毕赤酵母表达外源基因研究进展

毕赤酵母表达系统作为一种新型酵母表达系统,它既有原核生物的特点,又有真核生物的特性,可以对目的蛋白质进行糖基化、二硫键形成等翻译后修饰。在过去的20年中已经有200多种不同蛋白在毕赤酵母中实现了成功表达,其中许多已被广泛应用于临床诊断治疗或科研工作中。随着一系列新型酵母表达载体及菌株的构建及发酵技术的不断提高,毕赤酵母越来越吸引着科学家的关注,毕赤酵母己被发展成为一种细胞生物学研究及基因工程生产的模式真核生物。本文总结了毕赤酵母的载体与菌株构建及发酵技术和糖基化等方面近年的主要研究进展。     

毕赤酵母表达系统

选择合适的表达系统是蛋白质体外成功表达的关键。毕赤酵母表达系统是一种新的、极具潜力的真核表达系统,其在蛋白质表达方面具有其它系统不可比拟的优点,正在得到越来越广泛的应用。较详细地综迷了毕赤酵母表达系统的特点、组成及影响其表达的因素等。     

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一。该表达系统不存在原核表达系统的内毒素难以除去的问题 ,也不存在哺乳动物细胞表达系统的病毒和支原体污染等问题 ;并能够对目的蛋白进行类似高等真核生物的信号肽剪切、二硫键形成、糖基化等过程的翻译后蛋白加工。至今已有多种外源蛋白在该表达系统中成功表达。下面对毕赤酵母表达系统的特点及研究进展作一简要综述。     

信号肽序列对毕赤酵母表达外源蛋白质的影响

乙醇氧化酶启动子被分离、克隆 ,并建立了转化方法后 ,毕赤酵母已被发展成为一种高效的外源蛋白表达宿主。为了进一步提高外源蛋白质的分泌表达 ,对信号肽序列进行了研究。首先按毕赤酵母的偏爱密码合成了酿酒酵母的α因子信号肽序列MF4I,随后在MF4I信号肽序列的N端分别引入 1～ 10个毕赤酵母Aox1蛋白质的N端氨基酸 ,构成 10种不同的分泌信号肽序列 ,10种不同的分泌信号肽序列被用于植酸酶基因的毕赤酵母分泌表达。以上新的信号肽序列都可使植酸酶的分泌表达量增加 ,而以N端增加A、I、P三个氨基酸的信号肽序列引起的提高最大 ;和野生型的酿酒酵母α因子信号肽序列相比 ,使植酸酶分泌表达量增加 5倍 ,摇瓶中植酸酶的分泌表达量为 90mg/L。此外在MF4I信号肽的引导序列和内切蛋白酶间增加了EEAEAEAEP和K共 10个氨基酸 ,进一步提高信号肽的分泌效率 ,使表达又提高约 35 % ,使得摇瓶中酸性植酸酶的表达量达到 12 0mg/L ,是pPCI9K表达量的 8倍。     

巴斯德毕赤酵母表达系统在外源基因表达中的研究进展

巴斯德毕赤酵母是目前应用最广泛的外源蛋白表达系统。分别从的菌株、载体、外源基因整合、表达产物糖基化和外源基因高效表达等方面综述了毕赤酵母表达系统的研究进展。     

鸡α干扰素在毕赤酵母中的表达及糖基化对其表达的影响

目的:实现鸡α干扰素(ChIFNα)在毕赤酵母GS115中的表达,并考察糖基化对其表达的影响。方法:人工合成按照毕赤酵母偏好密码子优化的ChIFNα基因,克隆至分泌表达载体pPIC9,电转到毕赤酵母GS115中进行表达。利用定点突变对ChIFNα基因序列中4个糖基化位点进行缺失,SDS-PAGE分析N-糖基化对毕赤酵母表达ChIFNα的影响。结果:ChIFNα在GS115中获得了表达,在摇瓶发酵条件下,表达量为35.2 mg/L;构建了缺失1~4个糖基化位点的4个突变体,在GS115中实现了表达,分析表达结果显示,与未突变的ChIFNα对照相比,突变体的糖基化程度和表达量都有大幅度下降。结论:N-糖基化对于毕赤酵母表达ChIFNα具有重要影响,无糖基化的ChIFNα在毕赤酵母中表达量极低。     

