分光光度法测定DNA或RNA含量

若样品纯度较高(即蛋白质、酚、琼脂糖或其他核酸的污染量不大),用紫外分光光度法即简便又准确。测定时,于260 nm与280nm两个波长下读数。通过260nm的读数可计算出样品中核酸的浓度,即10.D.260相当于50 μg/ml双链DNA,40μg/ml单链RNA或     

南瓜和丝瓜韧皮部伤流液中核酸的存在和鉴定

利用化学分析结合电镜技术,对南瓜和丝瓜韧皮部伤流液中的DNA和RNA,进行了定性和定量的研究。核酸样品经日立双波长和双光束分光光度计测定,在258 nm左右有一吸收高峰,低峰在230 nm附近,呈现出核酸的紫外吸收光谱曲线。南瓜伤流液中的DNA含量为60～238μg/ml,RNA为30～80μg/ml,而丝瓜则分别为30～120μg/ml和20～40μg/ml.DNA水解物经高压液相色谱(HPLC)测定、可将T.G.C.A四个碱基明显分开。DNA电镜观察,得到清晰的图象。电镜细胞化学鉴定,也表明伤流液中有核酸存在。上述结果证实瓜类韧皮部伤流液中含有DNA和RNA,它们可能参与了韧皮部的运输,并可随伤流液的流动而迁移。     

硫酸庆大霉素中RNA和DNA的检查

目的为检查硫酸庆大霉素中的RNA与DNA,方法先用凝胶柱色谱法分离出RNA与DNA,再采用改良苔黑酚法检查RNA,采用二苯胺法检查DNA。结果 RNA在1~20μg范围内,吸光度与浓度线性回归的相关系数r=0.9993,检测限和定量限分别为0.28μg和0.85μg,平均回收率为96.1%;DNA在5~200μg范围内,吸光度与浓度线性回归的相关系数r=0.9995,检测限和定量限分别为2.8μg和6.3μg,平均回收率为93.3%。结论所建立的方法专属、灵敏、准确,可用于硫酸庆大霉素中RNA和DNA的检查。     

巨噬细胞RNA合成的某些特点

在低浓度(≤1μg/ml)放线菌素D作用下,兔腹腔巨噬细胞RNA合成被抑制的情况与兔肾细胞类似。但随着放线菌素D浓度增高,反而促进巨噬细胞的RNA合成。在浓度为100μg/ml时,可使~3H-尿苷的掺入量比对照增加2—10倍。相反,在此浓度下,兔肾细胞的RNA合成却完全被抑制。蔗糖的存在能使巨噬细胞丧失对放线菌素D这种刺激作用反应的能力,其RNA合成完全被抑制。另一方面,巨噬细胞的KNA聚合酶对利福平的敏感性要比其他非免疫细胞至少高4—5倍。如果用高浓度的(500μg/ml)利福平完全抑制巨噬细胞的转录之后,再     

内毒素引起的乳鼠心肌细胞血红素加氧酶—1基因的表达

为了探讨在内毒素作用下的乳鼠心肌细胞（neonatal rat cardiomyocytes,NRCMs）血红素加氧酶－1（heme oxygenase-1,HO-1）基因的表达及其在细胞损伤中的作用,分别用10、30及50μg/ml的脂多糖（lipopolysaccharide,LPS）,10μg/ml LPS 10μmol/ml锌原卟啉Ⅸ（Zn-protoporphyrin-Ⅸ,ZnPPⅨ）和单纯10μmol/ml ZnPPⅨ与培养的NRCMs共同孵育6h,以及10μg/ml LPS与NRCMs共同孵育9h和18h。分别观察细胞HO－1 mRNA表达、MDA含量、LDH释放量与台盼蓝摄取率的变化。结果显示,同样与细胞孵育6h,LPS10μg/ml时HO－1 mRNA表达比对照组增加81.2％,30μg/ml时表达量增加126.3％,50μg/ml时表达量增加92.8％;LPS为10μg/ml时,孵育9h后HO－1 mRNA的表达量比对照组增加93.6％,孵育18h后一增加105.8％。LPS30、50μg/ml,10μg/ml LPS＋10μmol/ml ZnPPⅨ与细胞孵育6h及LPS 10μg/ml孵育18h后,细胞MDA含量、LDH释放量与台盼蓝摄取率明显增加（P＜0.01）;单纯10μg/ml LPS与单纯10μmol/ml ZnPPⅨ孵育6h后,上述指标均无明显升高。结果表明,LPS可诱导NRCMs HO－1 mRNA的表达,且在较低LPS剂量范围内具有时间依赖性和浓度依赖性;NRCMs HO-1 mRNA的表达可减低LPS引起的细胞损伤,这可能是细胞产生的一种自身保护性反应。     

