荧光探针研究新进展

自从Southern(1975)首次进行DNA探针杂交后,至今核酸分子杂交已成为分子生物学的最基本方法。Matthews和Kricka[1]总结了各种杂交方法,将其归为两大类:一是异相杂交(heterogeneousassay)即固相杂交,目的核酸结合于不溶性支持物上;二是同相杂交(homogeneousassay)即液相杂交,一般同时使用两个探针。为了检测杂交,寡核苷酸探针需要标记,探针的标记物有放射性同位素和非放射性标记物。固相杂交常使用放射性同位素,荧光素是一种非放射性标记物,它能检测到的DNA浓度比吸收减色测定方法所需DNA浓度低100-1000倍[2],在同相杂交中广泛用于探针的标记。最近,荧光探针研究获得了新的进展,Tyagi和Krammer(1996)建立了一种新的荧光探针-分子信标探针,并得到许多应用,我们实验室也开展了这方面的研究。本文拟对荧光探针的研究进展作一综述。     

核酸测定中的有机荧光探针

对历来利用荧光分析技术研究和定量测定核酸的情况加以简单的综合评述。介绍了截至目前用于核酸研究和测定的一些主要有机荧光试剂,并对新兴的如有机纳米探针和分子信标等荧光分析技术以及有机荧光试剂的发展前景进行评述。     

细胞钙离子荧光探针研究进展

钙离子(Ca²⁺)广泛参与细胞生理病理反应,其含量和在胞内位置的改变可激发不同效应。因此,快速有效检测胞内Ca²⁺浓度及其分布对于了解其在细胞活动中的作用具有重要意义。荧光探针法由于灵敏度高、使用方便、成本低廉等优点得到广泛应用,但不同类型的探针在准确性、灵敏度和稳定性等方面各有优劣。本文系统总结了现有的Ca²⁺化学荧光探针和基因编码探针,为开展Ca²⁺相关研究时合理选择检测方法提供参考。     

血小板内游离钙和cAMP在实验性动脉粥样硬化进程中的变化

血小板激活后,其粘附、聚集和释放功能异常在动脉粥样硬化(AS)发病机理中占有重要地位。然而,血小板活性在AS不同病理阶段的变化规律罕见报道。本项研究目的在于阐述实验性AS进程中血小板内游离钙([Ca~(2 )]_i)和cAMP浓度的变化规律,为适时和正确应用抗血小板药物防治AS提供一定的理论参考。     

基于抗真菌药物的近红外荧光探针研究进展CSCD

随着免疫抑制剂、激素以及抗生素的广泛使用,侵袭性真菌,尤其是白念珠菌、新生隐球菌、曲霉、肺孢子菌等深部真菌感染的发病率、致死率逐年升高[1-2]。由于深部真菌种类较多,感染症状无特异性,故常漏诊、误诊。同时,真菌感染传统的实验室诊断方法,如真菌涂片镜检、真菌培养、影像学检查等虽各有优势,但难以兼顾高特异性、高敏感性和高效性的特点[3-4]。     

构建钙荧光探针细胞用于探究胞浆和线粒体钙对ATP刺激的响应

目的:构建表达基因编辑钙探针(GECIs)的细胞系HeLa-GECIs,探究细胞应答外界ATP刺激中钙离子在细胞内的响应和变化。方法:分别用能够直接通过荧光强度反映细胞胞浆内和线粒体内钙离子相对浓度的2种钙探针cyto-GCaMP6和4mt-GCaMP6感染HeLa细胞,获得2种表达钙离子探针的HeLa细胞系;在感染了2种腺病毒探针24 h后,用共聚焦荧光显微镜检测荧光探针在HeLa细胞内的表达情况;在表达2种钙探针的细胞的培养基中加入外源ATP,用Time-lapse成像动态观测技术观察HeLa细胞内钙离子对外环境中ATP的响应。结果:共聚焦荧光显微镜观察,确定95%以上的细胞表达了对应的钙离子指示荧光探针;Time-lapse成像动态观测技术观察发现,在细胞培养基中加入ATP后,细胞胞浆钙探针荧光强度瞬时(3～6 s)升至10倍,200 s后逐渐降低到基础水平;线粒体钙到达峰值(4倍)的时间稍滞后(5～8 s),并且回落更慢,300 s时至1.5倍。在ATP受体P2X7抑制剂A438079预处理的实验组,上述胞浆钙和线粒体钙浓度上升不明显。结论:构建了能在活体细胞内通过荧光探针实时监测钙离子响应胞外ATP刺激的细胞实验体系,为进一步深入探究ATP等危险信号导致细胞的炎性损伤机制奠定了基础。     

