from bacteriophages. ORF1 and ORF2 show homology to URF3 and URF1 of the maize plasmids S1 and S2, respectively. No homology to any published protein sequence was found for the smaller ORFs. The origin of the terminal protein attached to the 5 ends of pClK1 remains open; several alternatives for its origin are discussed. The sequence data as a whole confirm the virus-like character of pClK1 already postulated from structural properties. Thus pClK1 together with S plasmids of maize and several other linear plasmids make up a distinct class of DNA species of plants and fungi probably derived from a common virus-like ancestor.     

油桐尺蠖核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

用PCR方法从油桐尺蠖核型多角体病毒 (BusuNPV)中扩增出DNA聚合酶基因片段 ,经pGEM T载体克隆到大肠杆菌DH5α菌株中。经自动序列分析仪测出DNA聚合酶基因 2 379bp长的核苷酸序列 ,推导出 793的氨基酸序列。氨基酸同源性比较显示 ,BusuNPV与HzSNPV的同源性最高 ,达 57% ;与OpMNPV的同源性最低 ,为 39.6 %。     

中国棉铃虫核型多角体病毒DNA聚合酶基因的克隆和序列分析

应用谷实夜蛾核型多角体病毒（ＨｚＳＮＰＶ）ＤＮＡ聚合酶基因ＨｉｎｄⅢ／ＰｓｔⅠ３５９６ｂｐ片段作探针,经Ｓｏｕｒｔｈｅｒｎｂｌｏｔ杂交,克隆了中国棉铃虫核型多角体病毒（ＨａＳＮＰＶ）完整的ＤＮＡ聚合酶基因,大小约为３．４ｋｂ。限制性内切酶分析表明,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶基因限制性内切酶图谱与ＨｚＳＮＰＶ相似。用双脱氧链终止法测定该基因部分核苷酸序列（８０５ｂｐ）,推导出编码区２０６ａ。序列同源性比较显示,ＨａＳＮＰＶＤＮＡ聚合酶与ＨｚＳＮＰＶ之间具有高度的同源性;与ＬｄＭＮＰＶ、ＡｃＭＮＰＶ、ＢｍＳＮＰＶ、ＣｆＭＮＰＶ和ＯｐＭＮＰＶ也具有一定的同源性     

禽Ⅰ型副粘病毒f基因克隆及序列分析

用RT-PCR一步法对云南省不同禽类(鸡、鸽子)3株禽I型副粘病毒F基因进行扩增和克隆,并对其f基因片段核苷酸序列进行分析,结果表明,云南省禽I型副粘病毒各毒株同源性为88.1%～94.9%,与疫苗株LaSota和强毒株F48E9的同源性为85.6%.所分离两株新城疫病毒在F蛋白裂解位点区(112～117aa)的氨基酸序列与强毒株在这一区域的序列完全相同,表明为强毒株.鸽I型副粘病毒F蛋白裂解位点区的氨基酸序列与PPMV ZQ98-1株在这一区域的序列完全相同,揭示为中强毒株.以1 662bp核苷酸绘制系统发育树,表明云南地方新城疫病毒属于基因Ⅶ型,鸽I型副粘病毒属于基因Ⅵ型.     

刺猬高重复顺序DNA的分子克隆及核苷酸顺序分析

为了分析比较食虫目高重复顺序的结构特征,我们将食虫目动物刺猬的高重复顺序DNA进行了分离、纯化、分子克隆,并测出了1186bp的核苷酸顺序。经分析发现在碱基组成上它与食虫目另一动物臭鼩有许多相似之处,如:G-C碱基对与A-T碱基对在整个片段中分布很不均衡;片段内部含有许多连续多次重复的短片段等,很可能为食虫目动物所特有。     

鳗弧菌毒力质粒DNA序列的测定

采用亚克隆法与引物步移法相结合的测序战略 ,对海洋鱼类重要病原菌鳗弧菌毒力质粒pEIB1进行序列测定 ,测得整个质粒序列长度为 6 6 16 4bp。序列的初步分析结果表明 ,G C含量为 4 2 .7% ,共有 4 4个可读框 (ORF) ,其中包括与铁载体合成、调节、运输以及质粒复制相关的基因。     

Cloning and Sequencing of rpoA Gene from Rice Chloroplast Genume

The result of southern hybridization showed that the rice chloroplast genome can encode its own RNA polymerase. The α subunit gene fragment of this enzyme has been cloned into E. coli plasmid pUC 19. By deletion method and dideoxynucleotide chain termination, we analysed its nucleotides sequence. This gene consists of 337 codons. It reserves a high homology between rice, monocotyledonous plant and tobacco, dicotyledonous.     

鹅细小病毒主要免疫原性蛋白基因的克隆与序列分析

利用PCR技术,从纯化鹅细小病毒SYG99-5毒株鹅胚尿囊液中扩增出病毒主要免疫原性蛋白基因.将该PCR扩增片段克隆入pGEMR-T质粒载体的HincⅡ和SacⅠ位点之间,酶切分析筛选并进一步通过Southern杂交验证后,获得含1.6kb基因片段的重组质粒GpG3.序列测定结果表明,该片段与国外已报道的GPV B株苷酸序列有96%的同源性,氨基酸序列有97%的同源性.     

Plasmid DNA purification using a multimodal chromatography resin

Multimodal chromatography is widely used for isolation of proteins because it often results in improved selectivity compared to conventional separation resins. The binding potential and chromatographic behavior of plasmid DNA have here been examined on a Capto Adhere resin. Capto Adhere is a recent multimodal chromatography material allowing molecular recognition between the ligand and target molecule, which is based on combined ionic and aromatic interactions. Capto Adhere proved to offer a very strong binding of nucleic acids. This property could be used to isolate plasmid DNA from a crude Escherichia coli extract. Using a stepwise NaCl gradient, pure plasmid DNA could be obtained without protein and endotoxin contaminations. The RNA fraction bound most strongly to the resin and could be eluted only at very high salt concentrations (2.0 M NaCl). The chromatographic separation behavior was very robust between pH values 6 and 9, and the dynamic binding capacity was estimated to 60 µg/ml resin. Copyright © 2014 John Wiley & Sons, Ltd.