体细胞重编程为诱导多能干细胞

诱导多功能性干细胞（induced pluripotent stem cells,iPS细胞）是通过导入特定的转录因子（如Oct3/4、Sox2、c-Myc和Klf4等）将体细胞诱导重编程为多能性干细胞,其功能与胚胎干细胞相似.iPS细胞的建立,在生命科学领域引起了新的轰动.目前,iPS细胞的研究领域在转录因子的优化、iPS细胞的筛选、载体的运用、体细胞种类的选择和iPS细胞的应用等方面取得突破进展,但仍然存在致癌性、效率低等一系列急需解决的问题.     

体细胞诱导为多能干细胞的最新进展

2007年11-12月,Cell、Science和Nature发表一系列体外诱导人类体细胞转变为多能干细胞的论文。来自日本和美国的研究小组利用慢病毒载体分别将Oct-4、Sox2、C-Myc、Klf4和Oct-4、Sox2、Nanog、Lin28两套基因转入人成纤维细胞,均获得类似ES细胞的克隆。小鼠诱导性多能干细胞已初步用于镰刀细胞性贫血的基因治疗。短短一年半,诱导性多能干细胞的研究和关注度呈现了爆炸式成长;体细胞重编程、去分化、多能干细胞来源等一系列热点问题再次成为大众瞩目的中心。     

多能的SoxB1家族基因

SoxB1基因家族编码一类含有HMG DNA结合结构域的转录因子。目前,已经鉴定出的SoxB1家族成员包括脊椎动物中共有的Sox1a/b、Sox2、Sox3以及硬骨鱼类中特有的Sox19a/19b,它们在性别决定、神经元特化、＂干＂性细胞自我更新及全能性维持、胚层发育等过程中发挥重要作用。向小鼠成纤维细胞中导入四个关键因子Sox2、Oct4、c-Myc及Klf4,可以成功地将体细胞诱导成具有分化全能性的干细胞,证明了SoxB1因子在发育过程中不可或缺的重要性,也极大地推动了关于SoxB1家族基因的研究。该文将围绕SoxB1基因的最新研究进展作一综述。     

中缅树鼩三个多潜能基因cDNA片段的克隆和序列分析

该实验从中缅树鼩(Tupaia belangeri)组织中成功克隆Klf4、Sox2和c-Myc基因的部分序列,长度分别为382、612和485bp,分别编码127、204和161个氨基酸。树鼩的Klf4、Sox2和c-Myc序列与人相应序列的相似性分别为89%、98%和89%。将树鼩Klf4、Sox2和c-Myc基因分别与其他物种的这3个基因进行系统进化分析,发现Klf4和Sox2基因所构建的系统进化树结构较为一致,但与c-Myc所构建的系统进化树有所不同,表明这些基因在进化上存在差异。Klf4、Sox2和c-Myc基因的克隆为进一步研究其功能奠定了基础。     

利用piggyBac转座子制备牛成体多能干细胞诱导技术研究

通过逆转录病毒等媒介表达核转录因子Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc可将体细胞重编程为诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSc)。时至今日,已经报道了小鼠、人、大鼠、猪、羊、马、牛的iPS细胞,但大动物iPS的多能性特别是嵌合体形成和生殖细胞传代还没有得到确认。与逆转录病毒等不同的是,piggyBac转座子转染效率高且无病毒源性、操作简单,可以在转座酶的存在下被安全切除。首次尝试了采用piggyBac转座子携带鼠源Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc、Rarg和Lrh16个核转录因子诱导胎牛成纤维细胞,成功获得牛类iPS细胞,其形态与小鼠胚胎干细胞相似,克隆边界清晰、呈丘状、克隆内细胞致密、核大。RT-PCR与免疫组织化学染色分析均显示牛类iPS细胞表达多能性基因。该类细胞体外诱导分化可形成类胚体EB,且表达3个胚层的基因;体内诱导分化可形成畸胎瘤,苏木精、伊红染色显示瘤体有三胚层的分化。上述结果显示利用piggyBac转座子制备牛多潜能干细胞诱导技术可行,产生的牛类iPS细胞具有潜在多能性。     