利用荧光探针直接测定线粒体活性氧的形成

目的与方法：根据荧光探针－还原型二氯荧光素（2‘,7‘-dichlorodihydrofluorescin,DCFH)可与活性氧（reactive oxygen species,ROS)反应生成荧光物一氧化型二氯荧光素（2‘,7‘-dichlorofluorecin,DCF)的原理,设计了利用荧光分光光度计直接定量检测线粒体活性氧生成并可观察在各种实验条件下线粒体活性氧产生动态变化的方法。结果与结论：线粒体在态4呼吸状态下,DCF的荧光强度随时间呈线性增加,表明活性氧以恒定速率产生。将荧光强度随时间变化的数据点拟合,线性回归直线斜率与活性氧产生的速率呈正比,测定中加入叠氮钠和丙二酸可分别使线粒体活性氧产生增加和减少。DCF荧光强度增加速率与线粒体浓度在一定范围内呈线性关系。复管实验表明重复性良好。     

白藜芦醇甙对血小板聚集功能及内钙水平的影响

为了研究白藜芦醇甙(polydatin,PD)的抗血小板聚集作用及对细胞内钙水平的影响,并探讨其抗血栓形成作用的机制,应用Bom比浊法和Grynkiewicz方法分别测定PD对兔血小板聚集功能和血小板内钙水平的影响。PD在体外显著抑制花生四烯酸(arachidonic acid,AA)和腺苷二磷酸(adenosine diplrasphate,ADP)诱导的富血小板血浆中的血小板聚集,其半数抑制浓度(medium inhibitory concentration,IC50)分别为5．13及10．0μmol／L;5、10和20mg／kg的PD静注均明显降低兔血小板聚集率,且呈明显的剂量一效应关系;PD明显减少兔洗涤血小板内钙释放及外钙内流,本实验说明PD体内、外均有明显的抗血小板聚集作用,其机制与其降低血小板内钙浓度密切相关。     

基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针的构建及应用

荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)是基于荧光基团供体和荧光基团受体间偶极子–偶极子耦合作用的非辐射方式的能量传递现象。基于荧光蛋白的FRET技术已被广泛用于研究细胞信号通路中蛋白质–蛋白质活体相互作用检测、蛋白质构象变化监测以及生物探针的研制中。基于荧光蛋白的荧光共振能量转移探针使得人们可以在时间和空间层面上研究细胞信号的转导过程。该文简要介绍了四大类基于荧光蛋白的FRET生物探针的设计、研制以及其在生物信号分子检测、活细胞成像以及药物筛选中的应用和进展情况。     

血小板钙信使系统与血小板功能的关系

钙是人和动物体液中的重要离子成份,血清中钙含量约2.5×10~(-3)mol/L,其中半数呈离子状态。细胞内液Ca~(2 )浓度一般低于10~(-6)mol/L(1μmol/L),浓度下降或上升过多都会引起细胞机能活动失常,甚至导致细胞死亡。 20多年前就已认识到钙是一种调节细胞功能的重要物质,例如肌肉收缩、染色体在细胞分裂时的滑动、精子运动、血小板变形和分泌、白细胞的吞噬作用、淋巴细胞的分裂以及神经末梢递质释放等功能均与Ca~(2 )调节有关。此外,Ca~(2 )也参与许多代谢反应的调节。     

基于钙黄绿素的荧光分光光度法测定谷胱甘肽

目的：基于钙黄绿素的荧光分光光度法建立一种测定谷胱甘肽的新方法。方法：在pH=8.0介质中,铜（Ⅱ）与钙黄绿素配位引起荧光猝灭,由于谷胱甘肽与铜（Ⅱ）的亲和力很强,可从钙黄绿素-铜离子的络合物中夺取铜离子而使钙黄绿素游离出来使荧光强度得以恢复,荧光恢复的程度与加入谷胱甘肽的浓度在一定浓度范围内成线性。结果：据此建立了一种测定谷胱甘肽的新方法,该方法的线性范围为2.0×10-6～1.4×10-5mol.L-1,F=8.1964C＋196.43,检测限为1.0×10-6mol/L。结论：用此法测定谷胱甘肽简便快速,灵敏度高。     

基于钙黄绿素的荧光分光光度法测定谷胱甘肽

目的:基于钙黄绿素的荧光分光光度法建立一种测定谷胱甘肽的新方法。方法:在pH=8.0介质中,铜(Ⅱ)与钙黄绿素配位引起荧光猝灭,由于谷胱甘肽与铜(Ⅱ)的亲和力很强,可从钙黄绿素-铜离子的络合物中夺取铜离子而使钙黄绿素游离出来使荧光强度得以恢复,荧光恢复的程度与加入谷胱甘肽的浓度在一定浓度范围内成线性。结果:据此建立了一种测定谷胱甘肽的新方法,该方法的线性范围为2.0×10-6～1.4×10-5mol.L-1,F=8.1964C+196.43,检测限为1.0×10-6mol/L。结论:用此法测定谷胱甘肽简便快速,灵敏度高。     

用稳态荧光探针研究竹红菌乙素光敏损伤对人红细胞膜流动性的影响

本文以红细胞膜为材料,用了三种稳态荧光探针研究了HB光敏作用引起人红细胞膜流动性的改变.实验结果表明在HB光敏作用下,膜的旋转扩散速度和侧向扩散速度均发生明显变化,ANS和DPH探针测得HB引起膜流动性降低,也就是膜粘度增加,用芘探针结果则表明膜的侧向扩散变慢.本文还对HB光敏作用的机理进行了探讨,我们观察了数种单重态氧猝灭剂,羟自山基猝灭剂和抗氧化剂对于光敏作用的影响,分别测定了膜流动性和膜的内源荧光的变化,发现在HB光敏作用中,除了~1O_2的作用之外,还存在其它自由基的作用.在HB与HA光敏能力的比较中发现,在比较高一些浓度条件下,存在着HB大于HA的趋向.     