补骨脂素对前列腺癌LNCap-AD细胞增殖的影响及其分子机制研究

目的观察补骨脂素对体外培养的前列腺癌LNCa P-AD细胞增殖的抑制作用,并探讨补骨脂素抑制前列腺癌的作用机制。方法体外培养前列腺癌LNCa P-AD细胞,加入不同浓度的补骨脂素,CCK-8法检测细胞增殖抑制率、实时荧光定量PCR检测细胞AR m RNA的表达、Western Blot检测细胞PCNA和AR蛋白表达。采用单因素方差分析进行组间均数比较。结果与对照组相比,30、50、100μg/ml补骨脂素组LNCa P-AD细胞存活率均明显下降(P0.05),补骨脂素对LNCa P-AD细胞增殖的抑制作用呈浓度-时间依赖性。实时荧光定量PCR检测结果显示,与对照组(1.00±0.00)相比,30μg/ml组AR m RNA表达上调(1.63±0.04,t=17.72,P0.01),50μg/ml组AR m RNA表达无明显变化(0.98±0.04,t=0.66,P=0.53)、而100μg/ml组的AR m RNA表达则明显降低(0.46±0.07,t=15.18,P0.01)。Western blot法检测结果显示,30μg/ml、50μg/ml、100μg/ml的补骨脂素干预48 h后,LNCa P-AD细胞PCNA蛋白表达均显著降低(11.88±0.21 vs 10.61±0.17 vs 6.62±0.13 vs 2.71±0.43,F=68.53,P0.01)。100μg/ml的补骨脂素可明显降低LNCa P-AD细胞AR蛋白的表达水平(0.43±0.06 vs 0.87±0.04,t=6.04,P0.01)。结论补骨脂素能在体外抑制前列腺癌LNCa P-AD细胞增殖,且呈剂量-时间依赖性,其机制可能与其下调LNCa P-AD细胞PCNA表达和影响AR表达有关。     

采用单碱基突变模板作为内对照对组织中mRNA水平进行PCR定量

用PCR方法对原始模板进行单碱基突变,在原始模板DNA的特定位点引入一个EcoRI酶切位点。单碱基突变的DNA经PCR扩增后定量、稀释,作为内标加入到样品中与待测DNA同时进行PCR扩增．扩增产物经酶切后电泳,根据电泳结果中不同分子量DNA片段的含量,对样品中待测基因拷贝数进行定量分析。实验结果观察到：每1μg肝脏组织总RNA经逆转录后AVPV1受体cDNA拷贝数约1．25×10－20mol。     

动物脑组织中的核酸含量——用双波长分光光度法测定

为了观察一些中枢神经系统药物对脑内核酸含量的影响,首先采用Tsanov等的双波长分光法测定了正常小鼠、大鼠和家兎全脑的核酸含量,并和单波长分光法及戊糖反应的比色法比较。用分光法测定RNA和DNA含量时所用波长分别为260及268mμ,在用双波长法测定RNA含量时选用的第二波长为284.25(小鼠,大鼠)和285mμ(家兎),测定DNA含量时的第二波长为281.5(小鼠,大鼠)和282.5mμ(家兎)。计算中需要的几个常数是:RNA的ε(p)_(260)=6915,DNA的ε(p)_(268)=9006;RNA的γ值为2.09(小鼠,大鼠)和2.24(家兎),DNA的γ值为1.46(小鼠,大鼠)和1.58(家兎);K_(RNA)为860(小鼠, 大鼠)和809(家兎),K_(DNA)为1090(小鼠,大鼠)和936(家兎)。用双波长法测定的4批实验37只小鼠脑内RNA含量为99.5—108.0毫克P/100克干燥组织,DNA含量为89.9—95.7毫克P%,RNA/DNA此值为1.06—1.15。6只家兎2批实验的结果,RNA含量为58.4—70.4毫克P%,DNA合量为38.3—44.1毫克P%,RNA/DNA此值为1.53—1.60。3只大鼠的平均结果,RNA含量为90.1毫克P%,DNA含量为64.2毫克P%,RNA/DNA比值为1.40。将我们所用三种方法测得的结果相互比较,并和其他作者用不同方法测定的结果相比较,表明用Schmidt-Thannhauser法和Schneider法测定脑内核酸含量时杂质的影响很大。在分光测定时杂质的影响主要存在于RNA的部分,双波长分光法可以消除杂质的影响。     