诱导多能干细胞研究进展

成熟的体细胞过表达转录激活因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc能够转化为具有多能性的干细胞,称为诱导多能干细胞。类似于胚胎干细胞,诱导多能性干细胞具有自我更新和多向分化潜能性两个主要特征。同胚胎干细胞相比,诱导多能干细胞不仅能够为以细胞替代治疗为核心的再生医学提供无限的细胞来源,而且有望解决胚胎干细胞临床开发面临的伦理道德及免疫排斥问题。从诱导多能干细胞技术的建立、重编程的机理及其在临床中的应用几方面作简要综述。     

诱导重编程的表观遗传调控研究进展

表观遗传调控是细胞命运变化与决定的重要基础之一。2006年,日本科学家山中伸弥发现通过4个转录因子Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc可以将已经分化的体细胞逆转回与胚胎干细胞相似的多能性状态,获得诱导多能干细胞(induced pluripotent stem cells,i PSCs)。这种诱导重编程技术不仅是干细胞技术的一大突破,也提供了关键的体外模型用于研究细胞重编程的表观遗传机制。对该机制的深入理解将推动人类自由操纵细胞命运的进程,从而有望治疗各种因功能细胞、组织、器官缺失退化引发的疾病。从诱导重编程的表观遗传调控方向的研究进展出发,阐述通过诱导重编程发现的关键细胞命运转变表观调控机制,展望未来的主要研究目标。     

微核糖核酸簇miR-290-295促进体细胞重编程

目的：探究干细胞中表达丰度最高的微核糖核酸簇miR-290-295对体细胞重编程的影响。方法：使用逆转录病毒载体将miR-290-295簇在小鼠体细胞中过表达,研究其促进体细胞重编程为诱导性多能干细胞(induced pluripotent stem cells, iPSCs)以及此过程对细胞功能的影响。结果：miR-290-295簇的过表达在三因子(Sox2、Klf4、Oct4)诱导体系中能够显著提高小鼠体细胞重编程的效率;过表达miR-290-295簇能够促进重编程中多能性标记基因的上调与体细胞标记基因的下调,同时也会促进间质-上皮细胞转化(mesenchymal-epithelial transition, MET)标记基因的表达。结论：miR-290-295簇对小鼠体细胞重编程具有促进作用,这有助于深入理解干细胞多能性和重编程的RNA调节机制,为开发新型诱导体系提供了新视角。     

人诱导性多潜能干细胞(iPS细胞)系的建立

掌握建立人iPS细胞系(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的技术,以便为人肿瘤细胞重编程为iPS细胞建立技术平台.在人胚胎干细胞的培养条件下,通过携带Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个混合因子的慢病毒感染人皮肤成纤维细胞(CCD-1079SK细胞),从而诱导成干细胞样的克隆.根据人胚胎干细胞的特性进行如下鉴定:克隆形态、碱性磷酸酶活性、核型和CCD-1079SK细胞来源的克隆拟胚体(embryoid bodies,EBs)形成及分化等.结果显示,在人胚胎干细胞的培养环境中,导入Oct4、Sox2、c-Myc、Klf44个因子的CCD-1079SK细胞产生了一株iPSC克隆,这株iPSC克隆在细胞形态、增殖能力、胚胎细胞特异性表面抗原以及基因表达与人胚胎干细胞相似,此外,iPSC克隆在体外悬浮培养中形成拟胚体并分化成3个胚层.人iPS细胞系的成功建立为利用iPS细胞技术开展肿瘤细胞重编程研究奠定了坚实基础.     

体细胞重编程为诱导多能干细胞的研究

通过逆转录病毒将4个基因(Oct4 、 Sox2、c-Myc和Klf4)导入小鼠胚胎成纤维细胞 (mouse embryonic fibroblast, MEF)中,能诱导形成胚胎干细胞样特性的诱导多能干(induced pluripotent stem, iPS)细胞.人类iPS细胞的成功构建开拓了广泛的应用前景.本文简要综述了 iPS细胞的基因筛选,转导基因的选择以及iPS细胞的表观遗传特性等.     