荧光探针Bis-ANS和磷酸丙糖异构酶的相互作用

研究了极性荧光探针Bis-ANS和磷酸丙糖异构酶的相互作用。我们发现由磷酸丙糖异构酶(TIM)中Trp残基和结合在TIM分子上的Bis-ANS之间的能量传递引起的Trp残基荧光的淬灭呈双相性,表明Bis-ANS在TIM分子上可能有2个不相同的结合位点,其结合的解离平衡常数Kd分别为3.3μM和17.0μM。底物GDP引起已结合的Bis-ANS荧光强度进一步增强和荧光谱的蓝移说明GDP可影响Bis-ANS在TIM分子上结合部位的构象,使其疏水性增强。我们还观察到由于结合在同一TIM分子上的Bis-ANS之间的能量传递引起的退偏振,进一步证明Bis-ANS有2个结合部位在1—2800bar压力范围里,增高压力引起结合在TIM分子上的Bis-ANS荧光进一步增强和光谱蓝移,说明TIM在压力下解离成亚基的过程中发生了Weber提出的"conformationaldrift。     

荧光标记寡核苷酸探针及其应用

寡核苷酸探针的标记非常重要。近年来 ,用荧光染料对探针进行非放射性标记受到很大重视 ,并取得了迅速发展 ,广泛应用于核酸序列测定、基因检测以及疾病诊断等。以下就寡核苷酸探针的荧光标记及其应用作一简要综述。     

钙荧光探针Fura-2/AM对大肠杆菌细胞的负载行为

Fura-2/AM作为一类高效的钙离子荧光探针,在动物细胞中已得到较成功的应用,但在微生物细胞分析方面鲜见报道。该文系统研究了该探针的荧光光谱特征及其在大肠杆菌细胞内的负载行为,并考察了在大肠杆菌细胞中钙离子与Fura-2的结合情况。为利用其研究大肠杆菌等微生物细胞内钙离子浓度及钙离子跨膜行为奠定了基础。     

血小板激活时胞质游离钙浓度与两种颗粒数变化的相关性

用电镜形态计量法检测血小板α颗粒（αＧ）和致密颗粒（ｄＧ）的数密度,用钙荧光指示剂Ｆｕｒａ２检测血小板胞质游离Ｃａ＾２＋浓度（「Ｃａ＾２＋」ｉ）,观察到在钙离子导体Ａ２３１８７作用下,血小板「Ｃａ＾２＋」ｉ明显升高。凝血酶与ＡＤＰ也都分别引起「Ｃａ＾２＋」ｉ升高,且有浓度依赖性,选用三种激动剂的不同量以反映血小板不同程度激活时,测定「Ｃａ＾２＋」与颗粒数密度,分析两者间的相关性,发现αＧ和ｄＧ的数     

荧光量子点探针及其标记技术

量子点作为一种新型荧光标记物,与有机染料和荧光蛋白质相比,它们具有可调谐且宽的吸收光谱,激发可产生多重荧光颜色、强荧光信号、抗光漂白能力强等独特的光学特性,使其广泛应用在生物和医学领域。该文就量子点探针的表面修饰和功能化及其标记技术的研究进展进行了阐述。     

钙荧光探针Fura2/AM对大肠杆菌细胞的负载行为

Fura2/AM作为一类高效的钙离子荧光探针,在动物细胞中已得到较成功的应用,但在微生物细胞分析方面鲜见报道。该文系统研究了该探针的荧光光谱特征及其在大肠杆菌细胞内的负载行为,并考察了在大肠杆菌细胞中钙离子与Fura2的结合情况。为利用其研究大肠杆菌等微生物细胞内钙离子浓度及钙离子跨膜行为奠定了基础。     

测定细胞内自由钙的显微荧光光度计的研制和应用

以ＸＳＪ－２型荧光显微镜为基础,建立了测定细胞内自由钙的显微荧光光度计,为建立这套装置,对荧光显微镜主要作了如下改动：首先,为提供稳定的激光光源,交流汞灯被换成直流氙灯;其次光路中安装了镶有两块干涉滤色片的激发滤色片转盘,使生物样品交地被两种不同波长的光激发。整套装置的运转在微机控制下,在这套装置上,成功地用Ｆｕｒａ－２测定了细胞内自由钙变化,文中提供了应用实例。