多粘芽孢杆菌质粒的研究——Ⅱ.多粘芽孢杆菌原生质体形成、再生与转化

多粘芽孢杆菌P250-2完整菌体不能作为质粒DNA的转化受体,但其质粒消除菌株P_0250-5制成的原生质体,可接受多粘芽孢杆菌的pBD2502及枯草杆菌的pUB110质粒DNA转化。在高渗蔗糖再生培养基上,原生质体再生率为20％左右,形成率在95％以上。在含新霉素(10μg/ml)、青霉素(25μg/ml)、四环素(12.5μg/ml)的高渗蔗糖再生培养基上分别获得了转化子。多粘芽孢杆菌的转化频率为3.29×10~(-3),枯草杆菌为4.4×10~(-4)。转化子的形态表现、生化特性和抗菌谱与给体菌株一致,表明多粘芽孢杆菌株间及多粘芽孢杆菌和枯草杆菌种间的质粒可以进行转化。     

狗尾草总DNA的提取与纯化研究

狗尾草杂草中富含多糖和酚类物质,而用已报道的提取方法均难得到高纯度DNA。为此,对提取植物DNA的SDS法进行了改进。用4．5ml细胞提取液,1．0ml饱和NaAc溶液,0．10倍样液体积的无水乙醇,氯仿／异戊醇溶液与样液体积比为0．80,与样液等体积的酚／氯仿／异戊醇溶液(28：21：1)和异丙醇,在65℃水浴加热60min,可从1．0g狗尾草中提取780μg纯DNA。     

4-异硫氰酸盐-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基抑制白血病细胞DNA,RNA,蛋白质,核蛋白和ATP代谢的动力学研究

4—异硫氰酸盐—Tempo 3μg/ml对白血病7712细胞DNA,RNA和蛋白质合成抑制的动力学研究表明,首先抑制DNA的合成,然后逐步抑制RNA与蛋白质的合成。对18种氨基酸代谢均有抑制作用,大部分抑制率在30％左右,唯对蛋氨酸的抑制率高达45.8％,似有一定选择性。对核蛋白与ATP代谢的抑制动力学过程,有较好的相关性,表明其对癌细胞生长及DNA合成的抑制作用与对细胞ATP合成的抑制有关。     

4-异硫氰酸盐-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基抑制白血病细胞DNA,RNA,蛋白质,核蛋白和ATP代谢的动力学研究

4—异硫氰酸盐—Tempo 3μg/ml对白血病7712细胞DNA,RNA和蛋白质合成抑制的动力学研究表明,首先抑制DNA的合成,然后逐步抑制RNA与蛋白质的合成。对18种氨基酸代谢均有抑制作用,大部分抑制率在30％左右,唯对蛋氨酸的抑制率高达45.8％,似有一定选择性。对核蛋白与ATP代谢的抑制动力学过程,有较好的相关性,表明其对癌细胞生长及DNA合成的抑制作用与对细胞ATP合成的抑制有关。     

胡萝卜苷抑制HepG-2细胞增殖和迁移及拓扑异构酶表达

目的探讨胡萝卜苷对HepG2细胞增殖、迁移及DNA拓扑异构酶(topoisomerase,TOPO)Ⅰ和Ⅱ表达的影响。方法体外培养人肝癌HepG2细胞。CCK-8实验观察不同浓度(200μg/ml、150μg/ml、100μg/ml和50μg/ml)胡萝卜苷对HepG2细胞增殖的影响。qRT-PCR实验观察200μg/ml胡萝卜苷对HepG2细胞TOPOⅠ和TOPOⅡmRNA表达的影响。Transwell小室模型检测200μg/ml胡萝卜苷对HepG2细胞迁移的影响。结果胡萝卜苷对HepG2细胞增殖有明显抑制作用,并在一定范围内(0μg/ml~200μg/ml)呈现浓度依赖性。与未用胡萝卜苷处理的HepG2比较,经200μg/ml胡萝卜苷作用的HepG2细胞穿越基膜的数量显著减少,TOPOⅠ和TOPOⅡmRNA相对表达量显著降低。结论胡萝卜苷可能通过下调TOPOⅠ、TOPOⅡ基因表达而抑制HepG2细胞增殖,并具有抑制HepG2细胞迁移的能力。     