发酵条件对毕赤酵母表达重组人干扰素ω糖基化的影响

发酵条件是影响毕赤酵母 (P .pastoris)表达外源重组糖蛋白时糖基化的重要因素。通过菌体浓度、起始pH值、甲醇诱导浓度和周期、装液量等摇瓶发酵实验 ,研究不同发酵条件对毕赤酵母表达分泌型重组人干扰素ω(rhIFNω)过程中糖基化的影响 ;同时 ,在连续培养过程中考察pH值变化对rhIFNω糖基化的影响和分批发酵过程中rhIFNω糖基化的变化。结果表明 ,控制菌体密度 250g L(WCW)、起始pH值 6 0、装液量小于 30mL、甲醇诱导浓度 15g L、甲醇诱导 3次 (每 24h诱导一次 )等发酵条件 ,有利于摇瓶发酵过程中rhIFNω的糖基化 ;控制pH值 70～75可促进rhIFNω的糖基化 ;分批发酵过程中 ,糖基化与非糖基化rhIFNω的含量有同比变化趋势 ,但糖基化rhIFNω所占比例明显低于摇瓶发酵实验的结果 ,其原因有待进一步研究。     

巴斯德毕赤酵母表达系统优化策略

巴斯德毕赤酵母 (Ｐｉｃｈｉａｐａｓｔｏｒｉｓ,Ｐｐ)表达系统是目前分子生物学领域中用于表达重组蛋白的标准工具之一。Ｐｐ的如下优点是促成此表达系统在近十几年里迅速发展和被广泛应用的重要原因 :Ｐｐ为单细胞真核生物 ,生长快 ,易于分子遗传学操作 ;Ｐｐ的醇氧化酶 1 (ＡｌｃｏｈｏｌＯｘｉｄａｓｅ 1 ,ＡＯＸ 1 )基因的启动子具有强诱导性和强启动性 ,适于外源基因的高水平诱导表达 ;Ｐｐ具有强烈的好氧生长偏爱性 ,可进行细胞高密度培养 ,利于大规模工业化生产 ;Ｐｐ可高水平分泌表达外源蛋白 ,纯化方便 ;Ｐｐ具有真核细胞的翻译后…     

巴斯德毕赤酵母表达系统及其高水平表达策略

毕赤酵母表达系统是目前最为成功的外源蛋白表达系统之一,与现有的其它表达系统相比,巴斯德毕赤酵母在表达产物的加工、外分泌、翻译后修饰以及糖基化修饰等方面有明显的优势,现已广泛用于外源蛋白的表达。该文综述了其自身的优点,表达载体和宿主菌的特点,以及高水平表达外源基因的策略。     

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母(Pichiapastoris)表达体系是近年发展起来的最为成功的真核表达体系。对巴斯德毕赤酵母表达系统及影响外源基因在巴斯德毕赤酵母中表达的因素进行了简要综述。     

一条新的柱层析纯化路径对HBsAg免疫原性的影响

摘要目的：建立一条新的毕赤酵母表达乙肝表面抗原（HepatitisBantigen,HBsAg）柱层析纯化方法,保持HBsAg结构完整性和提高免疫原性。方法：毕赤酵母发酵料液经过菌体破碎、聚乙二醇沉淀、疏水层析、超滤和凝胶分子筛精纯,收集HBsAg合格样品液适当稀释后加入铝佐荆吸附,制成乙肝疫苗半成品免疫BALB／c小鼠。结果：纯化产物经SDS-PAGE银染鉴定得单一条带,分子量在23kD左右,凝胶成像软件分析纯度超过95％;该纯化方法得到的HBsAg颗粒电镜观察得平均直径为22nm病毒样颗粒,结构较均一完整;自制疫苗免疫小鼠后,其血清抗体水平高于葛兰素史克生产的Engerix—B（安在时）,存在显著性差异（P〈0．05）。结论：通过该方法纯化的HBsAg结构完整性良好,疫苗免疫效果优于酵母表达的Engerix—B,纯化路径简单高效,易于放大用于工业化生产。     

重组人小分子抗体ScFv-Fc发酵条件的优化及纯化

目的：研究重组人小分子抗体ScFv—Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及ScFv—Fc的纯化方法。方法：分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生ScFv-Fc的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀结合proteinA亲和层析柱,对ScFv—Fc的纯化方法进行了研究。结果：确定ScFv—Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为：在pH5．2的条件下,以0．5％甲醇诱导72h。经过proteinA亲和层析柱纯化后,ScFv—Fc纯度可达94％以上。结论：确定了ScFv-Fe在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件以及纯化方法,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。     

重组人小分子抗体ScFv-Fc发酵条件的优化及纯化

目的:研究重组人小分子抗体ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件,以及ScFv-Fc的纯化方法。方法:分别从甲醇浓度、pH、诱导时间等方面对毕赤酵母重组菌株产生ScFv-Fc的发酵过程进行了优化;通过硫酸铵沉淀结合protein A亲和层析柱,对ScFv-Fc的纯化方法进行了研究。结果:确定ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件为:在pH5.2的条件下,以0.5%甲醇诱导72 h。经过protein A亲和层析柱纯化后,ScFv-Fc纯度可达94%以上。结论:确定了ScFv-Fc在毕赤酵母中分泌表达的最佳条件以及纯化方法,为重组抗体分子诊断、治疗试剂的开发以及抗体的人源化奠定了物质基础。     