LSD1通过和Oct4/Nanog相互作用调节诱导多能干细胞的形成

将4个转录因子Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc转入成纤维细胞可以生成诱导多能干细胞(iPS细胞),转录因子和染色质修饰因子在这个过程中起重要作用。LSD1作为染色质结构的调节因子,在早期胚胎发育和ES细胞分化中发挥着关键作用。为了探索LSD1在iPS细胞产生过程中的作用,首先比较了LSD1蛋白在MEFs和ES细胞中的表达量,然后分别通过在重编程体系中过表达LSD1、加入RNAi和抑制剂的方法探索LSD1的功能,最后用免疫共沉淀的方法初步发现LSD1的作用机制。结果表明,LSD1在ES细胞中的表达量高于MEFs中,过表达LSD1对iPS细胞的形成效率没有影响,而RNAi抑制LSD1的表达和LSD1抑制剂tranylcypromine都能促进iPS细胞的形成。免疫共沉淀实验表明LSD1和Oct4/Nanog有相互作用。这些数据说明LSD1通过和Oct4/Nanog相互作用调控iPS细胞的形成。     

哈佛大学发现新的化合物和抗体使化学诱导iPS细胞成为可能

美国哈佛大学干细胞·再生生物学部的Kevin Eggan博士等从有800种生物活性的低分子库中,成功筛选出有可能代替转录因子Sox2、Klf4、Oct4的低分子化合物,这3个转录因子是构成诱导iPS细胞的山中程序的要素。Eggan博士说：“发现活性化合物的过程出乎意料的简单。”但另一方面,还不能对化学诱导iPS细胞的确立持完全乐观态度,iPS细胞的标准化是今后研究发展当务之急的课题。     

SUMO-TAT-Klf4融合蛋白的原核表达及纯化

Klf4是体细胞诱导成多能干细胞的重要转录因子之一,参与细胞增殖分化。本研究通过将小鼠Klf4基因、穿膜肽TAT以及小分子泛素样修饰蛋白SUMO融合并转入大肠杆菌Rosseta(DE3)中进行表达,经PCR鉴定和酶切验证后,用IPTG诱导后表达出约78 k D的融合蛋白,利用Ni-NTA亲和层析胶纯化获得了高质量的SUMO-TAT-Klf4蛋白,使用Western blotting检测显示特异性良好。本研究成功构建了pET3c-SUMO-TAT-Klf4原核表达载体,有利于获得大量的Klf4蛋白,并以期提高其穿透细胞膜的能力,为后续利用重编程因子融合蛋白诱导体细胞成为iPS细胞奠定基础。     

米非司酮对早孕绒毛Oct4、Sox2、Nanog 表达影响*

目的:探讨米非司酮对早孕绒毛组织Oct4、Sox2、Nanog mRNA和蛋白水平表达的影响。方法:要求终止妊娠的正常早孕妇女60例,分为:负压吸宫组及服用米非司酮150mg及米索前列醇联合行药物流产组。运用Real-time PCR方法检测两组早孕绒毛组织中Oct4、Sox2、Nanog mRNA的表达;采用免疫组织化学方法检测两组早孕绒毛组织Oct4、Sox2、Nanog蛋白的定位及半定量表达情况,比较两组差异。结果:Oct4、Nanog、Sox2 mRNA在药物流产组早孕绒毛中相对表达量明显低于负压吸宫组,差异有统计学意义(相对表达量分别为:0.15±0.045;0.37±0.053;0.23±0.040,P值均<0.05);Oct4、Nanog、Sox2在药物流产组早孕绒毛蛋白表达量亦明显低于负压吸宫组,差异有统计学意义(药物流产组蛋白表达量分别为13869±541、19251±1503、139492±918明显低于负压吸宫组22017±235、30543±729、37237±710)。结论:米非司酮可以通过抑制早孕绒毛中Oct4、Sox2、Nanog表达,发挥抗早孕作用。     