改良内皮抑素对人脐静脉内皮细胞抑制作用的实验研究

目的:探讨改良内皮抑素(RGDRGD-ES)对人脐静脉内皮细胞(HUVEC)的抑制作用,摸索RGDRGD-ES对HUVEC细胞抑制作用的相对最佳作用浓度和时间。方法:通过快速定点诱变PCR方法获得含有RGDRGD膜序的改良人内皮抑素基因,并构建其原核表达载体。表达、纯化改良内皮抑素(RGDRGD-ES),运用MTT法和流式细胞仪检测RGDRGD-ES对人脐静脉内皮细胞的抑制作用。结果:1.诱变了ES基因,获得了改良的RGDRGD-ES基因,并成功构建其原核表达载体。2.获得了RGDRGD-ES蛋白。3.改良的RGDRGD-ES能够有效抑制人脐静脉内皮细胞的生长(P<0.01);抑制率随着药物浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)的增加和作用时间(24 h、48 h、72 h)的延长而逐渐增加,具有浓度和时间依赖性(P<0.01);而30μg/ml与40μg/ml、50μg/ml组间、72 h与96 h组间无明显差异(P>0.05)。4.细胞凋亡率(作用24 h)具有药物浓度(10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml)依赖性(P<0.01),30μg/ml与40μg/ml、50μg/ml组间凋亡率无明显差异(P>0.05)。结论:成功构建了改良RGDRGD-ES基因的原核表达载体,RGDRGD-ES蛋白在30μg/ml浓度作用72小时条件下能够有效抑制人脐静脉内皮细胞的生长,改良内皮抑素(RGDRGD-ES)对HUVEC的抑制作用较ES明显提高。     

鳗鲡赤鳍病病原菌的分离鉴定和耐药性的研究

从汕头地区5个养鳗场的患赤鳍病的病鳗中均分离到病原菌是嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila(chester)stanler),将有毒力的87株病原菌对养鰻场常用抗菌剂进行耐药性试验,结果表明,4种抗菌剂的MIC、MIC_(50)和耐药率分别是:土霉素109.3μg/ml、50.0μg/ml和78.8％;氯霉素123.3μg/ml、63.0μg/ml和90.7％;复方磺胺甲基(口恶)唑(TMP/SMZ)720/3600μg/ml、126/630μg/ml和42.5％;痢特灵79.7μg/ml、63.0μg/ml和65.5％。4种被测抗菌剂的平均MIG分别是对照敏感菌株的109.3,102.7,72和26.6倍。上述试验结果显示了由于滥用药物的严重后果     

负载金属离子的5A沸石的体外抗菌实验

目的：探讨负载金属离子的5A沸石的体外抗菌作用。方法：选用金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、白色念珠菌,利用倍比稀释法对5A沸石组、磺胺嘧啶银组及载不同浓度Ag＋、Zn2＋5A沸石共15组进行了体外抗菌试验研究,确定最佳抗菌效果离子负载方案。结果：三种细菌的MIC,双金属离子负载在抗菌上具有协同载Ag＋5A沸石分别达到了125μg/ml~500μg/ml、31.25μg/ml~500μg/ml、250μg/ml~500μg/ml;附载Zn2＋5A沸石分别达到了12.5mg/ml~25mg/ml、6.25mg/ml~50mg/ml、25mg/ml;负载双离子5A沸石分别为250μg/ml~500μg/ml、62.5μg/ml~500μg/ml、500μg/ml。结论：5A沸石负载金属离子后均具有抗菌作用,且抗菌作用与附载金属离子的量正相关;负载相同质量Ag＋的5A沸石较附载Zn2＋者具有更强的抗菌作用;双金属离子负载在抗菌上具有协同作用;2%Ag＋＋8%Zn2＋与2%Ag＋＋10%Zn2＋及4%载银组与阳性对照组无显著性差异。     

在烟草中酵母脯氨酸基因B的转化(英文)