重组线虫抗凝肽在毕赤酵母中的表达

目的：获得具有抗凝活性的重组线虫抗凝肽（NAP）蛋白, 为新型抗凝药物的开发奠定基础。方法：将pPIC3.5K-rNAP质粒转化毕赤酵母菌株GS115,筛选出阳性菌株后,用甲醇诱导表达。收集酵母培养上清,用SDS-PAGE和Western blot分析表达产物,通过测定PT(血浆凝血酶原时间)、INR（血浆凝血酶原国际标准化比率）和APTT（活化部分凝血活酶时间）来验证其生物学活性。结果：获得了稳定表达NAP的重组酵母菌株。重组NAP被分泌表达,其分子量比预计分子量（8.7KD）稍大,约为10KD左右,可能与糖基化有关。体外活性检测证实其有较强的抗凝活性。结论：在毕赤酵母中成功表达了具有生物学活性的重组线虫抗凝肽,可用于新型抗凝药物的开发。     

毕赤酵母外源基因表达系统研究进展

巴斯德毕赤酵母Pichia pastoris外源基因表达系统已经成功表达了很多胞间型和胞内型蛋白质。与酿酒酵母Saccharomyces ceresiviae相比,该系统所具有的很多优势使其应用越来越广泛。有关研究主要涉及以下几个方面：宿主菌株,表达载体,转化方法,外源基因整合,外源蛋白糖基化和高密度发酵培养等。     

mNUDC基因在巴斯德毕赤酵母中表达载体的构建及表达

目的:探索小鼠核迁移蛋白C(mNUDC)在毕赤酵母分泌表达的方法.方法:应用PCR扩增本实验室所构建的重组质粒PET28b-his-mNUDC中的mNUDC基因,使用基因重组方法构建毕赤酵母真核表达栽体pPICZaA-his-mNUDC,电击转化酵母茵株KM71后,经摇瓶发酵和甲醇诱导,SDS-PAGE和Westernblot分析鉴定上清中重组mNUDC蛋白表达量.结果:经过PCR方法,有效扩增了mNUDC基因,构建了pPICZα A-his-mNUDC酵母表达质粒,序列分析表明所构建的含mNUDC基因的质粒与设计相同,mNUDC蛋白得到正确表达.使用SDS-PAGE和Western blot方法可以检测到mNUDC的稳定、高效地分泌表达.结论:成功地构建了mNUDC基因的毕赤酵母表达载体pPICZα A-his-mNUDC,并在毕赤酵母中实现分泌型离表达,为进一步研究mNUDC蛋白对小鼠的生物活性奠定了实验基础.     

人血清白蛋白-C肽融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达

目的构建重组表达人血清白蛋白(HSA)-C肽(CP)融合蛋白的毕赤酵母表达菌株.方法根据表达系统的密码子偏好性优化CP基因,酶切连接pBlue-HSA质粒(HSA1 800bp)和CP(100bp)基因,将HSA-CP融合基因双酶切后插入分泌表达栽体pPIC9K中,重组质粒pPIC9K-HSA-CP经SalⅠ线性化后,电击转化毕赤酵母GS115,表型筛选Mut 转化子.PCR鉴定后,用甲醇诱导摇瓶分泌表达.结果融合基因约为1 900bp,序列测定正确.SDS-PAGE分析表明表达融合蛋白的相对分子量约为70kD,摇瓶培养表达量为140mg/L,Western blot鉴定显示表达的融合蛋白为HSA和CP的杂合分子.结论实现了HSA-CP融合蛋白在毕赤酵母中的分泌表达,细胞活性研究显示HSA-CP融合蛋白对人胚肾293细胞的生长具有一定的促进作用.     

Glycosylation of Proteins in Developing Human Brain

Abstract: The carbohydrate content of human brain glycoproteins was studied during development from the age of 12 fetal weeks to 8 postnatal months. The concentration of all the glycoprotein monosaccharides increased with age. The total amount of glycoprotein monosaccharides per lipid-free dry tissue increased by about 150% from the end of the third fetal month to the time of delivery. The increase leveled off around term, and only minor increase occurred after birth. The adult level was reached by the fifth postnatal month.     

糖链及其蛋白质糖基化

基因和蛋白质是生物统一性的重要标志,而糖链则是生物多样性最重要的标志分子。糖基化作为蛋白质翻译后重要的修饰方式,有其重要的生物学意义。本文综述了糖链的结构、功能及其蛋白质糖基化的类型、影响因素、表达系统等相关问题。