一种获得猪诱导性多能干细胞的新方法

诱导性多能干细胞技术表明,通过过表达4个重编程因子可使体细胞逆转到多能性的状态,为建立更多家畜动物的多能性干细胞系提供了新的方法,如猪、牛、羊等农业动物.莫洛尼氏鼠白血病逆转录病毒载体被广泛应用于小鼠iPS细胞的建系和机制研究上,然而这种病毒只能感染小鼠和大鼠细胞,这限制了它在其他哺乳动物iPS细胞系建立上的应用.本实验采用一种新的逆转录病毒系统,可以高效便捷地从猪成纤维细胞中获得iPS细胞.通过在GP2-293细胞中包装VSV-G蛋白包被的病毒,仅一步感染猪成纤维细胞即可转入4个人源重编程因子（Oct4,Sox2,Klf4和c-Myc）.在添加有碱性成骨因子bFGF的人类胚胎干细胞培养体系中,成功建立6株和人类胚胎干细胞形态极其相似的猪iPS细胞系.这些猪iPS克隆具有较大的细胞核/细胞质比例、边界清晰、细胞呈扁平状等特征.在体外可以分化成拟胚体,注射入免疫缺陷性小鼠体内可以形成畸胎瘤,含有3种胚层类型的组织.     

诱导性多能干细胞构建策略及其提高重编程效率的方法

以Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等转录因子于体细胞中异位表达,可获得具有胚胎干细胞特性的诱导性多能干细胞(iPSCs),但是iPSCs技术的重编程效率和应用于临床上的安全性却都很低。目前,iPSCs的研究集中于3个方面:一是增加iPSCs技术的重编程效率;二是增加iPSCs应用于临床时的安全性;三是开创新的构建iPSCs的方法。第一个方面通过调整体细胞的表观遗传特性和细胞信号网络来达到;第二个方面可通过减少致癌性因子的使用及选择合适的载体系统来达到。而且,一些小分子化合物和调节细胞信号网络的方法也被用于诱导体细胞重编程为iPSCs。相对于仅仅使用转录因子重编程体细胞为iPSCs,使用小分子化合物或调节细胞信号网络的方法重编程体细胞为iPSCs的效率更高,而且通过这种方法获得的iPSCs的有更高的临床安全性。新构建iPSCs的方式与依赖含转录因子表达载体构建iPSCs的传统模式区别较大,它们的临床安全性或(和)重编程效率也得到了极大提高。使用4个转录因子的重组蛋白或体外合成并修饰的转录因子的mRNA已经能成功构建iPSCs;而使用miRNAs高效率重编程小鼠和人的体细胞为iPSCs的方法则开创了脱离转录因子重编程体细胞的全新策略。     

microRNA在诱导体细胞重编程中的作用

microRNA是调控基因转录后水平的一类长度约为22个核苷酸的非编码小分子RNA。大量研究证实, microRNAs广泛分布于真核生物, 其在细胞的分化发育、生长代谢等各种活动中都起着重要的调节作用。诱导多能性干细胞(Induced pluripotent stem cell, iPS)是将体细胞诱导成为具有胚胎干细胞性质的多潜能干细胞。iPS过程的核心为体细胞表观遗传状态发生重编程, 因此, 探明体细胞重编程机制对建立完善的iPS技术具有重要理论和实际意义。利用病毒载体将Oct4、Sox2、Klf4和c-Myc等因子导入体细胞的方法已不断发展, 但“基因组整合”及原癌基因的参与增加了诱导细胞的致癌率。随着使用腺病毒、质粒或蛋白诱导等“非整合型”方法及L-myc的替换均可获得具有多潜能性的干细胞, 癌变的风险大大降低。但其发生的理论机制仍不十分清楚。最近的研究证实, microRNAs影响体细胞的重编程过程, 特别是miR302/367、miR200、miR-34和miR290/295等家族的microRNAs在体细胞诱导为iPS过程中发挥重要作用。文章就近年microRNA在诱导多能干细胞中的作用进行综述。     

限定因子诱导胎猪成纤维细胞重编程为多能性细胞

尝试运用限定因子融合蛋白建立猪的诱导多能性干细胞．试验采用Oct4、Sox2、Klf4、c-Myc四种限定因子经慢病毒表达载体系统介导感染猪胎儿成纤维细胞,对表达外源限定因子的猪胎儿成纤维细胞进行培养传代,逐步分离培养出集落边缘界限清晰的细胞克隆,细胞集落生长状态稳定、核型正常、碱性磷酸酶检测为阳性,免疫细胞化学检测显示,Oct4、Nanog、SSEA-1蛋白表达为阳性,体内能够分化形成含有三个胚层的畸胎瘤．结果证实分离培养的细胞克隆为猪诱导多能性干细胞,为进一步完善诱导方案和深入研究应用猪诱导多能性干细胞奠定了基础．