重组质粒PYP22带有一从酵母基因文库分离到的4.6 kb DNA片段,此片段含有脯氨酸(Pro)合成途径必须的基因B(ProB)。用BamHⅠ酶解PYP22,回收ProB基因,重组入pGA471的Bg Ⅲ切口,形成含有ProB的双质粒载体PBYU4。pBYU4含有能在植物中表达的新霉素磷酸转移酶基因Ⅱ(NPT—Ⅱ),可做转基因植株的筛选标记。借助于辅助质粒pRK2013,pBYU4经过三亲结合转移到农杆菌LAB4404,在含有四环素12.5μg/ml、链霉素100μg/ml和利福平50μ/ml加的AB培养基上筛选出转接合子。提取筛选得到的农杆菌总DNA,用ECoR 1酶解,1％琼脂糖电泳,Southern转移DNA到硝酸纤维素膜上。用α—~(32)P-dCTP标记的ProB片段,与转移好的硝酸纤维素进行Southern杂交。Southern杂交证明含有ProB基因的农杆菌,在加有乙酸丁香酮(acetosyringone)125μg/ml和章鱼碱(octopine)125μg/ml的MS液体培养基中,诱导过夜。用叶圆片法转化革新1号烟草(Nicotana tabacum var.Gexin No.1),叶片与菌液共培养2～5d。从叶片分化再生出的芽转移到含有卡那霉素(K_m)80μg/ml、6—苄基腺嘌呤(6BA)1μg/ml和头孢氨噻腭钠(Cef)500μg/ml的MS培养基,筛选3周,将绿色的芽转移到含l％NaCl,6BA 1μg/ml和Cef 500μg/ml的MS培养基,进行复筛。测定经过这样筛选的再生芽的NPT—Ⅱ活性。     

负载金属离子的5A 沸石的体外抗菌实验

目的:探讨负载金属离子的5A沸石的体外抗菌作用。方法:选用金黄色葡萄球菌、铜绿假单孢菌、白色念珠菌,利用倍比稀释法对5A沸石组、磺胺嘧啶银组及载不同浓度Ag+、Zn2+5A沸石共15组进行了体外抗菌试验研究,确定最佳抗菌效果离子负载方案。结果:三种细菌的MIC,双金属离子负载在抗菌上具有协同载Ag+5A沸石分别达到了125μg/ml~500μg/ml、31.25μg/ml~500μg/ml、250μg/ml~500μg/ml;附载Zn2+5A沸石分别达到了12.5mg/ml~25mg/ml、6.25mg/ml~50mg/ml、25mg/ml;负载双离子5A沸石分别为250μg/ml~500μg/ml、62.5μg/ml~500μg/ml、500μg/ml。结论:5A沸石负载金属离子后均具有抗菌作用,且抗菌作用与附载金属离子的量正相关;负载相同质量Ag+的5A沸石较附载Zn2+者具有更强的抗菌作用;双金属离子负载在抗菌上具有协同作用;2%Ag++8%Zn2+与2%Ag++10%Zn2+及4%载银组与阳性对照组无显著性差异。     

依赖于DNA的RNA聚合酶与体外转录的研究 Ⅰ.酵母变异株20B-12 RNA聚合酶A和C的纯化及鉴定

从酵母变异株20B-12经过超声波处理、硫酸铵沉淀、DEAE纤维素和磷酸纤维素层析等步骤,纯化依赖于DNA的RNA聚合酶A和C,得到聚丙烯酰胺凝胶电泳均一的条带。其中不含DNase、RNase 和蛋白酶活力,无内源DNA。测定了 RNA 聚合酶A和C对α-鹅膏荤碱的敏感性。酶A在α-鹅膏荤碱为400μg/ml时,活性受到抑制,而酶C在该浓度时,几乎不受抑制。(NH_4)_2SO_4对酶A的最适浓度为20mM,对酶C有二个最适浓度,分别为40mM和240mM。无二价金属离子Mn~(2+)或Mg~(2+),酶A和C几乎无活力。两种酶最适Mn~(2+)浓度均为2.5mM,Mg~(2+)浓度均为5mM。两种酶以热变性小牛胸腺DNA为模板,测活性均较天然小牛胸腺DNA为模板时高。     

迟钝爱德华氏菌RNA提取及痕量基因组DNA去除方法探究

迟钝爱德华氏菌EIB202是一类细胞壁结构特殊的革兰氏阴性菌,高质量RNA提取相对较难。为了从转录组水平研究这类致病菌的致病机理,需要摸索有效的RNA提取及RNA样品中痕量基因组DNA去除方法。对常规RNA提取步骤进行改进,增加PBS清洗、反复冻融及较高浓度溶菌酶处理等步骤;另外,利用小体系基因组DNA去除系统,Mg2+与Mn2+协同激活DNase I去除RNA样品中基因组DNA污染。利用优化方法提取的RNA在质量及浓度(1 740 ng/μL)方面均有了显著改善,并建立了一套完全去除RNA样品中痕量基因组DNA污染的程序。